تحليل القص الناجمة عن تدفق الهجرة من المنطقة الهامشية الفاري ب الخلايا في المختبر

Summary

منطقة هامشية ب الخلايا (مزبس) الاستجابة لقوة تدفق القص بإعادة توجيه مسار الهجرة تدفق. هذا البروتوكول يوضح كيفية تسجيل وتحليل الهجرة استخدام وحدة فلويديكس، مضخة، ونظام التصوير بالمجهر، والبرمجيات الحرة.

Abstract

منطقة هامشية ب الخلايا (مزبس) هي عدد سكانها ب الخلايا التي توجد في مناطق الماوس هامشية الطحال الذي يطوق المسام. للوصول إلى المسام، يجب ترحيل مزبس قوة القص لتدفق الدم. ونقدم هنا طريقة لتحليل هذا الناجم عن تدفق MZB الهجرة في المختبر. أولاً، يتم مزبس المعزولة من الطحال الماوس. وثانيا، استقر على يغاندس إنتغرين في شرائح الدائرة تدفق مزبس وتتعرض للقص تدفق وتصويرها تحت مجهر أثناء ترحيل. ثالثا، تتم معالجة الصور مزبس ترحيل استخدام الخلية التلقائي MTrack2 تتبع البرنامج المساعد إيماجيج، وكمياً المسارات الخلية الناتجة باستخدام أداة إنزيمية عبدي. وتكشف بيانات الهجرة مدى سرعة نقل الخلايا وكيف في كثير من الأحيان أنها تغير الاتجاه، وعما إذا كان ناقل تدفق القص يؤثر على اتجاه الهجرة وتشارك فيه يغاندس إنتغرين. على الرغم من أننا نستخدم مزبس، الأسلوب يمكن تكييفها لتحليل الهجرة من أي الكريات البيض الذي يستجيب إلى قوة تدفق القص بسهولة.

Introduction

الخلايا المناعية هي الخلايا الأكثر متحركة في الجسم البشري، وغالباً ما يجب أن يتعامل مع قوة القص من تدفق الدم والليمفاوية. ومع ذلك، هناك دراسات قليلة نسبيا على الهجرة الناجمة عن قوة القص من الكريات البيضاء^1،2،3،،من⁴⁵. نحن الحاضرين هنا بروتوكولا موثوقة والكمية لتحليل استجابة إحدى الخلايا المناعية للتدفق في الأنابيب. لا تتطلب إجراء المقايسة تصنيع المكونات، وجميع المعدات والمواد الاستهلاكية متوفرة تجارياً. يمكن تنفيذ البروتوكول، بما في ذلك خلية تحليل تنقية والهجرة، في يوم واحد. وأخيراً، على الرغم من أن يصف لنا هجرة الخلايا باء منطقة هامشية (مزبس)، يمكن تكييفها مع البروتوكول لتحليل الهجرة ضد تدفق أنواع أخرى من الخلايا المناعية. ولذلك، من الممكن لاستخدام هذا التحليل لمنهجية تحليل طائفة واسعة من الكريات البيضاء مع لوحة شاملة للظروف.

مزبس هي عدد سكانها ب الخلايا التي تم العثور عليها فقط في الطحال والمكوك، في الماوس، وبين المناطق داخلية المسام والمناطق الهامشية^6،7،،من⁸⁹. منطقة هامشية طبقة من الخلايا المناعية حوالي 5 – 10 خلايا سميكة. طبقة الخلايا مظاريف المسام ويتكون أساسا من مزبس والضامة ولكن أيضا ثابتة الطبيعية القاتل تي (إينكت) الخلايا والخلايا الجذعية (DCs) والعدلات، بين أمور أخرى¹⁰. الخلايا في المنطقة الهامشية التي تتعرض لتدفق الدم أحادي الاتجاه التي تنشأ من الشرايين الطحال الذي ينهي في تجويف هامشية المحيطة المسام. الدم يتدفق من ثقوب في الجيوب الأنفية هامشية من خلال منطقة هامشية وهي ثم جمعها في الجيوب الوريدية في اللب الأحمر واستعادتها إلى تداول¹¹. يغسل أكثر مزبس الحرة--تدفق الدم ويعرضهم لمولدات المضادات في الدم. تحمل مزبس antigen في المسام بجولات مكوكية تلقائياً بين منطقة هامشية وداخل المسام، التي لم تتعرض للدم. وهكذا، كالمكوك مزبس نحو المسام، يجب أن يهاجر قوة القص ل تدفق الدم¹² (الشكل 1A).

في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تحديد الكمية كيف الخلايا المناعية مثل مزبس الاستجابة للا تدفق أو تدفق عالية في المختبر، بغية الكشف عن الكيفية التي يتم برمجتها لترحيل في فيفو. في الخطوة الأولى، يتم تنقية مزبس من طحال ماوس استخدام الخرز المغناطيسية بالإضافة إلى الأجسام المضادة من مجموعات المتاحة تجارياً. أدخلت في البئر لشريحة الدائرة تدفق مزبس طازجة معزولة، وسمح لهم بالتوطن على يغاندس إنتغرين، وعرضه لتدفق الهجرة المخزن المؤقت باستخدام نظام مضخة (الشكل 2A). يتم تصويرها الخلايا باستخدام نظام الوقت الفاصل بين الفحص المجهري فيديو. ثم تتم معالجة الصور للتحليل مع البرنامج المساعد ImageJ حرة، MTrack2^،من¹³¹⁴، لتعقب الخلايا تلقائياً. ثم يمكن قياس المسارات مع أداة إنزيمية عبدي الحرة¹⁵ لتحديد معلمات مختلفة بما في ذلك السرعة، والاستقامة، ومؤشر الهجرة. يمكن استخدام هذه القيم لتحديد آثار الهجرة مثبطات، المنبهات الخلية والمستقطبات وغيرها من المواد الكيميائية التي تؤثر على الهجرة على الهجرة الناجمة عن تدفق القص بغية فهم القوى السيطرة على حركة الخلايا المناعية المجراة.

Protocol

جميع التجارب التي تنطوي على استخدام الحيوانات قد تم سبق أن أقرتها هالي لانديسفيروالتونجسامت (سكسونيا)، ألمانيا، وفقا للمبادئ التوجيهية لكل من كلية الطب في جامعة أوفجو في Magdeburg.

1-MZB خلية تنقية

1. عزل الكريات البيضاء.
   1. التضحية 8 إلى 16 أسبوع الماوس وإزالة الطحال¹⁶. ننأى الطحال في 5 مل من المخزن المؤقت للخلية المثلج [مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) + 0.5% ألبومين المصل البقري الخالية من الأحماض الدهنية (BSA)]، عن طريق استخدام ديسوسياتور أنسجة أو جرش الطحال من خلال شبكة مصفاة خلية 70 ميكرومتر في بئر على لوحة 6-جيدا بلطف مع المكبس من حقنه 5 مل.
   2. نقل الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت للخلية في أنبوب مخروطي 15 مل. جمع الخلايا الإضافية بإضافة آخر 5 مل من المخزن المؤقت للخلية المثلج إلى أنبوب ديسوسياتور الأنسجة أو شبكة النايلون في البئر. نقل إضافية 5 مل من المخزن المؤقت للخلية بالإضافة إلى خلايا للأنبوبة المخروطية. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT، 20 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية.
2. إجراء تحلل خلايا الدم الحمراء.
   1. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل المخزن المؤقت (150 مم NH₄Cl، 10 مم كهكو₃، يدتا 0.1 ملم) هو المعالجون مسبقاً إلى الرايت إضافة مل 1.5 إضافية من المخزن المؤقت لتحلل ربك ودوامه إلى المزيج. احتضان في الرايت (20 درجة مئوية) لمدة 2 دقيقة، بما في ذلك الوقت اللازم لإعادة تعليق بيليه.
   2. إضافة 7.5 مل من المخزن المؤقت للخلية المثلج إلى تعليق خلية لوقف تحلل. الطرد المركزي في 300 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية.
   3. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت للخلية وإضافة مل 9 إضافية من المخزن المؤقت للخلية. "الماصة؛" تعليق خلية 10 مل من خلال عامل تصفية قبل فصل 30 ميكرومتر في أنبوب 15 مل مخروطية الشكل جديد لإزالة الحطام خلية.
   4. الطرد المركزي خلايا في 300 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية. إعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للخلية. الحفاظ على الخلايا الباردة الخطوات اللاحقة في جميع الإجراءات حتى الحضانة في الشرائح الدائرة التدفق.
3. تنقية مزبس.
   1. إضافة 50 ميليلتر من الأجسام المضادة إلى جانب البيوتين من مجموعة أدوات متوفرة تجارياً ضد كافة الخلايا غير مرغوب فيها، بما في ذلك CD43 (في الخلايا غير-ب) وخلايا CD4 (في خلايا تي)، CD93 (في خلايا غير ناضجة ب) و Ter119 (في الكريات الحمراء)، إلى تعليق خلية في أنبوب مخروطي. اهتزاز أو نفض الغبار الأنبوب بلطف المزيج، ولكن لا عدم دوامة الخلايا. وضع الأنبوبة المخروطية على سرير من الثلج في زاوية تقريبا-شقة والصخور في 25 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
   2. إضافة الخرز المغناطيسية بالإضافة إلى البيوتين المضادة الأجسام المضادة في إجمالي حجم 100 ميليلتر لتعليق خلية. مواصلة لموسيقى الروك بتعليق خلية في دورة في الدقيقة 25 على الجليد ل 20 دقيقة أغسل الخلايا بإضافة 5 مل من المخزن المؤقت للخلية، سينتريفوجينج في 300 x غ و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت للخلية.
   3. تستنفد تعليق خلية من الخلايا إلى جانب حبة المغناطيسي بالإبقاء عليهم في عمود مغناطيسية. تجاهل المسماة الخلايا (جميع الخلايا غير ب وب خلايا غير ناضجة). جمع الخلايا غير المسمى (ناضجة ب الخلايا) في أنبوب مخروطي 15 مل الذي تم مسبقاً المغلفة مع تطبيق قصيرة من 5 مل من المخزن المؤقت للخلية، منعا للالتصاق غير محددة من مزبس.
   4. أغسل تعليق خلية مع 5 مل من المخزن المؤقت للخلية. الطرد المركزي في 300 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية. تعليق إعادة الخلايا في 90 ميليلتر من المخزن المؤقت للخلية وإضافة 10 ميليلتر من الخرز إلى جانب CD23 المضادة. تعليق خلية روك بلطف على الجليد لمدة 20 دقيقة في دورة في الدقيقة 25.
   5. أغسل تعليق خلية مع 5 مل من المخزن المؤقت للخلية. الطرد المركزي في 300 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت للخلية.
   6. تستنفد تعليق خلية من الخلايا إلى جانب حبة المغناطيسي بالإبقاء عليهم في عمود مغناطيسية. تجاهل الخلايا المسماة (جرابي ب الخلايا). جمع الخلايا غير المسمى (مزبس)، في أنبوب مخروطي 15 مل التي قد تم مسبقاً المغلفة مع تطبيق قصيرة من 5 مل من المخزن المؤقت للخلية. إزالة 50 ميليلتر من الخلايا للعد والتحقق من النقاء.
4. وصمة عار مزبس تم فرزها للتأكد من النقاء.
   1. إضافة إلى حجم 10% (5 ميليلتر) كتلة Fc للخلايا 10,000 في 50 ميليلتر واحتضان عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 إضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت الخلية التي تحتوي على ميليلتر 0.3 كل من B220-فيتك (0.15 ميكروغرام)، CD21-PE (0.06 ميكروغرام)، و CD23-آسيا والمحيط الهادئ (0.06 ميكروغرام) في إجمالي حجم 105 ميليلتر (كل جسم المخفف 1:350) ، أو أي تركيبة أخرى من فلوروفوريس للتمييز بين الخلايا ب جرابي ووصمة عار مزبس. الخلايا عند 4 درجة مئوية في الظلام لمدة 15 دقيقة.
   2. تغسل الخلايا الملون مرة واحدة مع 1 مل من المخزن المؤقت للخلية. الطرد المركزي في 300 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند في 300 ميليلتر من المخزن المؤقت للخلية والحصول على العينات باستخدام سيتوميتير تدفق والأساليب القياسية. بوابة لمفاوية حية، ثم في B220⁺ الخلايا، وأخيراً في CD23^منخفض CD21^ارتفاع الخلايا (الشكل 1B).
      ملاحظة: الإجراء عادة غلات 500,000 مزبس الواحدة والطحال من ماوس C57B/6.
5. إعداد مزبس لتدفق الهجرة.
   1. تنقية المياه والصرف الصحي مزبس مرة واحدة في 1 – 2 مل من المخزن المؤقت الهجرة الباردة [هانكس متوازنة الحل الملح (حبس) تحتوي على الكاتيونات، 10 مم حبيس، جيش صرب البوسنة خال من الأحماض الدهنية 0.2%] لضمان أن المخزن المؤقت الهجرة التي تحتوي على الأيونات الموجبة هو عدم تمييع PBS خالية من الأيونات الموجبة المتبقية المخزن المؤقت. الطرد المركزي في 300 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية. إعادة تعليق مزبس في المخزن المؤقت للهجرة الباردة إلى تركز مزبس 50,000 الواحدة 30 ميليلتر (ما يعادل المبلغ الذي تم تحميله في بئر واحدة من شريحة الدائرة تدفق).
      ملاحظة: يجب استخدام مزبس طازجة معزولة أقرب. بيد أنها لا تزال قادرة على ترحيل لتصل إلى 8 ساعات أو أكثر بعد بدء التجربة بالنسبة لطالما يتم الاحتفاظ بها على الجليد. وينبغي اختبار درجات الحرارة المثلى لأنواع الخلايا الأخرى. على سبيل المثال، قد يكون من الأفضل أن تبقى مثقف خلايا تي في 37 درجة مئوية حتى بدء الهجرة.

2-تدفق التجربة

1. معطف الشرائح مع إنتغرين يجند.
   1. في اليوم قبل التجربة، ذوبان الجليد قاسمة المتكاملة-1 (400 ميكروغرام/مل). تمييع المتكاملة-1 بعامل 1:80 في برنامج تلفزيوني للوصول إلى تركيز نهائي من 5 ميكروغرام/مل. إضافة 30 ميليلتر المتكاملة-1 إلى دائرة واحدة على شريحة تدفق لكل فيلم الهجرة المطلوبة. احتضان شريحة في دائرة رطبة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: كل شريحة تحتوي على 6 الدوائر وتصل إلى 8 أفلام في جلسة واحدة يمكن تسجيلها بسهولة.
2. كتلة الآبار المغلفة.
   1. في يوم التجربة، يغسل الدائرة بإضافة 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني إلى بئر واحدة وسحب 100 ميليلتر من البئر الأخرى من الدائرة. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت حظر (BSA خال من الأحماض الدهنية 2% في برنامج تلفزيوني) لدائرة واحتضان الشريحة في دائرة رطبة في RT 1.5 ح.
   2. أغسل الدائرة بإضافة 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لبئر واحدة، سحبه من الأخرى جيدا، ثم إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للهجرة إلى الدائرة. تخزين الشرائح في دائرة رطبة على RT حتى التجربة.
3. تعد وحدة فلويديكس.
   1. قم بتوصيل مضخة السوائل وإرفاق وحدة فلويديكس، وتشغيل البرمجيات مضخة. أغسل الأنبوب مرة واحدة مع 5 – 10 مل من المخزن المؤقت للهجرة، ثم أضف مل 11.7 من المخزن المؤقت للهجرة على قدم المساواة لكل الخزانات وإزالة فقاعات الهواء.
   2. المشبك الأنبوب حوالي 10 سم من قطعة موصل. مكان الوحدة فلويديك في غرفة الحضانة ساخنة في المجهر.
   3. تعيين خيار "μ-الشريحة السادسة 0.4" الشريحة والأنابيب إلى "الأبيض" في البرنامج. تعيين إجهاد القص المطلوب (مثلاً 4 داين سم^-2). تعيين الوقت للتصوير إلى 30 دقيقة.
   4. تعيين معامل المعايرة الأنابيب بتحديد معدل التدفق من خلال الأنبوب في مل/دقيقة قياس الوقت اللازم لمل 2 العازلة تتدفق من خزان واحد للآخر والقسمة على 2. إجراء قياسات 4 على الأقل للتأكد من دقتها. استخدم معدل التدفق الفعلي لتعيين معدل التدفق المطلوب وإجهاد القص بإدخال القيم في البرمجيات مضخة.
4. إعداد نظام التصوير.
   1. قبل دافئ غرفة الحضانة المجهر، الوحدة فلويديكس، ومختبرين المخزن المؤقت للهجرة إلى 37 درجة مئوية (الشكل 2). اختبار مضخة فلويديك بضمان أن تدفقات الهجرة المخزن المؤقت ذهابا وإيابا في الخزانات وأنه لا توجد أي الهواء فقاعات في النظام.
5. تحميل الخلايا الموجودة على الشريحة.
   1. تنظيف الجزء السفلي من الشريحة مع أنسجة قلل الإيثانول. إضافة 30 ميليلتر من تعليق خلية في بئر واحدة من الدائرة وسحب 30 ميليلتر من البئر الأخرى. احتضان الشريحة مع غطاء على منع التبخر في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا إرفاق.
   2. ببطء إضافة المخزن المؤقت الهجرة المعالجون مسبقاً لكل بئر من الشريحة الدائرة تدفق حتى ترتفع غضروف إيجابية الخروج من البئر وإزالة أي فقاعات الهواء بطرف ماصة.
6. إرفاق الشريحة إلى وحدة فلويديكس.
   1. المشبك الشريحة إلى مرحلة المجهر. إزالة الجانب غير موسومة الأنابيب فلويديك من قطعة موصل وتملأ النهاية مع المخزن المؤقت للهجرة حتى ترتفع غضروف إيجابية دون فقاعات الهواء من النهاية.
   2. الوجه نهاية الأنبوب أكثر وأدخله في أعلى البئر الدائرة تدفق، تطهير المخزن المتسرب مع أنسجة. مع الاحتفاظ بالانبوب فرضت، كرر الإجراء ملحوظ نهاية الأنبوب.
7. صورة الخلايا.
   1. تبديل نظام التصوير إلى "حية" لتعيين التركيز على الخلايا. حدد طريقة عرض للحقل في منتصف الشريحة. إزالة التركيز الخلايا قليلاً لتعزيز المخطط أسود من الخلية وإنتاج داخلية بيضاء، التي يمكن ثم ثريشولديد على شكل جولة خلية سوداء على خلفية بيضاء لاستخدامها مع برنامج تتبع الآلي.
   2. بدء تشغيل البرنامج تسلسل التصوير وسجل 1 صورة كل 5 s مدة 30 دقيقة باستخدام 10 × الهدف الجافة. إزالة المشبك من الأنابيب وتشغيل المضخة، ثم سوف يغسل الخلايا غير ملتصقة وسوف تبدأ الخلايا ملتصقة على الهجرة. صورة عن 30 دقيقة أو استخدام أطول من 10 x الهدف أو أعلى، كما هو مطلوب. قم بتسمية وحفظ الفيلم.
8. فصل وحدة فلويديك من الشريحة.
   1. في نهاية برنامج التقاط الصور، إعادة تعيين مضخة للتجربة التالية: إعادة إرفاق المشبك للأنبوب وإزالة الأنبوب من الشريحة وإعادة إرفاق رابط قطعة، وفتح المشبك واستخدام عنصر التحكم اليدوي مضخة لدفع مل عدة من المخزن المؤقت من الحجز واحد أوير إلى أخرى لإزالة فقاعات الهواء. إعادة إرفاق المشبك ووضع الأنابيب فرضت على المسرح المجهر للفيلم المقبل.
      ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً إلى أجل غير مسمى هنا. إذا استخدام المانع أو معدل الهجرة الخلية، اعتماداً على أسلوب العمل، إضافة إلى أما تعليق الخلية قبل أن يستقر في دائرة الهجرة أو إلى المخزن المؤقت الهجرة في وحدة فلويديك.

3-الهجرة تحليل المسار

ملاحظة: يمكن تعقب الخلايا تلقائياً باستخدام البرنامج المساعد MTrack2 أو باليد باستخدام البرنامج المساعد "دليل تتبع"¹⁷. التلقائية التي تعقب يعمل بشكل جيد مع مزبس لأن هذه الخلايا هي أساسا جولة، وتظل هذه الطريقة أثناء ترحيل، مما يجعل من السهل على عتبة صورة الخلايا إلى كائنات سوداء على خلفية بيضاء. التعقب التلقائي أكثر صعوبة إذا كانت أنواع الخلايا الأخرى المستخدمة، كمثقف، وتنشيط خلايا CD8 + "تي"، لأن هذه الخلايا يمتد من خلال الهجرة وتصبح شفافة نوعا ما، مما يجعل من الصعب تحديد الحواف. وفي هذه الحالة، أما خلايا (1) يمكن ملطخة صبغة فلورسنت حيوية داخل لإنتاج الصور التي يمكن أن تكون ثريشولديد لإظهار الكائنات السوداء على خلفية بيضاء، أو البرامج (2) الأخرى لتحديد الخلايا مثل يمكن أن يكون الكشف عن تجزئة و/أو حافة الصورة المستخدمة. تتبع الخط خياراً مفيداً عند إنتاج صورة عالية التباين للخلية الخطوط العريضة من غير الممكن.

1. إجراء تتبع الخط باستخدام البرنامج المساعد.
   1. تثبيت البرنامج المساعد "دليل التتبع" في إيماجيج وفتح الفيلم في إيماجيج. ضمن القائمة "تتبع الدليل"، حدد "إضافة مسار جديد". انقر فوق مركز خلية كسلف الفيلم تلقائياً الإطار حسب الإطار. عندما تم تحديد الخلية في كل إطار، حدد "إضافة مسار جديد" لبدء تشغيل بعد خلية جديدة.
   2. بعد أن تم تسجيل المسارات، نسخ إخراج النتائج في جدول بيانات. تغيير تنسيق لعرض عشري لجميع خلايا جدول البيانات إلى أماكن صفر بعد الفاصلة العشرية. حفظ الملف كملف.txt "تبويب مفصولة بوقف" للتحليل اللاحق.
      ملاحظة: عادة، يتم تعقب الخلايا 50 – 100، الذي يستغرق حوالي 1 ح لإكمال لفيلم 20 دقيقة من إطارات حوالي 240.
2. تنفيذ التعقب التلقائي باستخدام البرنامج المساعد MTrack2. تنزيل وتثبيت البرنامج المساعد كيه MTrack2 وفقا للتعليمات في الملف (انظر ملف الترميز الإضافي).
   1. عتبة الصور من فيلم الهجرة الخلية. افتح المكدس الصورة في إيماجيج. عملية الصور في إيماجيج لتحويل الفيديو من لون إلى صور عالية التباين تظهر الخلايا ككائنات سوداء على خلفية بيضاء (الشكل 3A).
      1. شحذ الصور مرتين وتمويه داخلي الصور، وتحويل الصور إلى 8 بت. حدد "صورة | ضبط السطوع/"القائمة الفرعية ووضع المنزلق التباين على النقيض من الحد الأقصى، ثم الخلايا سوف تظهر ككائنات اللون الأبيض على خلفية سوداء. حدد "صورة | ضبط عتبة "القائمة الفرعية لضمان أن تظهر الخلايا ككائنات سوداء على خلفية بيضاء.
   2. تشغيل الخلية التلقائي تتبع البرنامج المساعد "كيه MTrack2" (راجع ملف الترميز الإضافي). تعيين المعلمات التالية في شاشة خيارات.
      1. تعيين حجم الجسيمات الحد الأدنى في 1 بكسل وحجم الجسيمات الحد الأقصى 30 بكسل مزبس.
      2. للسرعة (المسافة القصوى بين الجسيمات 2 في إطارات متتالية من الفيلم)، في حالة ارتفاع كثافة الخلية على الشريحة، تعيين هذه القيمة منخفضة لتجنب الاضطرار المسار "القفز" من خلية واحدة إلى آخر. مزبس، تعيين هذه القيمة على 10 بكسل لالتقاط القيم المتطرفة، على الرغم من أن مزبس عموما لا تتجاوز 2 بكسل على الإطارات المتتالية التي هي 5 s عن بعضها البعض.
      3. لتعيين الحد الأدنى لعدد الإطارات جسيم له يكون حاضرا لتعقبه، هذه القيمة في عدد الإطارات في الفيلم مزبس (مثل، 240) لفيلم 20 دقيقة مع إطارات بالدقيقة 12. ومع ذلك، إذا كانت الخلايا سريعة بما يكفي ترك مجال الرؤية قبل نهاية التصوير، ثم تعيين الحد الأدنى لعدد الإطارات في أقل من مدة الفيلم. على سبيل المثال، مع خلايا تي سريعة الحركة، تعيين الحد الأدنى لعدد بما يعادل 5-10 دقيقة من التصوير.
         ملاحظة: تسجيل ماكرو من هذه الخطوات (العتبة وكيه MTrack2) لأتمتة هذا الجزء من الإجراء وتوفيرا للوقت (انظر ملف الترميز الإضافي). باستخدام الماكرو تلقائياً تتبع فيلم في إيماجيج يستغرق أقل من دقيقة.
   3. نسخ إخراج النتائج في جدول بيانات. تغيير تنسيق لعرض عشري لجميع خلايا جدول البيانات إلى أماكن صفر بعد الفاصلة العشرية. إضافة صف فارغ في الجزء العلوي من المسارات خلية في جدول البيانات، وحذف العمود "د". حفظ الملف كملف.txt "تبويب مفصولة بوقف" للتحليل اللاحق في أداة عبدي إنزيمية.
      ملاحظة: نواتج البرنامج المساعد MTrack2 المسارات الخلية في صفوف من الأعمدة المتوازية 75. لمزيد من التحليل في أداة إنزيمية عبدي، يجب أن تكون المسارات خلية في عمود واحد. لتحويل الإخراج، تعديل البرنامج المساعد MTrack2 لإخراج أما بالتنسيق الأصلي أو كعمود واحد (الشكل 3B) (راجع ملف الترميز الإضافي "كيه MTrack2"، الذي هو مكتوب في جاوة). نسخ ملف.java إلى مجلد الإضافات إيماجيج. في إيماجيج، حدد "الإضافات > ترجمة وتشغيل". إعادة تشغيل إيماجيج، ونسخة معدلة من MTrack2 يجب أن تظهر في قائمة الوظائف الإضافية.
3. تحليل مسارات الخلية باستخدام أداة إنزيمية عبدي، تحميل v2.0 إنزيمية عبدي وأداة الترحيل ("قائمة بذاتها") وافتح البرنامج.
   1. حدد "استيراد بيانات" وانتقل إلى ملفات.txt خلية المسار. يمكن تحديد ملفات متعددة في نفس الوقت. تظهر الملفات التي تم استيرادها في جزء "مجموعات" باللون الأحمر. حدد كل منهم وأدخل القيم الصحيحة في القائمة "Initialisation" أدناه لتطبيق الإعدادات التالية.
   2. أدخل العدد الدقيق أو طائفة من عدد الشرائح (عدد إطارات في الفيلم).
   3. في القائمة المعايرة (X/Y المعايرة)، قم بإدخال الحجم بكسل. تحديد موقع هذه المعلومات في خصائص ملف الفيلم. مزبس، استخدمت هدفا 10 x، إعطاء حجم بكسل من 1.14 ميكرومتر. في "قائمة المعايرة | وقت الفاصل الزمني "، أدخل طول الفترة الزمنية بين الإطارات في الفيلم.
   4. تطبيق الإعدادات. حدد "رسم البيانات" لعرض قطع المسار والتأكد من أنه سيتم فتح الملفات المسار. من هذه النقطة، خيارات كثيرة متاحة الذي يرد في الوثائق الخاصة بالبرنامج، بما في ذلك وسم المسارات مع ألوان مختلفة استناداً إلى خصائص مختلفة، وتعرض القيم الفردية أو متوسط للسرعة، إلى الأمام الهجرة فهرس والمباشرة، وأكثر (الشكل 3B).
      ملاحظة: مزبس تأخذ حوالي 10 دقيقة للكشف والاستجابة للتدفق، يفترض بالاستقطاب على المجمعات إنتغرين إلى نقطة التدفق إلى الأمام للخلية. رسم بياني لمؤشر الهجرة مع مرور الوقت سوف تظهر نتيجة حدوث انخفاض أولية تحت الصفر، المقابلة لأول زوجين من الدقائق التي تتعرض الخلية للتدفق، متبوعاً بارتفاع تدريجي صعودا حتى قيم مؤشر الهجرة إلى الأمام إيجابية. وهكذا، قد يكون الأمثل لاستبعاد هذه الدقائق الأولى في الحسابات الختامية، ما لم تكن هذه العملية للفائدة.

Representative Results

نحن تستخدم البروتوكول المبينة أعلاه للمقارنة بين هجرة مزبس على الشرائح المتكاملة 1-المغلفة بدون تدفق (0 داين/سم²) وتتعرض للقص التدفق (4 داين/سم²). تم تعقب الخلايا تلقائياً مع MTrack2، والمسار الناتج الملفات كانوا مضافين على أفلام الهجرة الخلية لأي تدفق (0 داين/سم²) و (4 داين/سم²) لإظهار التوزيع والشكل من المسارات (الشكل 4 أ). ثم تم استيراد المسارات الخلية إلى أداة إنزيمية عبدي (ICT) لإنشاء مسار قطع كل فيلم (الشكل 4 باء). مؤشر متوسط الهجرة (تسمى "فميي" في تكنولوجيا المعلومات والاتصالات)، والسرعة، والاستقامة (تسمى "المباشرة" في تكنولوجيا المعلومات والاتصالات)، ومسافة الخط المستقيم (تسمى "مسافة إقليدية" في تكنولوجيا المعلومات والاتصالات) خلية من 4 أفلام كل منهما لكلا الشرطين حسبت في المسارات باستخدام الأمر "قياس القيم" أداة إنزيمية. ثم تم نسخ هذه القيم المتوسطة في "المنشور جرافباد" لتوليد الرسوم البيانية، وحساب الدلالة الإحصائية (الشكل 4).

رقم 1: يتنقلون MZB. (أ) نموذج من MZB جولات مكوكية بين منطقة هامشية والمسام في الطحال. مزبس تتطلب استيعاب S1PR1، مستقبل S1P، والوظيفية CXCR5، مستقبل تشيموكيني CXCL13، من أجل إدخال المسام. بالإضافة إلى ذلك، للوصول إلى المسام، يجب ترحيل مزبس ضد قوة تدفق الدم النابعة من المسام في الجيوب الأنفية الهامشية التي مظاريف المسام. إذا MZB أن يفقد الالتصاق المتكاملة-1، يجند للوكيل المحلي-1 إنتغرين، أنه يدفع إلى اللب الأحمر بقوة التدفق، مبالغ متزايدة من VCAM-1، يجند VLA-4، حيث لن تؤيد الهجرة. (ب) التدفق الخلوي النابضة الاستراتيجية لاختبار نقاء فرز مزبس استخدام أجسام مضادة ضد B220 و CD23 CD21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: إعداد دائرة النظام، مضخة، والمجهر، وحضانة فلويديكس. (أ) صورة من نظام مضخة (إيبيدي¹⁸) تتكون من مضخة مع وحدة متصلة فلويديكس وكمبيوتر محمول تشغيل البرنامج للتحكم في المضخة. أعلى تكبير الصورة: الشريحة تدفق الدائرة مع الدوائر تدفق 6، الأولى التي أرفقت بالأنابيب لوحدة فلويديكس. (ب) إعداد نموذجي لقياس تدفق الهجرة في المختبر من مزبس. مجهر مجهزة بتدفئة غرفة (الصندوق الأسود) الذي يحتوي على وحدة فلويديكس متصل بمضخة (كائن مربع أزرق على الجهة اليمنى السفلي من المجهر) خارج المجهر. أعلى تكبير الصورة: وحدة فلويديكس داخل المجهر تدفئة الغرفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: القياس الكمي لتصوير البيانات. صور الممثل (A) من إطار من فيلم لترحيل مزبس قبل (يسار) وبعد (يمين) العتبة الصورة لتحويل الخلايا إلى كائنات سوداء على خلفية بيضاء. تغيير حجم أشرطة في كلتا الصورتين تضخم منخفضة وعالية = 100 ميكرومتر-(ب) ترك الفريق: صورة إخراج النتائج النموذجية من البرنامج المساعد (إخراج عمود مفرد) MTrack2. اللوحة اليسرى: الصورة أداة إنزيمية عبدي والهجرة 2.0 بعد إدخال نتائج MTrack2 التي تظهر قطعة مسار ترحيل مزبس والقيم "قياس" عرض نافذة عرض المتوسطات للمعلمات بما في ذلك السرعة ومؤشر الهجرة (الصلة المباشرة أخضر مربعات)، من بين آخرين. تتضمن إعدادات المعايرة تبين حل ميكرومتر 1.14 كل بكسل بكسل وفاصل زمني من 5 s (0.083 دقيقة) لكل إطار الفيلم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: مثال للنتائج باستخدام البروتوكول لقياس يتنقلون MZB. (A) ممثل اللقطات من ترحيل مزبس مع تراكب مسارات من البرنامج المساعد إيماجيج "MTrack2 كيلوطن". ملاحظة: تم الألوان المسار تعسفاً من البرنامج المساعد "دليل تتبع" إيماجيج. تغيير حجم أشرطة في كلا insets تضخم منخفضة وعالية = 100 ميكرومتر. (ب) المسار الممثل مؤامرات لترحيل مزبس من أداة إنزيمية عبدي والهجرة 2.0. خطوط حمراء وخطوط سوداء تمثل مسارات الخلية التي تنهي تحت أو فوق المحور الأفقي، على التوالي. في (أ) و (ب): ترك، مزبس المهاجرة مع أي تدفق (0 داين/سم²)؛ الحق، مزبس يهاجرون إلى تدفق 4 داين/سم² . (ج) فهرس (فميي) الهجرة والسرعة والاستقامة (المباشرة) والمسافة مزبس المهاجرة مع أي تدفق (0 داين/سم²) أو تدفق (4 داين/سم²) (n = 4 الفئران في 4 تجارب منفصلة). أشرطة الخطأ = يعني ± التنمية المستدامة؛ اختبار t للطالب، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ملف إضافي 1: MTrack2_kt.java- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.  

Discussion

يصف لنا هنا طريقة لتحليل هجرة الخلايا التي كشف قوة تدفق القص والاستجابة عن طريق تغيير هجرتها. وأظهر تحليل مزبس أن مزبس ترحيل تلقائياً على المتكاملة-1 وبحضور التدفق، وسيتم ترحيل تدفق. في أعمالنا السابقة، واظهرنا أن مزبس لا يتم ترحيل تدفق على VCAM-1 ولكن بدلاً من ذلك تبقى ثابتة في مكانها. منطقة هامشية الطحال موريني يتضمن أساسا المتكاملة-1، في حين يتضمن اللب الأحمر المتكاملة-1 و VCAM-1. من هذه البيانات، فإنه يمكن أن يستدل عليها أن مزبس سوف يهاجر تدفق بينما في منطقة هامشية ولكن ليس في اللب الأحمر. تم التحقق من صحة التحليل في فيفو باستخدام مزبس مع الالتصاق المعيبة التي تم ميسلوكاليزيد إلى اللب الأحمر الطحال بقوة تدفق¹². لهذه الأسباب، تمثل مزبس عنصر تحكم إيجابية جيدة لاختبار تدفق الهجرة النظام المذكور هنا، حتى إذا تم استخدام النظام لدراسة نوع خلية مختلفة.

الجانب الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو ضمان الاتساق في خلية معالجة على الشريحة. لأن الجوانب القابلة للقياس الكمي للهجرة الخلية تعتمد على الدرجة التي تلتزم بها الخلايا إلى الشريحة، سيجعل أي نقصان للالتصاق الخلوي صعبة النتائج استنساخه. انخفاض الالتصاق الخلوي يمكن أن تنجم عن عدم الاتساق في عوامل متعددة، بما في ذلك درجات الحرارة من المخزن المؤقت الهجرة أو مربع حضانة ساخنة (الباردة يقلل التصاق)، مستويات الكاتيونات في تعليق خلية (الكاتيونات يؤثر ملزمة إنتغرين)، الشريحة المناولة (التنصت أو الثناء الشريحة يمكن إزاحة الخلايا)، والخلية الكثافة (التصادم بين الخلايا يمكن أن تؤثر على معلمات الهجرة). وتشمل النقاط الحساسة الأخرى أثناء الإجراء لا بيبيتينج المخزن المؤقت إلى الآبار الشريحة مع الكثير من القوة قبل ربط الأنابيب (كهذا يمكن أن يقلل من التصاق الخلية)، والحفاظ على الوقت اللازم للبروتوكول خطوات متسقة في كل تجربة ( خلية وقت تسوية يمكن أن تؤثر على التصاق). وباختصار، يجب أن يبقى أي تأثير ممكن على التصاق الخلايا ثابتاً في التكرار لإنتاج بيانات الهجرة الخلية يمكن الاعتماد عليها.

هذا الأسلوب السهل إقامة نظراً لأنها تستخدم المعدات المتاحة تجارياً واللوازم، وأي من الخطوات تتطلب تعليمات متقدمة. لتحليل MZB، فضلا عن أنواع الخلايا الأخرى مثل CD8 مثقف⁺ تي كافية لمراقبة الهجرة تدفق الخلايا، وطلاء الشرائح مع مختلف إنتغرين يغاندس. دراسة استجابة الناجمة عن تدفق الهجرة إلى مختلف إنتغرين يغاندس يؤدي إلى التعرف المباشر integrins النشطة على سطح الخلية، ربما تكشف عن الآليات ذات الصلة بوظائف المجراة في وصفها مع الهجرة MZB تدفق المتكاملة-1 ولكن لا VCAM-1. ومع ذلك، من الممكن أيضا إضافة طبقة خلايا بطانية إلى الدوائر تدفق. مثال واحد للهجرة الخلية المناعية التي تتأثر بتدفق القص هو التسرب خلية T من خلال طبقات بطانية³. وقد استخدم هذا الإجراء لكشف التنشيط التصاق الخلايا T عن طريق إينتيجرينس، وسيليكتينس، والمستقطبات، ونموذج اللمفاويات الهجرة عبر حاجز الدم في الدماغ. القيد الوحيد للخلايا التي يمكن تحليلها باستخدام هذا الأسلوب أنه يجب أن يكونوا قادرين على الشعور بقوة تدفق كإشارة الاتجاه.

على الرغم من أن يتم استخدام الطريقة المبينة هنا لوصف سلوك الخلوية مثل السرعة وتحول، فإنه يمكن تمديد أيضا لتحليل الجوانب الجزيئية للهجرة. سيكون المجمعات الجزيئية ذات الصلة بالهجرة الناجمة عن التدفق، بما في ذلك إينتيجرينس مثل الوكلاء-1 وعلى محولات سيتوسكيليتال، داخل 200 نيوتن متر سطح الشريحة، قابلة للتصور مع TIRF مجهرية. وسيكون هذا بالإضافة إلى الطريقة مثالية لدراسة الخلايا من الفئران مع حدوث طفرات في البروتينات إنتغرين أو سيتوسكيليتون ذات الصلة. كما يهاجر العديد من الخلايا المناعية في مختلف مراحل تنميتها من خلال تدفق الدم أو الليمفاوية، الهجرة في المختبر ووصف يمكن استخدامها لاختبار أنواع كثيرة من الكريات البيضاء مثقف أو الرئيسي لاستجابة لتدفق وتكشف كيف تكون الخلايا بشكل منهجي مبرمجة لترحيل في استجابة مناعية في الحية. وفي الختام، مقايسة الموصوفة هنا يوفر طريقة موثوق بها ومباشرة لتحليل الناجمة عن تدفق الهجرة من مزبس التي يمكن أن تشمل أيضا أنواع الخلايا الأخرى.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm	VWR	10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm	Miltenyi	130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit	Miltenyi	130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC	Biolegend	103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC	BD Biosciences	558658
CD23, clone B3B4, PE	Biolegend	101608
HBSS	Biochrom	L2035
D-PBS 1x	Gibco by Life Technologies	14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free	Roth	"0052.3"
ICAM-1	R&D Systems	796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated	Ibidi	80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm	Ibidi	10963
Ibidi Pump system	Ibidi	10902