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Immunology and Infection

Analyse de cisaillement induite par le flux de Migration des cellules B Zone marginale murin In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

Summary

Cellules (MZBs) de la zone marginale B répondent à la force du flux de cisaillement de réorienter leur voie de migration vers le haut de la circulation. Ce protocole indique comment enregistrer et analyser la migration à l’aide d’un appareil fluidique, pompe, microscope système d’imagerie et des logiciels libres.

Abstract

Cellules de B de la zone marginale (MZBs) sont une population de cellules de B qui résident dans les zones marginales spléniques de souris qui enveloppent les follicules. Pour atteindre les follicules, MZBs doit migrer vers le haut de la force de cisaillement de la circulation sanguine. Nous présentons ici une méthode pour analyser cette migration MZB induite par le flux in vitro. Tout d’abord, les MZBs sont isolées de la rate de souris. En second lieu, MZBs sont installés sur des ligands de l’intégrine dans les diapositives de chambre de flux, exposés au flux de cisaillement et imagés sous un microscope lors de la migration. En troisième lieu, des images des MZBs de migration sont traitées à l’aide de la cellule automatique de MTrack2 suivi de plugin pour ImageJ, et les pistes de cellules qui en résultent sont quantifiés à l’aide de l’outil de chimiotactisme Ibidi. Les données de migration révèlent comment rapidement déplacent les cellules, combien de fois ils changent de direction, si le vecteur flux de cisaillement affecte leur direction de migration et les ligands de l’intégrine sont impliqués. Même si nous utilisons MZBs, la méthode peut facilement être adaptée pour l’analyse de migration des leucocytes qui répond à la force du flux de cisaillement.

Introduction

Les cellules immunitaires sont les cellules les plus mobiles dans le corps humain et doivent souvent composer avec la force de cisaillement de la circulation sanguine et lymphatique. Cependant, il y a relativement peu d’études sur les migrations induite par la force de cisaillement de leucocytes1,2,3,4,5. Nous présentons ici un protocole fiable et quantitatif pour analyser la réponse d’une cellule immunitaire au flux in vitro. Réalisation de l’essai ne requiert pas de fabrication de composants, et tous les équipements et les consommables sont disponibles dans le commerce. Le protocole, y compris l’analyse de purification et de la migration cellulaire, peut être effectué en une seule journée. Enfin, bien que nous décrivons la migration des cellules de B de la zone marginale (MZBs), le protocole peut être adapté pour analyser des migrations contre flux d’autres types de cellules immunitaires. Il est donc possible d’utiliser ce test pour analyser systématiquement un large éventail des leucocytes avec un panel exhaustif des conditions.

MZBs sont une population de cellules de B qui, chez la souris, se trouvent uniquement dans la rate et la navette entre l’intérieur des follicules et les zones marginales6,7,8,9. La zone marginale est une couche de cellules immunitaires environ 5 à 10 cellules épais. La couche de cellules enveloppe du follicule et compose principalement de MZBs et macrophages mais également les cellules T (iNKT) tueuses naturels invariants, les cellules dendritiques (CD) et neutrophiles, entre autres,10. Les cellules de la zone marginale sont exposés au flux unidirectionnel de sang provenant des artères spléniques qui se terminent par un sinus marginal entourant le follicule. Le sang coule des trous dans le sinus marginal par le biais de la zone marginale et est puis recueilli dans les sinus veineux dans la pulpe rouge et restauré à la circulation de11. La libre circulation du sang se lave au cours des MZBs et les expose aux antigènes transportés dans le sang. Les MZBs portent l’antigène dans le follicule par navette automatiquement entre la zone marginale et à l’intérieur du follicule, ce qui n’est pas exposé à du sang. Ainsi, comme MZBs navette vers le follicule, ils doivent migrer vers le haut de la force de cisaillement de l' écoulement de sang12 (Figure 1 a).

Dans ce protocole, nous décrivons comment déterminer quantitativement comment immunitaire cellules tels que MZBs répondre à aucun débit ou haut débit in vitro, afin de révéler comment ils sont programmés pour migrer in vivo. Dans un premier temps, MZBs sont purifiés de la rate de souris à l’aide de billes magnétiques couplées à l’anticorps de kits disponibles dans le commerce. Les MZBs fraîchement isolées sont introduits dans le puits d’une coulée de chambre, autorisés à s’installer sur des ligands de l’intégrine et exposées à l’écoulement du tampon de migration à l’aide d’un système de pompe (Figure 2 a). Les cellules sont imagés à l’aide d’un système de microscopie vidéo Time-lapse. Les images sont ensuite traitées pour l’analyse avec un plugin d’ImageJ gratuit,13,MTrack214, pour suivre automatiquement les cellules. Titres peuvent ensuite être quantifiés avec Ibidi chimiotactisme gratuit outil15 à déterminer différents paramètres, notamment la vitesse, de rectitude et indice de migration. Ces valeurs peuvent être utilisées pour déterminer les effets des inhibiteurs de la migration, stimulateurs de la cellule, chimiokines et autres produits chimiques d’affecte la migration sur la migration de cisaillement-flux induit afin de comprendre les forces qui contrôlent le mouvement de cellules immunitaires in vivo.

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Protocol

Toutes les expériences impliquant l’utilisation d’animaux ont été préalablement approuvés par le Landesverwaltungsamt de Halle (Saxe-Anhalt), Allemagne, conformément à toutes les directives de la faculté de médecine de l’Université OVGU de Magdebourg.

1. Purification de cellules MZB

  1. Isoler les leucocytes.
    1. Sacrifier un 8 à 16 semaines souris et enlever la rate16. Dissocier la rate dans 5 mL de tampon de cellule glacée [solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 0,5 % albumine sérique bovine sans acides gras (BSA)], en utilisant un dissociator tissu ou écraser doucement la rate au travers d’une maille de crépine cellule 70 µm dans un puits sur une plaque de 6 puits avec le piston d’une seringue de 5 mL.
    2. Transférer les cellules dans le tampon de cellules dans un tube conique de 15 mL. Prélever des cellules supplémentaires en ajoutant un autre 5 mL de tampon de cellule glacée sur le tube de dissociator de tissus ou les mailles de nylon dans le puits. Transférer les supplémentaire 5 mL de tampon de cellule plus de cellules dans le tube conique. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à température ambiante (RT, 20 ° C) et éliminer le surnageant.
  2. Effectuer la lyse des globules rouges.
    1. Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (GR) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) qui est préchauffé sur RT. Ajouter 1,5 mL de tampon de lyse RBC supplémentaire et agiter pour mélanger. Incuber à RT (20 ° C) pour un total de 2 min, y compris le temps nécessaire pour remettre en suspension l’extrait concentré.
    2. Ajouter 7,5 mL de tampon de cellule glacée à la suspension de cellules à arrêter la lyse. Centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 10 min et éliminer le surnageant.
    3. Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon de la cellule et ajouter une autre 9 mL de tampon de la cellule. Pipetter la suspension cellulaire de 10 mL à travers un filtre avant la séparation de 30 µm dans un nouveau tube conique 15 mL pour éliminer les débris cellulaires.
    4. Centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 10 min, les cellules et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon de la cellule. Garder les cellules froid à toutes les étapes de la procédure jusqu’en incubation dans les diapositives de chambre de flux.
  3. Purifier le MZBs.
    1. Ajouter 50 µL d’anticorps couplé à la biotine d’un kit disponible dans le commerce contre toutes les cellules indésirables, y compris CD43 (sur les cellules non-B), CD4 (sur les lymphocytes T), CD93 (sur les cellules B immatures) et Ter119 (sur les érythrocytes), à la suspension de cellules dans un tube à fond conique. Secouer ou de balayer le tube doucement pour mélanger, mais ne pas vortexer les cellules. Poser le tube à fond conique sur un lit de glace à un angle presque plat et rock à 25 tr/min pendant 15 min.
    2. Ajouter des billes magnétiques couplées à l’anticorps anti-biotine dans un volume total de 100 µL de la suspension cellulaire. Continuer au rock à la suspension de cellules à 25 tr/min sur la glace pendant 20 min. laver les cellules en ajoutant 5 mL de tampon de cellule, centrifugation à 300 x g et 4 ° C pendant 10 min et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon de la cellule.
    3. Appauvrissent la suspension cellulaire des cellules magnétiques-perle-couplé en les retenant sur une colonne magnétique. Défausse étiqueté de cellules (cellules non B et les cellules B immatures). Recueillir les cellules non marqué (les cellules B matures) dans un tube conique 15 mL qui ont été recouverts d’une demande de bref de 5 mL de tampon de la cellule, afin d’empêcher l’adhérence non spécifique par MZBs.
    4. Laver la suspension cellulaire avec 5 mL de tampon de la cellule. Centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 10 min et éliminer le surnageant. Remettre en suspension dans 90 µL de tampon de la cellule, les cellules et ajouter 10 µL de perles anti-CD23-couplé. Suspension cellulaire de roche doucement sur la glace pendant 20 min à 25 tr/min.
    5. Laver la suspension cellulaire avec 5 mL de tampon de la cellule. Centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 10 min et éliminer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon de la cellule.
    6. Appauvrissent la suspension cellulaire des cellules magnétiques-perle-couplé en les retenant sur une colonne magnétique. Jeter les cellules marquées (cellules B folliculaires). Recueillir les cellules non marqué (MZBs), dans un tube conique 15 mL qui a été préalablement revêtu d’une application brève de 5 mL de tampon de la cellule. Enlever 50 µL de cellules de comptage et de contrôle de pureté.
  4. Détachant les MZBs triés pour vérifier la pureté.
    1. Ajouter 10 % du volume (5 µL) du bloc Fc à 10 000 cellules dans 50 µL et incuber à 4 ° C pendant 5 min. Ajouter 50 µL de tampon de cellule contenant 0,3 µL de chaque de B220-FITC (0,15 µg), CD21-PE (0,06 µg) et CD23-APC (0,06 µg) dans un volume total de 105 µL (chaque anticorps dilué 1:350) , ou toute autre combinaison de fluorophores permettant de distinguer les cellules B folliculaires et tache MZBs. les cellules à 4 ° C dans l’obscurité pendant 15 min.
    2. Laver les cellules colorées une fois avec 1 mL de tampon de la cellule. Centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre dans 300 µL de tampon de cellule et d’acquérir des échantillons à l’aide d’un cytomètre de flux et de méthodes standard. Porte sur les lymphocytes live, puis sur B220+ de cellules et enfin sur CD23faible CD21élevé de cellules (Figure 1 b).
      Remarque : La procédure entraîne généralement de 500 000 MZBs par la rate de souris C57B/6.
  5. Préparer la MZBs migration de flux.
    1. Lavage purifiée MZBs une fois dans 1 à 2 mL de tampon de migration froid [Hanks balanced cations contenant la solution saline (HBSS), 10 mM Hepes, 0,2 % sans acides gras BSA] pour s’assurer que le tampon de migration cationique contenant n’est pas dilué par résiduelle tampon PBS exempte de cation. Centrifuger à 300 x g et 4 ° C pendant 10 min et éliminer le surnageant. Remettre en suspension MZBs dans le tampon de migration à froid à une concentration de 50 000 MZBs par 30 µL (équivalent au montant chargé dans un puits d’une coulée de chambre).
      Remarque : Les MZBs fraîchement isolées doivent être utilisés dès que possible. Cependant, ils sont encore capables de migration pour jusqu'à 8 heures ou plus après le début de l’expérience pour tant qu’ils sont gardés sur la glace. Les températures optimales doivent être testés pour les autres types de cellules. Par exemple, il peut être préférable de garder les cellules T cultivées à 37 ° C jusqu’au début de la migration.

2. flux Experiment

  1. Manteau diapositives avec integrin ligands.
    1. Le jour avant l’expérience, décongeler une partie aliquote de l’ICAM-1 (400 µg/mL). Diluer ICAM-1 par un facteur de 1 : 80 dans du PBS pour atteindre une concentration finale de 5 µg/mL. Ajouter 30 µL de l’ICAM-1 pour une chambre sur une lame de flux pour chaque film de migration nécessaire. Incubez diapositive dans une chambre humide à 4 ° C durant la nuit.
      Remarque : Chaque diapositive contient 6 chambres et jusqu'à 8 films en une seule session peut être facilement enregistré.
  2. Bloquer la microplaque.
    1. Le jour de l’expérience, laver la chambre en ajoutant 100 µL de PBS dans un puits et en retirant 100 µL d’autre puits de la chambre. Ajouter 100 µL de tampon de blocage (2 % sans acides gras BSA dans du PBS) à une chambre et incuber la lame dans une chambre humide à RT pendant 1,5 h.
    2. Laver la chambre en ajoutant 100 µL de PBS dans un puits, la retirer de l’autre bien, puis ajouter 100 µL de tampon de migration vers la chambre. Stocker les lames dans une chambre humide à la droite jusqu'à ce que l’expérience.
  3. Préparer l’appareil fluidique.
    1. Brancher une pompe, fixez l’unité fluidique et activer le logiciel de la pompe. Laver le tube une fois avec 5 à 10 mL de tampon de migration, puis ajouter 11,7 mL de tampon de migration également à deux réservoirs et enlever les bulles d’air.
    2. Clamper la tubulure environ 10 cm de la pièce de raccord. Placer le filtre fluidique dans la chambre d’incubation chauffée sur le microscope.
    3. Définir le choix de la diapositive pour « µ-slide VI 0,4 » et le tube de « blanc » dans le logiciel. Définir la contrainte de cisaillement souhaitée (par exemple, le de cm de dyn 4-2). Régler l’heure de l’imagerie à 30 min.
    4. Régler le facteur d’étalonnage de tubes en déterminant le débit par l’intermédiaire de la tubulure en mL/min mesure le temps requis pour 2 mL du tampon s’écouler d’un réservoir de l’autre et de diviser par 2. Faire au moins 4 mesures pour précision. Le débit réel permet de définir le débit souhaité et la contrainte de cisaillement en saisissant les valeurs dans le logiciel de la pompe.
  4. Préparer le système d’imagerie.
    1. Réchauffez la chambre d’incubation microscope, unité fluidique et aliquotes de tampon de migration à 37 ° C (Figure 2 b). Test de la pompe fluidique en veillant à ce que le tampon de migration se jette en arrière dans les réservoirs et qu’il n’y a pas d’air des bulles dans le système.
  5. Charger les cellules sur la diapositive.
    1. Nettoyer le fond de la diapositive avec un tissu trempé dans de l’éthanol. Ajouter 30 µL de la suspension cellulaire dans un puits de la chambre et retirer 30 µL d’autre puits. Incuber la lame avec une couverture sur pour éviter une évaporation à 37 ° C pendant 30 min permettre les cellules à attacher.
    2. Lentement, ajouter le tampon de migration pré chauffé dans chaque loge de la coulée de chambre jusqu'à ce qu’un ménisque positif s’élève hors du puits et éliminez les bulles d’air avec l’embout de la pipette.
  6. Fixez la lame à l’unité fluidique.
    1. Fixez la lame à la platine du microscope. Retirez le côté non marqué du tube fluidique de la pièce de raccord et remplir la fin avec tampon de migration jusqu'à ce qu’un ménisque positif sans bulles d’air s’élève par l’extrémité.
    2. Retourner l’extrémité du tuyau au cours et l’insérer dans le puits supérieur de la chambre de flux, tampon renversé avec un tissu de nettoyage. Tout en gardant le tuyau bridé, répétez la procédure pour l’extrémité marquée de la tubulure.
  7. Les cellules de l’image.
    1. Placez-vous dans le système d’imagerie « Live » de définir le focus sur les cellules. Sélectionnez un champ de vision qui est au milieu de la diapositive. La mise au point les cellules légèrement pour améliorer le contour noir de la cellule et de produire un intérieur blanc, qui peut ensuite être seuillée à une forme de cellules rondes de noir sur fond blanc pour une utilisation avec un programme de suivi automatisé.
    2. Démarrer le programme d’imagerie de la séquence et fiche 1 image toutes les 5 s pendant 30 min à l’aide de la 10 x objectif sec. Retirez la pince de la tubulure et allumer la pompe, puis les cellules non adhérentes seront lavent et cellules adhérentes commencent à migrer. Image pour 30 min ou plus en utilisant un 10 x objectif ou plus, comme vous le souhaitez. Étiqueter et enregistrer le film.
  8. Détacher l’unité fluidique de la diapositive.
    1. À la fin du programme d’imagerie, réarmer la pompe pour l’expérience suivante : ré-attacher la pince au tuyau, retirez la tubulure de la diapositive, re-fixer la pièce de raccord, ouvrir la pince et utiliser la commande manuelle de la pompe à repousser plusieurs mL de tampon d’une réserv oir à l’autre pour enlever les bulles d’air. Ré-attacher la pince et poser la tuyauterie fixée sur la platine du microscope pour le prochain film.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu indéfiniment ici. Si vous utilisez un inhibiteur ou un modificateur de la migration cellulaire, selon son mode d’action, ajoutez-le à la suspension de cellules avant de s’installer dans la chambre de la migration ou le tampon de migration dans l’unité fluidique.

3. migration analyse de morceaux

Remarque : Les cellules peuvent être suivies automatiquement en utilisant le plugin MTrack2 ou à la main avec le plugin de suivi manuel17. Automatique fonctionne bien avec MZBs parce que ces cellules sont principalement ronds et demeurent ainsi lors de la migration, ce qui facilite la seuil l’image des cellules à des objets noirs sur fond blanc. Suivi automatique est plus difficile si les autres types de cellules sont utilisées, telles que cultivées, activé des cellules T CD8 +, parce que ces cellules s’étirer pendant la migration et devient un peu transparents, rendant difficile de définir les bords. Dans ce cas, soit (1) les cellules peuvent être colorés avec un colorant fluorescent intra-vital pour produire des images qui peuvent être seuillées pour montrer les objets noirs sur fond blanc, ou (2) les autres programmes d’esquisser les cellules comme image segmentation ou bord de détection peut être utilisé. Repérage manuel est une option utile lorsque vous générez une image fort contraste des contours de la cellule n’est pas possible.

  1. Effectuer un suivi manuel en utilisant le plugin.
    1. Installer le plugin « Tracking manuel » dans ImageJ et ouvrez le film dans ImageJ. Sous le menu « Manuel Tracking », sélectionnez « Ajouter un nouveau titre ». Cliquez sur le centre d’une cellule que les avances de film image par image automatiquement. Lorsque la cellule a été sélectionnée dans chaque image, sélectionnez « Ajouter nouvelle piste » pour commencer à suivre une nouvelle cellule.
    2. Une fois les morceaux ont été enregistrés, copiez les résultats de sortie dans un tableur de données. Changer le format décimal affichées pour toutes les cellules de la feuille de calcul à zéro places après la virgule. Enregistrez le fichier sous un fichier .txt de « tab stop séparées » pour une analyse ultérieure.
      Remarque : En règle générale, 50 à 100 cellules sont suivis, ce qui prend environ 1 h pour un film de 20 min d’environ 240 images.
  2. Effectuer le suivi automatique en utilisant le plugin MTrack2. Téléchargez et installez le plugin de kt MTrack2 conformément aux instructions dans le fichier (voir dossier du codage supplémentaire).
    1. Seuil les images du film de migration cellulaire. Ouvrez la pile image ImageJ. Processus les images dans ImageJ pour convertir la vidéo de couleur à contraste élevé des images montrant les cellules en tant qu’objets noirs sur fond blanc (Figure 3 a).
      1. Aiguiser les images deux fois, nettoyer les images et convertit les images en 8 bits. Sélectionnez le « Image | put et sous-menu régler la luminosité/contraste » le curseur contraste à contraste maximum, puis les cellules apparaîtront comme des objets blancs sur fond noir. Sélectionnez le « Image | Ajustez le seuil » sous-menu pour s’assurer que les cellules apparaissent comme des objets noirs sur fond blanc.
    2. Exécutez la cellule automatique plugin « MTrack2 kt » de suivi (voir Fiche de codage supplémentaire). Définissez les paramètres suivants sur l’écran des options.
      1. Configurer la granulométrie minimum à 1 pixel et granulométrie maximale à 30 pixels de MZBs.
      2. Pour la vitesse (distance maximale entre 2 particules sur des images successives du film), si la densité des cellules sur la diapositive est élevée, définissez cette valeur basse afin d’éviter que la piste « sauter » d’une cellule à l’autre. Pour MZBs, définissez cette valeur à 10 pixels pour capturer des valeurs aberrantes, bien que MZBs ne dépasse généralement pas 2 pixels sur des images successives qui sont 5 s apart.
      3. Pour le nombre minimal d’images qu’une particule doit être présent pour être suivis, définissez cette valeur sur le nombre d’images dans le film de MZBs (p. ex., 240) pour un film de 20 min avec 12 images/min. Toutefois, si les cellules sont assez rapides pour quitter le champ de vision avant la fin de l’imagerie, puis définit le nombre minimal d’images à moins que la durée du film. Par exemple, avec l’évolution rapide des lymphocytes T, définit le nombre minimal à l’équivalent de 5 à 10 min de l’imagerie.
        Remarque : Enregistrer une macro de ces étapes (seuillage et MTrack2-kt) pour automatiser cette partie de la procédure et de gagner du temps (voir Fiche de codage supplémentaire). À l’aide de la macro pour suivre automatiquement un film dans ImageJ prend moins d’une minute.
    3. Copier les résultats de sortie dans une feuille de calcul de données. Changer le format décimal affichées pour toutes les cellules de la feuille de calcul à zéro places après la virgule. Ajouter une ligne vide en haut des pistes cellule dans la feuille de calcul et de supprimer la colonne « D ». Enregistrez le fichier sous un fichier .txt de « tab stop séparées » pour une analyse ultérieure dans l’outil Ibidi chimiotactisme.
      Remarque : Le plugin MTrack2 sorties les pistes de cellule dans les rangées de colonnes parallèles 75. Pour l’analyse dans l’outil de chimiotactisme Ibidi, les pistes de la cellule doivent être dans une seule colonne. Pour convertir la sortie, le plugin de MTrack2 a été modifié à la sortie soit dans le format d’origine ou comme une seule colonne (Figure 3 b) (voir Fichier de codage supplémentaires « MTrack2 kt », ce qui est écrit en Java). Copiez le fichier .java dans le dossier de plugins ImageJ. Dans ImageJ, sélectionnez « Plugins > compiler and Run ». ImageJ de redémarrage et la version modifiée de MTrack2 doivent apparaître dans le menu Plugins.
  3. Pour analyser les titres de cellule avec l’outil Ibidi Chemotaxis, télécharger la chimiotaxie Ibidi et l’outil de Migration v2.0 (« stand alone ») et ouvrez le programme.
    1. Sélectionnez « Importer des données » et accédez à des fichiers .txt de voie cellulaire. Plusieurs fichiers peuvent être sélectionnés en même temps. Les fichiers importés apparaissent dans le volet « Ensembles » en rouge. Sélectionnez tous les et entrez les valeurs correctes dans le menu « Initialisation » ci-dessous pour appliquer les paramètres suivants.
    2. Entrez le nombre exact ou un éventail du nombre de tranches (le nombre d’images dans le film).
    3. Dans le menu de Calibration (X / Y étalonnage), entrez la taille d’un pixel. Localisez ces informations dans le fichier de propriétés du film. Pour MZBs, a été utilisé un objectif 10 x, ce qui donne une taille de pixel de 1,14 µm. Dans « menu de Calibration | Intervalle de temps », entrez la durée de temps entre les images dans le film.
    4. Appliquer les paramètres. Sélectionnez « Tracer des données » pour voir les terrains de la piste et confirmer que les fichiers de piste ouvrira. De ce point, beaucoup d’options est disponibles qui sont décrits dans la documentation du programme, y compris le marquage les pistes avec différentes couleurs basées sur des propriétés différentes et en affichant les valeurs individuelles ou moyennes vitesse, avant migration index, franchise et plus (Figure 3 b).
      Remarque : Les MZBs prennent environ 10 min à détecter et à réagir à l’écoulement, sans doute en polarisant leurs complexes de l’intégrine jusqu’au point d’écoulement en avant de la cellule. Un graphe de l’indice de migration au fil du temps va montrer une baisse initiale inférieure à zéro, correspondant pour le premier couple de minutes que la cellule est exposée à l’écoulement, suivie d’une montée progressive vers le haut jusqu'à ce que les valeurs d’index de migration vers l’avant sont positifs. Ainsi, il peut être optimale d’exclure ces premières minutes dans le calcul final, à moins que ce processus est intéressant.

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Representative Results

Nous avons utilisé le protocole décrit ci-dessus pour comparer la migration des MZBs sur des lames ICAM-1-enduit sans écoulement (0 dyn/cm2) et exposés pour déformer les flux (4 dynes/cm2). Les cellules ont été suivies automatiquement avec MTrack2 et la piste qui en résulte des fichiers ont été superposées sur les films de migration cellulaire sans écoulement (0 dyn/cm2) et (4 dynes/cm2) pour montrer la répartition et la forme de la voie ferrée (Figure 4 a). Les titres de cellule ont été ensuite importés dans l’outil Ibidi chimiotactisme (TIC) pour générer des parcelles de la voie de la séquence (Figure 4 b). L’indice moyen de migration (appelé « FMIy » dans le TIC), vitesse, rectitude (appelé « direct » dans le TIC) et distance en ligne droite (appelé « Distance euclidienne » dans le TIC) des pistes de la cellule de 4 films chacun pour les deux conditions ont été calculés en la Outil de la chimiotaxie en utilisant la commande « valeurs mesurées ». Ces valeurs moyennes ont été ensuite copiés dans GraphPad Prism de générant des graphiques et de calcul de signification statistique (Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : la navette MZB. (A) modèle de MZB faisant la navette entre la zone marginale et le follicule dans la rate. MZBs besoin d’internalisation des S1PR1, un récepteur de la S1P et CXCR5 fonctionnel, un récepteur de la chimiokine CXCL13, afin d’entrer dans le follicule. En outre, pour atteindre le follicule, MZBs devez migrer contre la force du débit sanguin émanant des pores dans le sinus marginal qui enveloppe le follicule. Si un MZB perd l’adhérence à l’ICAM-1, le ligand pour l’intégrine LFA-1, il est poussé dans la pulpe rouge de la force du débit, où les quantités accrues de VCAM-1, le ligand pour VLA-4, ne soutiennent pas de migration. (B) écoulement cytometry gating stratégie pour tester la pureté de tri MZBs utilisant des anticorps contre B220, CD23 et CD21. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : configuration de la chambre d’incubation, microscope, système et pompe fluidique. (A) Image de l’installation de la pompe (Ibidi18) composé d’une pompe avec appareil connecté fluidique et portable exécutant le logiciel pour contrôler la pompe. Image de grossissement plus élevé : le glissement chambre avec 6 chambres de débit, dont le premier est fixé au tuyau de l’unité fluidique. Installation par défaut (B) pour mesurer la migration in vitro de MZBs contre le flux. Un microscope équipé d’une chambre de combustion (boîte noire) contenant l’unité fluidique reliée à une pompe (objet carré bleu dans l’angle inférieur droit du microscope) en dehors du microscope. Image de grossissement plus élevé : l’unité de fluidique dans le microscope chambre de chauffage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Quantification de données d’imagerie. (A) les images représentatives d’une image d’un film de migration MZBs avant (à gauche) et après (à droite) seuillage de l’image à convertir les cellules en objets noirs sur fond blanc. Échelle des bars dans les deux images de grossissement faible et élevée = 100 µm. (B) panneau gauche : image de la production de résultats typiques du plugin MTrack2 (sortie de colonne unique). Panneau de droite : image de l’outil Ibidi chimiotactisme et Migration 2.0 après l’entrée des MTrack2 résultats montrant une parcelle de voie de migration MZBs et un « valeurs mesurées » vitrine montrant les moyennes des paramètres, y compris la franchise (vitesse et indice de migration vert de boîtes), entre autres. Paramètres de calibration affichés incluent la résolution en pixels de 1,14 µm par pixel et un intervalle de temps de 5 s (0,083 min) par séquence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : exemple de résultats en utilisant le protocole pour mesurer la navette MZB. (A) représentant des images fixes de migration MZBs avec une superposition de pistes du plugin ImageJ « MTrack2 kt ». Remarque : les couleurs de piste ont été arbitrairement fixés par le plugin « Manuel Tracking » pour ImageJ. Échelle des barres dans les deux encarts de grossissement faible et élevée = 100 µm. (B) voie représentant emplacements liés à la migration MZBs de l’outil Ibidi chimiotactisme et Migration 2.0. Lignes rouges et les lignes noires représentent les titres de cellule qui se termine au-dessous ou au-dessus de l’axe horizontal, respectivement. En (A) et (B) : à gauche, MZBs migration avec aucun flux (0 dyn/cm2) ; droit, MZBs migration vers un débit de2 4 dynes/cm. (C) index (FMIy), la vitesse, droiture (droiture) et distance pour MZBs migration sans aucune Migration flow (0 dyn/cm2) ou processus (4 dynes/cm2) (n = 4 souris dans 4 expériences distinctes). Barres d’erreur = moyenne ± écart type ; Test t de Student, ** p < 0,01, *** p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : MTrack2_kt.java. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.  

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Discussion

Nous décrivons ici une méthode pour l’analyse de la migration des cellules qui détectent la force du flux de cisaillement et répondre en altérant leur migration. Une analyse de MZBs a montré que les MZBs migrer spontanément sur ICAM-1 et en présence de débit, va migrer vers le haut de la circulation. Dans nos travaux précédents, nous avons montré que MZBs ne migrent pas vers le haut le flux sur VCAM-1, mais au contraire restent fixes en place. La zone marginale splénique murine contient principalement ICAM-1, tandis que la pulpe rouge contient les ICAM-1 et VCAM-1. Ces données, on pourrait déduire que MZBs migreraient vers le haut de la circulation tandis que dans la zone marginale mais pas dans la pulpe rouge. L’analyse a été validée in vivo chez le MZBs d’une adhérence défectueux qui ont mal à la pulpe splénique rouge par la force de l' écoulement12. Pour ces raisons, les MZBs représentent un bon contrôle positif pour l’essai du système de migration des flux décrit ici, même si le système est utilisé pour étudier un type de cellule différente.

L’aspect le plus important de la procédure est d’assurer cohérence dans la cellule de manutention sur la diapositive. Parce que les aspects quantifiables de la migration cellulaire dépendent du degré auquel les cellules adhèrent à la diapositive, toute diminution de l’adhérence cellulaire serait difficile des résultats reproductibles. Une diminution d’adhésion cellulaire pourrait résulter de l’incohérence de multiples facteurs, y compris les températures de la mémoire tampon de migration ou la zone chauffée d’incubation (le froid réduit adhérence), niveaux de cations dans la suspension cellulaire (cations affectent l’intégrine liaison), Glissez la manipulation (taraudage ou de flexion de la lame pourrait déloger les cellules) et la densité des cellules (collisions entre cellules pourraient modifier les paramètres de migration). Autres points sensibles au cours de la procédure sont pipetage ne pas la mémoire tampon dans les puits de diapositive avec trop de force avant d’y attacher le tube (car cela pourrait réduire adhésion cellulaire) et de garder le temps nécessaire pour les étapes du protocole cohérentes dans chaque expérience ( rodage de la cellule pourrait nuire à l’adhérence). En résumé, toute influence sur l’adhérence de la cellule doit rester cohérente tout au long des répétitions pour produire des données sur la migration cellulaire fiables.

Cette méthode est facile à mettre en place car il utilise des équipements disponibles dans le commerce fournitures et aucune des étapes nécessitent une instruction avancée. Pour l’analyse de MZB, ainsi que d’autres types de cellules, telles que cultivées CD8+ T les cellules, les diapositives avec différents ligands de l’intégrine de revêtement sont suffisantes pour observer la migration vers le haut de la circulation. Étudier la réponse induite par le flux de migration de divers ligands de l’intégrine conduit à l’identification directe des intégrines actives sur la surface de la cellule, éventuellement révéler des mécanismes pertinents aux fonctions in vivo comme avec migration MZB jusqu'à l’écoulement sur l’ICAM-1 mais pas VCAM-1. Toutefois, il est également possible d’ajouter une couche de cellules endothéliales dans les chambres de l’écoulement. Extravasation de cellules T à couches endothéliales3en est un exemple de la migration des cellules immunitaires qui est affecté par un écoulement cisaillé. Cette procédure a été utilisée pour démêler l’activation de chimiokines, sélectines et adhérence via intégrines de lymphocytes T et à la migration des lymphocytes modèle à travers la barrière hémato - encéphalique. La seule limitation dans les cellules qui peuvent être analysées avec cette méthode, c’est qu’ils doivent être capables de sentir la force du débit comme un signal directionnel.

Bien que la méthode décrite ici est utilisée pour caractériser le comportement cellulaire telles que vitesse et rotation, il peut être étendu à l’analyse des aspects moléculaires de la migration. Des complexes moléculaires pertinentes à la migration induite par le flux, y compris les intégrines telles que LFA-1 et leurs adaptateurs du cytosquelette, serait situés dans 200 nM de la surface de la lame, se prête à la visualisation au microscope TIRF. Cet ajout à la méthode serait idéal pour l’étude des cellules de souris présentant des mutations dans les protéines liées à l’intégrine ou cytosquelette. Comme beaucoup de cellules immunitaires migrent à divers stades de leur développement par les flux de sang ou la lymphe, la migration in vitro décrite peut être utilisée pour tester systématiquement toutes sortes de leucocytes cultivés ou primaires pour réponse à couler et révèlent la façon dont les cellules sont programmé pour migrer dans une réponse immunitaire in vivo. En conclusion, l’essai décrit ici fournit une méthode simple et fiable pour l’analyse de migration induite par le flux de MZBs qui peut être étendu à d’autres types de cellules.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de la « Deutsche Forschungsgemeinschaft » SFB 854/TP11 à K.-D.F.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

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References

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  18. ibidi. ibidi Pump System. , Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. (2018).

Tags

Immunologie et Infection numéro 141 cellules de B zone marginale migration flux de cisaillement les intégrines adhérence adhésion intercellulaire molécule-1 (ICAM-1) vascular cell molécule d’adhésion-1 (VCAM-1)
Analyse de cisaillement induite par le flux de Migration des cellules B Zone marginale murin In Vitro
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Tedford, K., Tech, L., Steiner, M.,… More

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. D. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

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