Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

Summary

אזור שוליים B תאים (MZBs) להגיב בכוח גזירה זרימה על ידי מחדש המכוונת את נתיב הנדידה שלהם כן. פרוטוקול זה מראה כיצד לתעד ולנתח את ההעברה באמצעות יחידת פלואידיקה, משאבה, מערכת הדמיה במיקרוסקופ, תוכנה חופשית.

Abstract

אזור שוליים B תאים (MZBs) הם אוכלוסיה של תאי B השוכנים באזורי העכבר הטחול שולית אופפים זקיקים. כדי להגיע הזקיקים, MZBs עליך להעביר את הכוח הטיה של זרימת הדם. אנו מציגים כאן שיטה לניתוח תזרים-induced MZB העברה זו במבחנה. ראשית, MZBs מבודדים מן הטחול העכבר. שנית, MZBs התיישבו על ליגנדים אינטגרין בשקופיות קאמרית זרימה, חשוף להטיית זרימה, עם תמונה תחת מיקרוסקופ בעת העברת. שלישית, תמונות של MZBs העברת מעובדים שימוש בתא MTrack2 אוטומטי מעקב תוסף עבור ImageJ, הרצועות תא וכתוצאה מכך הם לכמת באמצעות הכלי כימוטקסיס Ibidi. העברת הנתונים לחשוף כמה מהר להעביר התאים, באיזו תדירות הם משנים כיוון, אם הווקטור זרימה ' הטיה ' משפיעה על כיוון ההגירה שלהם, ליגנדים אינטגרין אשר מעורבים. אמנם אנו משתמשים MZBs, שיטת בקלות ניתן להתאים לניתוח העברה של כל ליקוציט המגיבה לכוח של זרימה הטיה.

Introduction

תאים חיסוניים תאי תאי ביותר בגוף האדם, לעיתים קרובות חייב להתמודד עם כוח ההטיה של זרימת הדם והלימפה. עם זאת, ישנם מחקרים מעטים יחסית על הגירה הנוצרות על-ידי כוח ההטיה של לויקוציטים1,2,3,4,5. אנו מציגים כאן פרוטוקול אמין ולא כמותיים כדי לנתח את התגובה של תא החיסון לזרימה במבחנה. ביצוע וזמינותו אינו דורש ייצור של רכיבים, כל הציוד והחומרים המתכלים הם זמינים מסחרית. הפרוטוקול, כולל ניתוח טיהור והעברה של התא, יכול להתבצע ביום אחד. בסופו של דבר, למרות שאנחנו מתארים את ההעברה של אזור שוליים B תאים (MZBs), הפרוטוקול ניתן להתאים לנתח את ההעברה נגד זרימה של סוגים אחרים של תאים חיסוניים. לכן, זה ריאלי לשימוש הזה assay לנתח באופן שיטתי מגוון רחב של לויקוציטים עם פאנל מקיף של תנאים.

MZBs הם אוכלוסייה של תאי B המצויים, העכבר, רק הטחול ואת הסעות בין הפנים של זקיקים8,97,6,אזורי שוליים. אזור שולית היא שכבה של תאים חיסוניים כ 5-10 תאים עבים. השכבה תא עוטפת הזקיק, מורכב בעיקר MZBs, המקרופאגים אבל גם הטבעית הקבועה הרוצח בתאי T (iNKT), תאים דנדריטים (Dc), נויטרופילים, בין היתר10. התאים באזור שוליים חשופים זרימת הדם חד כיווני שמקורם עורקים הטחול לסיים בסינוס שוליים סביב הזקיק. הדם זורם חורים הסינוס שולי דרך אזור שולית היא שליקט סינוסים ורידים בכשלקוח אדום ואז לשחזר את מחזור11. זרימה חופשית של דם שוטף MZBs, וחושפת אותם בפני אנטיגנים נישא בדם. MZBs נושא אנטיגן לתוך הזקיק על ידי הליכה הלוך ושוב באופן אוטומטי בין אזור שולי בתוך הזקיק, אשר אינה נחשפת דם. לפיכך, כמו הסעות MZBs כלפי הזקיק, הם עליך להעביר הכוח הטיה של זרימת דם12 (איור 1 א').

פרוטוקול זה, אנו נתאר כיצד באופן כמותי לקבוע איך החיסון תאים כגון MZBs להגיב אין זרימה או זרימה גבוהה במבחנה, כדי לגלות איך הם מתוכנתים להעביר בתוך vivo. בשלב הראשון, MZBs כבר טהור מן הטחול העכבר באמצעות beads מגנטי מצמידים נוגדנים של ערכות זמינים מסחרית. MZBs טרי מבודד הציג לתוך הבאר של שקופית קאמרית זרימה, מותר להתיישב על ליגנדים אינטגרין, חשוף לזרימה של מאגר העברה באמצעות מערכת משאבת (איור 2 א). התאים הם צילמו באמצעות מערכת מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות. התמונות מעובדות ואז לניתוח עם תוסף ImageJ חינם, MTrack213,14, לעקוב באופן אוטומטי את התאים. רצועות ואז שניתן לכמתו חינם Ibidi כימוטקסיס כלי15 כדי לקבוע פרמטרים שונים כולל מהירות, יושר אינדקס ההעברה. ערכים אלה יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של מעכבי ההעברה, תכשירים תא, נוגדנים וכימיקלים אחרים שמשפיעים על ההעברה על ההעברה הטיה זרימה המושרה על מנת להבין את כוחות שליטה תא החיסון תנועה ויוו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים הכרוכות של בעלי חיים בעבר אושרו על-ידי Landesverwaltungsamt האלי (סקסוניה-אנהלט), גרמניה, לפי כל ההנחיות של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת OVGU של מגדבורג.

1. MZB תא טיהור

  1. לבודד לויקוציטים.
    1. הקרבה של 8-16 בת שבוע העכבר ולהסיר את הטחול16. מביצועם הטחול ב 5 מ של מאגר תא קר כקרח [באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) + 0.5% אלבומין ללא חומצת שומן שור (BSA)], או באמצעות dissociator של רקמות או בעדינות רסוק הטחול באמצעות מיקרומטר 70 תא מסננת רשת לבאר על צלחת 6-ובכן עם הבוכנה של מזרק 5 מ.
    2. העבר את התאים במאגר תא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. איסוף תאים נוספים על-ידי הוספת עוד 5 מ"ל תא קר כקרח מאגר ברכבת התחתית dissociator רקמות או את רשת ניילון בתוך הבאר. העברה mL 5 נוספים של מאגר תא פלוס תאים הצינור חרוט. צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT, 20 ° C) וזורקים את תגובת שיקוע.
  2. לבצע פירוק תאי הדם האדומים.
    1. מחדש להשעות בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר פירוק תאי הדם האדומים (RBC) (150 מ מ NH4קלרנית, KHCO 10 מ מ3, 0.1 מ מ EDTA) כי היא מראש ומחוממת להוספה RT. mL 1.5 נוספים של RBC פירוק מאגר ו מערבולת לערבב. דגירה-RT (20 ° C) עבור סכום כולל של 2 דקות, כולל את הזמן הנדרש כדי מחדש להשעות את גלולה.
    2. להוסיף 7.5 mL תא קר כקרח מאגר התליה תא כדי לעצור את פירוק. צנטריפוגה 300 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
    3. מחדש להשעות בגדר תא ב 1 מ"ל תא המאגר ולהוסיף אוטם 9 נוספים תא המאגר. Pipette התליה תא 10 מ"ל דרך מסנן הכנה להפרדות צבע 30 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 15 mL החדש כדי להסיר שאריות תאים.
    4. צנטריפוגה תאים 300 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. מחדש להשעות בגדר תא ב- 500 µL תא המאגר. לשמור תאים קר בכלל והשלבים של ההליך עד הדגירה בשקופיות קאמרית זרימה.
  3. לטהר MZBs.
    1. להוסיף 50 µL של נוגדנים מצמידים ביוטין ערכה זמינים מסחרית כנגד כל התאים לא רצויות, כולל CD43 (על תאי-B), CD4 (על תאי T), CD93 (על ילדותי ב תאים) ו- Ter119 (על אריתרוציטים), התליה תא צינור חרוטי. לנער או לסתור את הצינור בעדינות כדי לערבב, אבל לא מערבולת התאים. להניח את הצינור חרוט על מצע קרח בזווית כמעט שטוח ורוק -25 סל ד למשך 15 דקות.
    2. הוסף beads מגנטי מצמידים נוגדני אנטי ביוטין הנפח הכולל של µL 100 כדי התליה תא. ממשיכים לחגוג התליה תא ב rpm 25 על קרח במשך 20 דקות לשטוף את התאים על ידי הוספת 5 mL מאגר תא, צריך שתוציאו ב 300 x גרם ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ומחיקת את תגובת שיקוע. להשעות מחדש תאים 1 מ"ל תא המאגר.
    3. לרוקן את המתלים התא של תאי מגנטי חרוז-מצמידים על ידי שמירה על אותם על עמודה מגנטי. ביטול תווית תאים (כל תאי-B, לא בוגר B תאים). לאסוף ללא התווית על-ידי התאים (בוגר ב תאים) צינור חרוטי 15 מ"ל שהיה מצופה מראש עם יישום קצרה של 5 מ ל מאגר תא, על מנת למנוע הידבקות שאינם ספציפיים על-ידי MZBs.
    4. רחץ התליה תא 5 מ ל תא המאגר. צנטריפוגה 300 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. להשעות מחדש תאים µL 90 תא המאגר ולהוסיף 10 µL של אנטי-CD23-בשילוב חרוזים. רוק תא ההשעיה בעדינות על קרח למשך 20 דקות ב 25 סל ד.
    5. רחץ התליה תא 5 מ ל תא המאגר. צנטריפוגה 300 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. להשעות מחדש תאים 1 מ"ל תא המאגר.
    6. לרוקן את המתלים התא של תאי מגנטי חרוז-מצמידים על ידי שמירה על אותם על עמודה מגנטי. למחוק את התאים שכותרתו (תאי B). לאסוף את התאים שאינם עם התווית (MZBs), צינור חרוטי 15 מ"ל יש כבר מצופה מראש עם יישום קצרה של 5 מ"ל תא המאגר. הסר 50 µL של התאים ספירת ובדיקת טוהר.
  4. מכתים את MZBs ממוינים לבדיקת טוהר.
    1. להוסיף 10% נפח (5 µL) של קבוצת הכדורגל של גוש 10,000 תאים 50 µL, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להוסיף 50 µL תא מאגר המכיל 0.3 µL כל של B220-FITC (0.15 µg), CD21-PE (0.06 µg), ו CD23-APC (0.06 µg) בהנפח הכולל של 105 µL (1:350 כל נוגדן מדולל) , או כל שילוב אחר של fluorophores להבחנה בין תאי B ו- MZBs. כתם התאים ב 4 ° C בחושך למשך 15 דקות.
    2. לשטוף את התאים מוכתם פעם אחת עם 1 מ"ל תא המאגר. צנטריפוגה 300 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. Resuspend ב 300 µL תא מאגר ולרכוש דגימות באמצעות cytometer של זרימה ושיטות סטנדרטי. שער על לימפוציטים בשידור חי, אז על B220+ תאים, בסופו של דבר על CD23נמוך CD21גבוהה תאים (איור 1B).
      הערה: ההליך בדרך כלל מניבה MZBs 500,000 לכל הטחול של עכבר C57B/6.
  5. היכונו MZBs זרימה ההעברה.
    1. שטיפת טהור MZBs פעם בתוך 1-2 מ של מאגר ההעברה קר [של הנקס מאוזנת קטיונים המכיל תמיסת מלח (HBSS), 10 מ מ Hepes, 0.2% חומצת שומן ללא BSA] על מנת להבטיח כי המאגר ההעברה המכילות הקטיון לא לטשטש על-ידי מאגר PBS חינם הקטיון שיורית. צנטריפוגה 300 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וזורקים את תגובת שיקוע. מחדש להשעות MZBs במאגר ההעברה קר אל ריכוז של MZBs 50,000 לכל 30 µL (שווה ערך לסכום שטעון באר אחת של שקופית קאמרית זרימה).
      הערה: MZBs טרי מבודד אמור לשמש בהקדם האפשרי. עם זאת, הם עדיין מסוגל העברת עד 8 שעות או יותר לאחר תחילת הניסוי עבור כל עוד הם שמרו על קרח. טמפרטורות אופטימלית צריך להיבדק על סוגי תאים אחרים. לדוגמה, ייתכן שעדיף לשמור בתרבית תאי T ב 37 ° C עד תחילת ההעברה.

2. זרימה ניסוי

  1. המעיל שקופיות עם אינטגרין ליגנד.
    1. ביום לפני הניסוי, להפשיר aliquot של ICAM-1 (400 µg/mL). לדלל ICAM-1 לפי פקטור של 1:80 ב- PBS להגיע ריכוז הסופי של 5 µg/mL. להוסיף 30 µL של ICAM-1 לתא אחד בשקופית זרימה עבור כל סרט ההגירה הדרושה. דגירה שקופיות בתוך תא לח ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: כל שקופית מכיל 6 תאים, עד 8 סרטים בהפעלה אחת ניתן להקליט בקלות.
  2. לחסום את הבארות מצופה.
    1. ביום של הניסוי, לשטוף את התא על-ידי הוספת µL 100 ל- PBS באר אחת פורש 100 µL מן הבאר אחרים של התא. להוסיף 100 µL מאגר חסימה (2% חומצת שומן ללא BSA ב- PBS) לתא, דגירה השקופית בתוך תא לח ב RT עבור 1.5 h.
    2. לשטוף את התא על-ידי הוספת µL 100 ל- PBS באר אחת, מהאמנה זה אחרים טוב ולאחר מכן הוספת 100 µL מאגר העברה לתא. אחסן את השקופיות תא לח ב RT עד הניסוי.
  3. הכינו יחידת פלואידיקה.
    1. משאבה נוזלים, לצרף את יחידת פלואידיקה, ולהפעיל על התוכנה המשאבה. לשטוף את הצנרור פעם עם 5-10 מ"ל מאגר ההעברה, ולאחר מכן להוסיף 11.7 מ של מאגר ההעברה באופן שווה בשני מאגרים ולהסיר את בועות האוויר.
    2. תהדק את הצנרת בערך 10 ס מ מן היצירה מחבר. למקם את יחידת fluidic בחדר דגירה מחוממת על המיקרוסקופ.
    3. הגדר את הבחירה שקופית "ממוצע שקופית השישי 0.4" ואת הצנרת "לבן" בתוכנה. הגדר את מאמץ גזירה הרצוי (למשל 4 רמות דינ ס מ-2). הגדר את הזמן הדמיה 30 דקות.
    4. הגדרת הגורם כיול אבובים על-ידי קביעת קצב הזרימה דרך הצנרת מ"ל לדקה למדוד הזמן הנדרש עבור 2 מ"ל של המאגר זרימה של מאגר אחד של השני ולחלק ב- 2. לבצע לפחות 4 מידות עבור דיוק. השתמש קצב הזרימה בפועל כדי להגדיר את קצב הזרימה הרצויה ואת גזירה על-ידי הזנת הערכים לתוך התוכנה המשאבה.
  4. הכן מערכת ההדמייה.
    1. לחמם את המיקרוסקופ הדגירה קאמרית, פלואידיקה היחידה, aliquots מאגר העברה ל- C ° 37 (איור 2B). מבחן המשאבה fluidic על-ידי הבטחת כי המאגר ההעברה זורם אחורה וקדימה המאגרים, כי יש אין אוויר בועות בתוך המערכת.
  5. לטעון את התאים בשקופית.
    1. לנקות את החלק התחתון של השקופית ברקמות לחה אתנול. להוסיף 30 µL של התליה תא לבאר אחת לשכת ולסגת 30 µL מן הבאר אחרים. דגירה השקופית עם כיסוי על כדי למנוע אידוי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לאפשר את התאים לצרף.
    2. לאט לאט להוסיף מאגר ההעברה ומחוממת מראש כל טוב של השקופית קאמרית זרימה עד מניסקוס חיובי עולה מהבאר, להסיר את כל הבועות אוויר עם קצה פיפטה.
  6. לצרף את השקופית יחידת פלואידיקה.
    1. תהדק את השקופית לבמה מיקרוסקופ. הסר את הצד הלא מסומנים של הצנרת fluidic מחבר היצירה ומלא עד הסוף עם מאגר העברה עד מניסקוס חיובי ללא בועות אוויר כמחובר הסוף.
    2. הפוך בקצה של הצנרת מעל והוספתו לתוך הבאר העליון של התא זרימה, ניקו מאגר שנשפך עם רקמה. תוך שמירה על הצנרת כשכרטיס, חזור על הפעולות לכל הסוף מסומן של הצנרת.
  7. תמונה התאים.
    1. לעבור את מערכת הדמיה "לחיות" כדי להגדיר את המוקד על התאים. בחר תצוגה של שדה זה נמצא במרכז השקופית. דה-המוקד התאים מעט כדי לשפר את קווי המתאר השחורים של התא ולייצר פנים לבן, אז מה שיכול להיות thresholded לצורה עגולה תא שחור על רקע לבן לשימוש עם תוכנית מעקב אוטומטי.
    2. הפעלת התוכנית רצף הדמיה, רשומה 1 תמונה כל 5 s במשך 30 דקות באמצעות ה-10 x יבש המטרה. הסר את המלחציים הצנרת והפעל את המשאבה, תאים שאינם מחסידי ייעלמו בכביסה ואז תאים חסיד יתחיל להעביר. תמונה עבור 30 דקות או יותר שימוש של 10 x המטרה או יותר, לפי הצורך. תווית ולשמור את הסרט.
  8. ניתוק יחידת fluidic של השקופית.
    1. בסוף לתוכנית הדימות, לאפס את המשאבה עבור הניסוי הבא: לצרף מחדש את המלחציים על הצנרת, להסיר את הצנרור השקופית, לצרף מחדש את החלק המחבר, לפתוח את המלחציים ולהשתמש שליטה ידנית של המשאבה לדחוף מ"ל במספר מאגר של הזמנה אחת לקול האחר כדי להסיר את בועות האוויר. צרף מחדש את המלחציים ולהניח את הצנרור בחוזקה על הבמה מיקרוסקופ לסרט הבא.
      הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות ללא הגבלת זמן כאן. אם משתמש מעכב או צירוף של נדידת תאים, בהתאם פעולתה, להוסיף אותו או התליה תא לפני בבית הבליעה ההעברה או מאגר ההעברה ביחידת ה-fluidic.

3. העברה מסלול ניתוח

הערה: התאים ניתן לעקוב באופן אוטומטי באמצעות התוסף MTrack2 או ביד באמצעות תוסף מעקב ידני17. אוטומטי מעקב עובד היטב עם MZBs כי אלו תאים עגולים בעיקר ולהישאר בדרך זו בעת העברת, ובכך להקל על הסף את התמונה של התאים לאובייקטים שחורים על רקע לבן. מעקב אוטומטי אחר קשה יותר אם סוגי תאים אחרים משמשים, כגון תרבותי, הופעל CD8 + T תאים, כי תאים אלה למתוח במהלך ההעברה ולהיות קצת שקוף, ולכן קשה להגדיר את הקצוות. במקרה זה, או תאים (1) יכול להיות מוכתם של הפלורסנט אינטרה-חיוני כדי להפיק תמונות שניתן thresholded להראות אובייקטים שחור על רקע לבן, או תוכניות אחרות (2) חלוקה לרמות את התאים כגון זיהוי פילוח ו/או קצה התמונה יכולה להיות בשימוש. מעקב ידני הוא אופציה שימושית בשעת הכנת תמונת ניגודיות גבוהה של תאים מתאר אינה אפשרית.

  1. לבצע מעקב ידני באמצעות plugin.
    1. להתקין את התוסף "מעקב ידני" ImageJ ופתח את הסרט ב ImageJ. תחת תפריט "מעקב ידני", בחר "הוסף את הרצועה החדשה". לחץ על מרכז תא ההתקדמות סרט אוטומטי-מסגרת. כאשר התא שנבחר בכל מסגרת, בחר "הוסף חדש מהאלבום" להתחיל בעקבות תא חדש.
    2. לאחר המסילה תועדו, להעתיק את תוצאות פלט לגיליון נתונים. לשנות את התבנית לתצוגה עשרוני עבור כל התאים בגיליון האלקטרוני כדי לאפס מקומות אחרי הנקודה העשרונית. שמור את הקובץ כקובץ. txt "tab מופרד עצירה" לצורך ניתוח מאוחר יותר.
      הערה: בדרך כלל, 50 – 100 תאים נמצאים תחת מעקב, אשר לוקח בערך 1 h כדי להשלים עבור סרט 20 דקות של מסגרות כ 240.
  2. לבצע מעקב אוטומטי אחר באמצעות התוסף MTrack2. להוריד ולהתקין את התוסף kt MTrack2 לפי ההוראות בקובץ (ראה קובץ קידוד משלימה).
    1. סף תמונות מהסרט נדידת תאים. לפתוח של אוסף התמונות ב- ImageJ. תהליך התמונות ב- ImageJ כדי להמיר את הווידאו של צבע לתמונות חדות גבוהה מציג את התאים כאובייקט שחור על רקע לבן (איור 3 א).
      1. לחדד את התמונות פעמיים, הפחתת כתמים הדימויים, המרת התמונות ל- 8 סיביות. בחר "התמונה | התאם בהירות/חדות"תפריט המשנה ולשים את המחוון ניגודיות חדות מקסימלית, ולאחר מכן את התאים יופיעו אובייקטים לבן על רקע שחור. בחר "התמונה | להתאים את הסף"תפריט המשנה כדי להבטיח התאים יופיעו אובייקטים שחור על רקע לבן.
    2. להפעיל את התא אוטומטי מעקב תוסף "MTrack2 kt" (ראה קובץ קידוד משלימה). להגדיר את הפרמטרים הבאים במסך אפשרויות.
      1. הגדר את גודל החלקיקים המינימלי-1 פיקסל ואת גודל החלקיקים מרבי 30 פיקסלים עבור MZBs.
      2. על מהירות (המרחק המקסימלי בין חלקיקי 2 מסגרות רצופים של הסרט), אם צפיפות תא בשקופית גבוה, קבע ערך זה נמוך כדי להימנע מהצורך המסלול "לקפוץ" מתא אחד למשנהו. עבור MZBs, להגדיר ערך זה ב- 10 פיקסלים כדי ללכוד ליניאריים, למרות MZBs בדרך כלל לא יעלה על 2 פיקסלים על מסגרות רצופים 5 s בנפרד.
      3. עבור המספר המינימלי של מסגרות חלקיק חייב להיות נוכח לבצע אחריהם מעקב, להגדיר ערך זה מספר המסגרות בסרט עבור MZBs (למשל, 240) לסרט 20 דקות עם מסגרות 12/min. עם זאת, אם התאים נמצאים מספיק מהר לעזוב את שדה הראיה לפני סוף הדמיה, להגדיר את המספר המינימלי של מסגרות-פחות ממשך הזמן של הסרט. לדוגמה, עם תאי T מהיר-המעבר, הגדר את המספר המינימלי-המקבילה של 5-10 דקות של הדמיה.
        הערה: להקליט מאקרו של השלבים (קביעת סף ו MTrack2-kt) כדי להפוך לאוטומטי את החלק הזה של ההליך ולחסוך זמן (ראה קובץ קידוד משלימה). שימוש במאקרו לעקוב באופן אוטומטי אחר בסרט ImageJ אורכת פחות מדקה.
    3. להעתיק את תוצאות פלט גיליון נתונים. לשנות את התבנית לתצוגה עשרוני עבור כל התאים בגיליון האלקטרוני כדי לאפס מקומות אחרי הנקודה העשרונית. הוסף שורה ריקה בחלק העליון של המסילה תא בגיליון ' למחוק את העמודה "D". שמור את הקובץ כקובץ. txt "tab מופרד עצירה" לצורך ניתוח מאוחר יותר בכלי כימוטקסיס Ibidi.
      הערה: התוסף MTrack2 פלטי המסילה תא בשורות של 75 טורים מקבילים. ניתוח בכלי כימוטקסיס של Ibidi, הרצועות תא חייב להיות בעמודה בודדת. כדי להמיר את הפלט, התוסף MTrack2 שונתה פלט או בתבנית המקורית או כעמודה בודדת (איור 3B) (ראה קובץ קידוד משלימה "MTrack2 kt", אשר נכתב ב- Java). העתק את הקובץ .java לתיקיה תוספים ImageJ. ImageJ, בחר "תוספים > להדר, הפעל". ImageJ מחדש, את הגירסה של MTrack2 אמורה להופיע בתפריט תוספים.
  3. כדי לנתח תא רצועות עם הכלי Ibidi כימוטקסיס, להוריד את Ibidi כימוטקסיס וכלי ההעברה v 2.0 ("לעמוד לבד"), פתח את התוכנית.
    1. בחרו 'ייבוא נתונים', נווטו לקבצים רצועה תא. txt. ניתן לבחור קבצים מרובים בו זמנית. לקבצים מיובאים יופיעו בחלונית "Datasets" באדום. בחרו כולן והזינו את הערכים הנכונים בתפריט "Initialisation" שלהלן כדי להחיל את ההגדרות הבאות.
    2. הזינו את המספר המדויק או טווח מספר הפרוסות (מספר המסגרות בסרט).
    3. בתפריט כיול (X / Y כיול), הזן את הגודל של פיקסל. אתר מידע זה מאפייני הקובץ של הסרט. עבור MZBs, שימש מטרה 10 x, נותן גודל פיקסל של 1.14 מיקרומטר. ב "תפריט כיול | הזמן מרווח", הזן את משך הזמן בין מסגרות בסרט.
    4. להחיל את ההגדרות. בחר "להתוות נתונים" הצג את החלקות המסלול, לאשר כי הקבצים המסלול תיפתח. מנקודה זו, אפשרויות רבות זמינות אשר מתוארות בתיעוד של התוכנית, כולל סימון המסילה עם צבעים שונים בהתבסס על מאפיינים שונים, הצגת הערכים בודדים או ממוצע עבור מהירות, להעביר את ההעברה אינדקס הישירות, יותר (איור 3B).
      הערה: MZBs לקחת בערך 10 דקות ויוכל להגיב לזרימה, ככל הנראה על-ידי מקטב שלהם מתחמי אינטגרין לעניין העברת זרימה של התא. גרף של ההעברה אינדקס לאורך זמן יראה טיפה הראשונית מתחת לאפס, התואם את הזוג הראשון של דקות התא נחשף לזרום, ואחריו עלייה הדרגתית כלפי מעלה עד לערכי האינדקס העברה קדימה הם חיוביים. לכן, זה עשוי להיות אופטימלית כדי לא לכלול את הדקות הראשונות בחישובים הסופי, אלא אם כן תהליך זה הוא עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו נעשה שימוש בפרוטוקול שפורטו לעיל כדי להשוות בין העברה של MZBs בשקופיות ICAM-1-מצופה ללא זרימה (0 רמות דינ/cm2) ונחשף להטיית זרימה (4 רמות דינ/cm2). התאים היו מעקב באופן אוטומטי עם MTrack2, המסלול וכתוצאה מכך קבצים פרסו לקולנוע ההעברה לתא של אין זרימת (0 רמות דינ/cm2) ו- (4 רמות דינ/cm2) כדי להראות את התפלגות והצורה של המסילה (איור 4A). תא רצועות ואז יובאו לתוך הכלי כימוטקסיס Ibidi (ICT) כדי ליצור מסלול חלקות כל סרט (איור 4B). האינדקס ההעברה הממוצע (הנקראים "FMIy" ב- ICT), מהירות, יושר (נקרא "הישירות" ב- ICT) וכן המרחק בקו ישר (נקרא "מרחק אוקלידי" ICT) של התא שירים מסרטים 4 עבור שני התנאים חושבו על כלי כימוטקסיס באמצעות הפקודה "נמדדים ערכים". ממוצע של ערכים אלה הועתקו ואז לתוך GraphPad מנסרה עבור יצירת גרפים ו חישוב מובהקות סטטיסטית (איור 4C).

Figure 1
איור 1: הליכה הלוך ושוב. MZB. (א) מודל של MZB הליכה הלוך ושוב בין אזור שולי הזקיק של הטחול. MZBs דורשים הפנמה של S1PR1, קולטן S1P, CXCR5 תפקודית, קולטן עבור כימוקין CXCL13, על מנת להיכנס הזקיק. בנוסף, כדי להגיע הזקיק, MZBs עליך להעביר כנגד הכוח של זרימת דם שמקורם הנקבוביות של הסינוס שולית העוטף את הזקיק. אם MZB יפסיד הידבקות ICAM-1, ליגנד עבור אינטגרין LFA-1, זה נדחף לתוך הציפה אדום על ידי הכוח של הזרם, שבו כמויות גדולות יותר של VCAM-1, ליגנד עבור ויולה-4, לא תתמוך ההעברה. (B) cytometry זרימה gating אסטרטגיה כדי לבדוק את טוהר מיון MZBs באמצעות נוגדנים נגד B220, CD23 ו- CD21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הגדרת החדר המערכת, משאבה, מיקרוסקופ, דגירה פלואידיקה. תמונה (A) של מערכת המשאבה (Ibidi18) המורכב משאבה עם יחידת פלואידיקה מחובר במחשב נייד המריץ את התוכנה כדי לשלוט על המשאבה. התמונה הגדלה גבוהה יותר: השקופית קאמרית זרימה עם 6 תאי זרימה, הראשון שבהם הוא קשור הצנרת של היחידה פלואידיקה. (B) הגדרה טיפוסית למדידת ההגירה במבחנה של MZBs נגד זרימה. מיקרוסקופ מצויד תא חימום (קופסה שחורה) הכוללת את יחידת פלואידיקה מחוברת משאבה (אובייקט רבוע כחול בצד ימין התחתון של המיקרוסקופ) מחוץ המיקרוסקופ. התמונה הגדלה גבוהה יותר: יחידת פלואידיקה בתוך המיקרוסקופ חימום קאמרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: כימות של הדמיה נתונים. (א) להחליפן בתמונות של מסגרת מתוך סרט של העברת MZBs לפני (משמאל) ואחרי (מימין) קביעת סף התמונה כדי להמיר את התאים לאובייקטים שחורים על רקע לבן. סולם ברים גם תמונות נמוך וגבוה הגדלה = 100 מיקרומטר. (ב') פאנל שמאלי: התמונה של פלט תוצאות טיפוסיות של התוסף (טור בודד פלט) MTrack2. לוח נכון: תמונה של הכלי כימוטקסיס Ibidi ו- 2.0 העברה לאחר קלט של תוצאות MTrack2 מציג חלקת מסלול הגירה MZBs ומדד של "ערכים" להציג חלון מציג את הממוצעים של פרמטרים כולל מהירות, אינדקס ההעברה (הישירות ירוק תיבות), בין היתר. הגדרות הכיול המוצגים כוללים פיקסלים ברזולוציה של 1.14 מיקרומטר לפיקסל, מרווח זמן של 5 לשנייה (0.083 דקות) בכל מסגרת הסרט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: דוגמה של תוצאות באמצעות הפרוטוקול כדי למדוד הליכה הלוך ושוב. MZB. (א) נציג סטילס של MZBs נודדים עם כיסוי של שירים מן התוסף ImageJ "MTrack2 kt". הערה: הצבעים המסלול באופן שרירותי נקבעו על ידי תוסף "מעקב ידני" עבור ImageJ. סולם ברים שתי כניסות נמוך וגבוה הגדלה = 100 מיקרומטר. (B) המסלול נציג חלקות נודדות MZBs מן הכלי כימוטקסיס Ibidi ו- 2.0 ההעברה. קווים אדומים, קווים שחורים מייצגים רצועות תא לסיים מתחת או מעל הציר האופקי, בהתאמה. ב (א) ו- (B): שמאל, MZBs נודדים עם אין זרימת (0 רמות דינ/cm2); . כן, MZBs מעבר ל- 4 רמות דינ/ס מ2 זרם. (ג) העברה אינדקס (FMIy), מהירות, יושר (הישירות) מרחק MZBs נודדים ללא זרימה (0 רמות דינ/cm2) או זרימה (4 רמות דינ/cm2) (n = 4 עכברים 4 ניסויים נפרדים). קווי שגיאה = SD זאת אומרת ±; מבחן t של סטודנט, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה קובץ 1: MTrack2_kt.java. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.  

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נתאר כאן שיטה לניתוח ההעברה של תאי הכוח של הטיה זרימה ויוכל להגיב על-ידי שינוי ההגירה שלהם. ניתוח של MZBs הראה כי MZBs להעביר באופן ספונטני על ICAM-1, בנוכחות זרימה, להעביר את הזרם. בעבודה הקודמת, הראינו כי MZBs אינן מעבירות את הזרם על VCAM-1 אבל במקום זה יישאר קבוע במקום. מאתר הטחול אזור שוליים מכיל בעיקר ICAM-1, בעוד כשלקוח אדום מכיל ICAM-1 והן VCAM-1. מנתונים אלה, זה יכול להיות להסיק כי MZBs להעביר את הזרם בזמן את אזור שוליים אך לא את כשלקוח אדום. הניתוח אומתה ויוו באמצעות MZBs עם אדהזיה פגום זה היו mislocalized כדי כשלקוח אדום הטחול על ידי הכוח של זרימה12. מסיבות אלו, MZBs מייצגים פקד חיובית טובה לבדיקת מערכת ההעברה הזרימה המתוארת כאן, גם אם המערכת משמשת ללמוד סוג תאים שונים.

הפן הקריטי ביותר של ההליך הוא להבטיח עקביות בתא טיפול בשקופית. כי ההיבטים לכימות של נדידת תאים תלויה אשר התאים לדבוק השקופית, כל ירידה של אדהזיה הסלולר יגרום לשחזור תוצאות קשה. אדהזיה הסלולר ירד עקב חוסר עקביות גורמים רבים, כולל טמפרטורות של המאגר ההעברה או בתיבה הדגירה מחוממת (הקור מפחית הדבקות), רמות של קטיונים לתא ההשעיה (קטיונים משפיע על איגוד אינטגרין), שקופית טיפול (הקשה או כיפוף של השקופית יכול לפרק תאים), והתא צפיפות (התנגשויות בין תאים יכול להשפיע על העברת פרמטרים). נקודות רגישות אחרות במהלך ההליך כוללים לא pipetting המאגר לתוך הבארות שקופית בכוח רב מדי לפני חיבור הצנרת (כמו זה יכול להפחית את התא אדהזיה) ולשמור את הזמן הנדרש עבור פרוטוקול שלבים עקבי בכל (ניסוי זמן הייבוש תא עשוי להשפיע על אדהזיה). לסיכום, כל השפעה אפשרית על התא אדהזיה חייב להישמר עקביים בכל החזרות להפקת נתוני הגירה התא אמין.

שיטה זו היא קל להגדיר מאז זה משתמשת ציוד זמינים מסחרית אספקה ואף אחד השלבים דורשות הוראה מתקדמות. לניתוח של MZB, כמו גם סוגי תאים אחרים כגון CD8 בתרבית+ T תאים, ציפוי של השקופיות עם ליגנדים אינטגרין שונים מספיקה לבחון את ההעברה כן. לומד העברת זרימה-induced בתגובה ליגנדים אינטגרין השונים מוביל זיהוי ישיר של אינטגרינים פעיל על פני התא, ואולי חשיפת מנגנוני הרלוונטיים ויוו פונקציות כמו עם MZB הגירה במעלה הזרם ICAM-1 אבל לא VCAM-1. זאת, בנוסף ניתן להוסיף שכבת תאי אנדותל הצ'יימברס זרימה. דוגמה אחת של נדידת תאים חיסוניים המושפע על-ידי הטיית זרם היא תא T extravasation דרך שכבות אנדותל3. הליך זה נעשה שימוש כדי לפענח את ההפעלה של תא T אדהזיה ויה אינטגרינים, selectins, נוגדנים, וכדי דגם ההעברה לימפוציט לעבור מחסום דם - מוח. המגבלה היחידה על התאים מסוגל לנתח בשיטה זו היא כי הם חייב להיות מסוגל לחוש את עוצמת הזרימה כאות כיוונית.

למרות השיטה שמפורטות כאן נעשה שימוש כדי לאפיין התנהגות הסלולר כגון מהירות, מפנה, זה גם ניתן להרחיב את הניתוח של היבטים מולקולריים של ההעברה. מתחמי מולקולרית הרלוונטיים זרימה-induced ההעברה, לרבות אינטגרינים כגון LFA-1 ומתאמים cytoskeletal שלהם, יהיה ממוקם במרחק 200 ננומטר של פני השטח של השקופית, נוטה ויזואליזציה עם מיקרוסקופ TIRF. תוספת זו השיטה יהיה אידיאלי ללמוד תאים של עכברים עם מוטציות בגן אינטגרין או שלד התא-חלבונים הקשורים. כמו תאים חיסוניים רבים להעביר בשלבים שונים בהתפתחות שלהם דרך הדם או הלימפה זורם, ההעברה במבחנה תיאר יכול לשמש לבחון באופן שיטתי סוגים רבים של לויקוציטים בתרבית או ראשונית לתגובת לזרום ולחשוף התאים, מה שלומך מתוכנת לעבור בדרך תגובה חיסונית ויוו. לסיכום, וזמינותו המתוארים כאן מספק שיטה אמינה וישירה לניתוח תזרים-induced העברה של MZBs זה גם ניתן להרחיב את סוגי תאים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של 854/TP11 SFB "פתוח" ק-DF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
  13. ImageJ. MTrack2. , Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018).
  14. MTrack2. , Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018).
  15. ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018).
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).
  17. ImageJ. Manual Tracking. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018).
  18. ibidi. ibidi Pump System. , Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. (2018).

Tags

אימונולוגיה ותאי B זיהום גיליון 141 אזור שוליים הגירה הטיה זרימה אינטגרינים הדבקות אדהזיה המערכת מולקולה-1 (ICAM-1) כלי הדם תא אדהזיה מולקולה-1 (VCAM-1)
ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M.,… More

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. D. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter