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Immunology and Infection

Análise de cisalhamento induzida pelo fluxo de migração de murino Marginal Zone B células In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

Summary

Células B de zona marginal (MZBs) respondem à força de cisalhamento do fluxo por reorientar seu caminho de migração o fluxo. Este protocolo mostra como gravar e analisar a migração usando uma unidade de fluidics, bomba, sistema de imagem de microscópio e software livre.

Abstract

Células B de zona marginal (MZBs) são uma população de células B que residem nas zonas marginal esplênica rato que envolvem os folículos. Para alcançar os folículos, MZBs deve migrar da força de cisalhamento do fluxo de sangue. Apresentamos aqui um método para analisar essa migração de MZB fluxo induzido in vitro. Primeiro, MZBs são isolados do baço de rato. Em segundo lugar, MZBs são liquidadas no integrina ligands em slides de câmara de fluxo, expostos ao fluxo de cisalhamento e fotografadas sob um microscópio durante a migração. Em terceiro lugar, imagens de MZBs a migração são processadas usando a célula automática MTrack2 plugin de rastreamento para ImageJ, e as faixas de célula resultante são quantificadas utilizando a ferramenta de quimiotaxia Ibidi. Os dados de migração revelam quão rápido as células mover, quantas vezes eles mudam de direção, se o vetor de fluxo de distorção afeta sua direção de migração e quais integrina ligantes estão envolvidos. Embora nós usamos MZBs, o método pode ser facilmente adaptado para a análise de migração de qualquer leucócito que responde à força de cisalhamento do fluxo.

Introduction

Células do sistema imune são as células mais motile no organismo humano e muitas vezes têm que lidar com a força de cisalhamento do fluxo de sangue e da linfa. No entanto, existem relativamente poucos estudos sobre a migração induzida por força de cisalhamento de leucócitos1,2,3,4,5. Apresentamos aqui um protocolo confiável e quantitativo para analisar a resposta de uma célula imune ao fluxo in vitro. Realizar o ensaio não exige a fabricação de componentes, e todos os equipamentos e bens de consumo estão disponíveis comercialmente. O protocolo, incluindo análise de purificação e migração de células, pode ser executado em um único dia. Finalmente, embora descrevemos a migração de células B de zona marginal (MZBs), o protocolo pode ser adaptado para analisar a migração contra fluxo de outros tipos de células do sistema imunológico. Portanto, é possível usar este teste para analisar sistematicamente uma ampla gama de leucócitos com um painel abrangente das condições.

MZBs são uma população de células B que, no rato, são encontrados apenas no baço e no serviço de transporte entre o interior dos folículos e as zonas marginais6,7,8,9. A zona marginal é uma camada de células imunitárias aproximadamente 5 a 10 células grossas. A camada de células envolve o folículo e consiste principalmente de MZBs e macrófagos, mas também invariável naturais assassinos (iNKT) as células T, células dendríticas (DCs) e os neutrófilos, entre outros10. As células da zona marginal são expostas ao fluxo unidirecional de sangue provenientes de artérias esplênica que terminam em um seio marginal ao redor do folículo. O sangue flui de buracos no seio marginal através da zona marginal é coletado em seios venosos na polpa vermelha e restaurado para a circulação de11. O fluxo livre do sangue lava sobre os MZBs e expõe-los aos antígenos transportados no sangue. Os MZBs carregam o antígeno para o folículo por vaivém automaticamente entre a zona marginal e dentro do folículo, o que não é exposto ao sangue. Assim, como MZBs shuttle para o folículo, eles devem migrar da força de cisalhamento do fluxo de sangue12 (figura 1A).

Neste protocolo, descrevemos como determinar quantitativamente como imune as células tais como MZBs responder sem fluxo ou fluxo elevado in vitro, a fim de revelar como eles são programados para migrar em vivo. Na primeira etapa, MZBs são purificados de um baço de rato usando grânulos magnéticos acoplados aos anticorpos de kits disponíveis comercialmente. Os MZBs recentemente isoladas são introduzidos dentro do poço de um slide de câmara de fluxo, permitiu resolver para ligantes integrina e expostos ao fluxo de buffer de migração usando um sistema de bomba (Figura 2A). As células são fotografadas usando um sistema de Time-Lapse vídeo microscopia. As imagens são então processadas para análise com um plugin grátis ImageJ,13,MTrack214, para controlar automaticamente as células. Faixas em seguida podem ser quantificadas com o livre Ibidi quimiotaxia ferramenta15 para determinar vários parâmetros, incluindo velocidade, retidão e índice de migração. Estes valores podem ser usados para determinar os efeitos de inibidores de migração, estimuladores de célula, quimiocinas e outros produtos químicos que afetam a migração para a migração de cisalhamento-fluxo induzido a fim de compreender as forças que controla o movimento de células imunes in vivo.

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Protocol

Todos os experimentos envolvendo o uso de animais foram previamente aprovados pelo Landesverwaltungsamt Halle (Saxónia-Anhalt), Alemanha, em conformidade com todas as orientações da faculdade de medicina da Universidade OVGU de Magdeburg.

1. MZB célula purificação

  1. Isole os leucócitos.
    1. Sacrificar um 8 a 16 semanas de mouse e remover o baço16. Dissociar o baço em 5 mL de tampão de cela gelada [tampão fosfato salino (PBS) + 0,5% albumina de soro bovino livre de ácidos gordos (BSA)], usando um Dissociador de tecido ou suavemente esmagou o baço através de uma malha de filtro célula 70 µm em um poço em uma placa de 6 com o êmbolo de uma seringa de 5 mL.
    2. Transferi as células no buffer de pilha em um tubo cônico de 15 mL. Recolha pilhas adicionais adicionando outro 5 mL de tampão de cela gelada para o tubo de dissociador do tecido ou da malha de nylon no poço. O adicional 5 mL de buffer de pilha mais células de transferência para o tubo cônico. Centrifugar a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT, 20 ° C) e descartar o sobrenadante.
  2. Realize a lise de células vermelhas do sangue.
    1. Ressuspender o sedimento celular em 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) (150mm NH4Cl, 10mm KHCO3, EDTA 0,1 mM) que é pré-aquecido para RT. adicionar um adicional 1,5 mL de tampão de Lise RBC e agitar. Incube a RT (20 ° C) para um total de 2 min, incluindo o tempo necessário para Ressuspender o sedimento.
    2. Adicione 7,5 mL de tampão de cela gelada à suspensão para parar a lise celular. Centrifugar a 300 x g e 4 ° C por 10 min e descartar o sobrenadante.
    3. Ressuspender o sedimento celular em 1 mL de tampão de célula e adicionar um adicional 9 mL de tampão de célula. Pipete a suspensão de células de 10 mL através de um filtro de pré-separação de 30 µm para um novo tubo cônico de 15 mL para remover os resíduos de célula.
    4. Centrifugar as células em 300 x g e 4 ° C por 10 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular em 500 µ l de buffer de pilha. Não deixar células subsequentes em todas as etapas do procedimento até incubação nos slides de câmara de fluxo.
  3. Purifica MZBs.
    1. Adicione 50 µ l de anticorpos acoplados biotina de um kit disponível comercialmente contra todas as células indesejáveis, incluindo CD43 (em células não-B), CD4 (em células T), CD93 (em células B imaturas) e Ter119 (em eritrócitos), à suspensão de células em um tubo cônico. Agitar ou agite o tubo delicadamente para misturar, mas fazer não vórtice das células. Coloque o tubo cônico em uma cama de gelo em um ângulo de quase bemol e rock em 25 rpm por 15 min.
    2. Adicione grânulos magnéticos acoplados para anticorpos antibiotina em um volume total de 100 µ l da suspensão de células. Continue a agitar a suspensão de célula 25 rpm no gelo por 20 min. lavar as células pela adição de 5 mL de tampão de célula, centrifugação a 300 x g e 4 ° C por 10 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de tampão de célula.
    3. Empobrecem a suspensão celular das células magnética do grânulo-acoplados por mantê-los em uma coluna magnética. Descarte rotulado células (todas as células não-B e células B imaturas). Colete as células não-rotulados (células B maduras) em um tubo cônico de 15 mL que tenha sido previamente revestido com uma breve aplicação de 5 mL de tampão de célula, para evitar aderência específico por MZBs.
    4. Lave a suspensão de eritrócitos com 5 mL de tampão de célula. Centrifugar a 300 x g e 4 ° C por 10 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 90 µ l de buffer de pilha e adicionar 10 µ l de grânulos anti-CD23-acoplado. Suspensão de células de rocha suavemente no gelo por 20 min em 25 rpm.
    5. Lave a suspensão de eritrócitos com 5 mL de tampão de célula. Centrifugar a 300 x g e 4 ° C por 10 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de tampão de célula.
    6. Empobrecem a suspensão celular das células magnética do grânulo-acoplados por mantê-los em uma coluna magnética. Descarte as pilhas etiquetadas (células foliculares de B). Colete as células não-rotulados (MZBs), em um tubo cônico de 15 mL que foi previamente revestido com uma breve aplicação de 5 mL de tampão de célula. Remova 50 µ l de células para contagem e verificação de pureza.
  4. Manche as MZBs classificadas para verificar a pureza.
    1. Adicione 10% volume (5 µ l) do bloco Fc a 10.000 células em 50 µ l e incubar a 4 ° C por 5 min. Adicione 50 µ l de tampão de célula contendo 0.3 μL de cada de B220-FITC (0,15 µ g), CD21-PE (0,06 µ g) e CD23-APC (0,06 µ g) em um volume total de 105 µ l (1:350 cada anticorpo diluído) , ou qualquer outra combinação de fluorophores para distinguir entre células foliculares B e MZBs. mancha as células a 4 ° C, no escuro por 15 min.
    2. Lave as células coradas com 1 mL de tampão de célula. Centrifugar a 300 x g e 4 ° C por 5 min e descartar o sobrenadante. Resuspenda em 300 µ l de buffer de pilha e adquirir amostras usando um citômetro de fluxo e métodos padrão. Portão em linfócitos ao vivo, em seguida, B220+ células e finalmente na CD23baixa CD21alta células (figura 1B).
      Nota: O procedimento normalmente produz 500.000 MZBs por baço de um rato de C57B/6.
  5. Prepare-se para a migração de fluxo MZBs.
    1. Lavagem purified MZBs uma vez em 1-2 mL de tampão de migração frio [Hanks equilibrado cátions contendo de solução salina (HBSS), 10 mM Hepes, 0,2% de ácidos gordos livres BSA] para assegurar que o buffer de migração que contém o cátion não é diluído por residual tampão PBS cátion livre. Centrifugar a 300 x g e 4 ° C por 10 min e descartar o sobrenadante. Re-suspenda MZBs no buffer de migração frio a uma concentração de 50.000 MZBs por 30 µ l (equivalente ao montante carregado em um poço de um slide de câmara de fluxo).
      Nota: Os MZBs recentemente isolados devem ser usados logo que possível. No entanto, eles são ainda capazes de migrar por até 8 h ou mais após o início do experimento para contanto que são mantidos no gelo. Temperaturas ideais devem ser testadas para outros tipos de células. Por exemplo, pode ser melhor manter pilhas de T cultivadas a 37 ° C até o início da migração.

2. fluxo de experiência

  1. Slides de casaco com ligante de integrina.
    1. No dia antes do experimento, descongelar uma alíquota de ICAM-1 (400 µ g/mL). Dilua o ICAM-1 por um fator de 1:80 em PBS para atingir uma concentração final de 5 µ g/mL. Adicione 30 µ l de ICAM-1 para uma câmara em um slide de fluxo para cada filme de migração necessária. Incube o slide em uma câmara húmida a 4 ° C durante a noite.
      Nota: Cada slide contém 6 câmaras e até 8 filmes em uma sessão pode ser facilmente gravada.
  2. Bloquear os Poços revestidos.
    1. No dia do experimento, lave a câmara adicionando 100 µ l de PBS a um poço e retirar 100 µ l do outro poço da câmara. Adicionar 100 µ l de tampão de bloqueio (2% BSA livre de ácidos gordos em PBS) para uma câmara e incubar o slide em uma câmara úmida em RT para 1,5 h.
    2. Lave a câmara adicionando-se 100 µ l de PBS a um poço, retirar o outro bem e, em seguida, adicionar 100 µ l de tampão de migração para a câmara. Armazene os slides em uma câmara úmida em RT até o experimento.
  3. Prepare a unidade fluidics.
    1. Conecte uma bomba de fluido, anexar a unidade fluidics e ativar o software de bomba. Lavar o tubo de uma vez com 5 a 10 mL de tampão de migração, em seguida, adicionar 11,7 mL de tampão de migração igualmente a ambos os reservatórios e remover as bolhas de ar.
    2. Prenda o tubo de cerca de 10 cm a partir da peça de ligação. Coloque a unidade fluídico em incubadora aquecida no microscópio.
    3. Defina a opção de slide de "µ-slide VI 0.4" e ao tubo para "branco" no software. Defina a tensão de cisalhamento desejado (por exemplo, 4 dyn cm-2). Defina o tempo de geração de imagens a 30 min.
    4. Defina o fator de calibração de tubos, determinando a taxa de fluxo através do tubo em mL/min. medida o tempo necessário para 2 mL de tampão de fluir de um reservatório do outro e dividir por 2. Fazer pelo menos 4 medições de precisão. Use a taxa de fluxo real para definir a taxa de fluxo desejada e tensão de cisalhamento, inserindo os valores no software da bomba.
  4. Prepare o sistema da imagem latente.
    1. Pré-aquecer a câmara de incubação do microscópio, fluidics unidade e alíquotas de tampão de migração a 37 ° C (Figura 2B). Teste a bomba fluídico, garantindo que o buffer de migração e para trás dos fluxos em reservatórios e que não há nenhum ar bolhas no sistema.
  5. Carrega as pilhas no slide.
    1. Limpe a parte inferior do slide com um tecido embebido em álcool etílico. Adicionar 30 µ l de suspensão de células em um poço da câmara e retirar 30 µ l do outro poço. Incube o slide com uma tampa para evitar a evaporação, a 37 ° C por 30 min permitir que as células anexar.
    2. Lentamente adicione o buffer de migração pré-aquecido a cada poço do slide câmara fluxo até um menisco positivo levanta-se fora do poço e remover quaisquer bolhas de ar com a ponta da pipeta.
  6. Anexe o slide para a unidade de fluidics.
    1. Fixe a corrediça para a fase de microscópio. Retire a peça de ligação do lado não marcado da tubulação fluídico e encher o fim com buffer de migração até um menisco positivo sem bolhas de ar se levanta do final.
    2. A extremidade do tubo ao longo da aleta e inseri-lo dentro do poço superior da câmara de fluxo, limpando o buffer derramado com um lenço de papel. Mantendo o tubo pinçado, repita o procedimento para a marcado das extremidades do tubo.
  7. As células da imagem.
    1. Mude o sistema de imagem para "Live" para definir o foco sobre as células. Selecione um campo de visão que está no meio do slide. De foco as células ligeiramente para realçar o contorno preto da célula e para produzir um interior branco, que pode então ser thresholded para uma forma redonda celular preto sobre um fundo branco para uso com um programa de rastreamento automatizado.
    2. Inicie o programa de sequência de imagem e registro 1 imagem a cada 5 s para 30 min usando o 10x objectivo seco. Remova a braçadeira do tubo e ligar a bomba, em seguida, as células não-aderentes não vão sair e células aderentes começará a migrar. Imagem por 30 min ou mais usando um 10 x objetivo ou superior, conforme desejado. Rotular e salvar o filme.
  8. Desconecte a unidade fluídico do slide.
    1. No final do programa de geração de imagens, redefinir a bomba para o próximo experimento: volte a colocar a braçadeira para o tubo, remover o tubo de slide, volte a colocar a peça de ligação, abra o grampo e use o controle manual da bomba para empurrar vários mL de tampão de uma reserv OIR para o outro para remover as bolhas de ar. Volte a colocar a braçadeira e coloque o tubo preso na fase de microscópio para o próximo filme.
      Nota: O protocolo pode ser pausado indefinidamente aqui. Se usando um inibidor ou modificador de migração celular, dependendo do seu modo de ação, adicioná-lo à suspensão de qualquer célula antes de se estabelecer na câmara de migração ou para o buffer de migração na unidade fluídico.

3. migração faixa análise

Nota: As células podem ser rastreadas automaticamente usando o plugin MTrack2 ou manualmente usando o plugin de controle Manual17. Automático de controle funciona bem com MZBs porque estas células são principalmente redondas e permanecem assim durante a migração, facilitando a limiar a imagem das células para objetos pretos em um fundo branco. Rastreamento automático é mais difícil se outros tipos de células são utilizados, tais como culta, ativadas as células T CD8 +, porque estas células estendem durante a migração e tornar-se um pouco transparentes, tornando-se difícil definir as bordas. Neste caso, ou (1) as células podem ser manchadas com uma tintura fluorescente intra vital para produzir imagens que podem ser thresholded para mostrar objetos pretos sobre um fundo branco, ou (2) outros programas para delinear as células, tais como a deteção de segmentação e/ou borda de imagem pode ser usado. Controle manual é uma opção útil ao produzir uma imagem de alto contraste de contornos de célula não é possível.

  1. Execute o controle manual, usando o plugin.
    1. Instalar o plugin "Controle Manual" no ImageJ e abrir o filme no ImageJ. No menu "Controle Manual", selecione "Adicionar nova faixa". Clique no centro de uma célula, enquanto a filme avança automaticamente frame-por-frame. Quando a célula tiver sido selecionada em todos os quadros, selecione "Adicionar nova faixa" para começar a seguir uma nova célula.
    2. Depois que as faixas foram registadas, copie os resultados de saída em uma planilha de dados. Altere o formato para exibição de decimal para todas as células da planilha para zero lugares depois da vírgula decimal. Salve o arquivo como um arquivo. txt "guia parar separada" para posterior análise.
      Nota: Normalmente, 50 – 100 células são controladas, que leva cerca de 1h para completar para um filme de 20 min de cerca de 240 frames.
  2. Execute o rastreamento automático usando o plugin MTrack2. Baixe e instale o plugin de kt MTrack2 de acordo com as instruções no arquivo (veja arquivo de codificação suplementar).
    1. Limite as imagens do filme de migração celular. Abra a pilha de imagem no ImageJ. Processo as imagens no ImageJ para converter o vídeo de cor para imagens de alto contraste, mostrando as células como objetos pretos em um fundo branco (Figura 3A).
      1. Afiar as imagens duas vezes, as imagens de remoção de manchas e converter as imagens de 8 bits. Selecione a "imagem | colocar e ajustar o brilho/contraste"sub menu do controle deslizante contraste no máximo contraste e, em seguida, as células aparecerá como objetos brancos sobre um fundo preto. Selecione a "imagem | ajustar o limite de"sub-menu para garantir que as células aparecem como objetos pretos em um fundo branco.
    2. Executar a célula automática rastreamento plugin "MTrack2 kt" (consulte o Arquivo de codificação suplementar). Defina os seguintes parâmetros na tela de opções.
      1. Defina o tamanho de partícula mínimo em 1 pixel e o tamanho de partícula máximo 30 pixels para MZBs.
      2. Para velocidade (distância máxima entre 2 partículas em quadros sucessivos do filme), se a densidade celular do slide é alta, defina esse valor baixa para evitar ter a faixa "saltar" de uma célula para outra. Para MZBs, defina esse valor de 10 pixels para capturar exceções, embora MZBs geralmente não excederá 2 pixels em quadros sucessivos que são 5 s separados.
      3. O número mínimo de frames que uma partícula tem que estar presente para ser rastreado, fixado para esse valor no número de quadros no filme para MZBs (por exemplo,, 240) para um filme de 20 min com 12 frames/min. No entanto, se as células são rápidas o suficiente para deixar o campo de visão antes do final da imagem, em seguida, defina o número mínimo de frames em menos do que a duração do filme. Por exemplo, com as células T em movimento rápido, defina o número mínimo no equivalente de 5-10 min de imagem.
        Nota: Gravar uma macro dessas etapas (limiarização e MTrack2-kt) para automatizar esta parte do processo e economizar tempo (consulte o Arquivo de codificação suplementar). Usando a macro rastrear automaticamente um filme no ImageJ leva menos de um minuto.
    3. Copie os resultados de saída em uma planilha de dados. Altere o formato para exibição de decimal para todas as células da planilha para zero lugares depois da vírgula decimal. Adicionar uma linha vazia no topo das faixas célula na planilha e exclua a coluna "D". Salve o arquivo como um arquivo. txt "guia parar separada" para posterior análise na ferramenta Ibidi quimiotaxia.
      Nota: O plugin MTrack2 saídas as faixas de células em linhas de 75 colunas paralelas. Para análise na ferramenta Ibidi quimiotaxia, as faixas de célula devem ser em uma única coluna. Para converter a saída, o plugin MTrack2 foi modificado para saída ou no formato original ou como uma única coluna (Figura 3B) (consulte o Arquivo de codificação suplementar "kt MTrack2", que é escrito em Java). Copie o arquivo. java para a pasta de plugins do ImageJ. No ImageJ, selecione "Plugins > compilar e executar". Reinicialização do ImageJ e a versão modificada do MTrack2 devem aparecer no menu Plugins.
  3. Para analisar faixas de célula com a ferramenta Ibidi quimiotaxia, baixar o v 2.0 Ibidi quimiotaxia e ferramenta de migração ("stand alone") e abrir o programa.
    1. Selecione "Importar dados" e navegue para os arquivos de faixa de célula. txt. Vários arquivos podem ser selecionados ao mesmo tempo. Os arquivos importados aparecem no painel "Conjuntos de dados" em vermelho. Selecione todos eles e digite os valores corretos no menu "Inicialização" abaixo para aplicar as configurações a seguir.
    2. Digite o número exato ou um intervalo do número de fatias (o número de quadros no filme).
    3. No menu de calibração (X / Y calibração), digite o tamanho de um pixel. Localize essas informações no arquivo de propriedades do filme. Para MZBs, utilizou-se um objectivo de 10x, dando um tamanho de pixel de 1.14 µm. No "menu de calibração | Intervalo de tempo", digite o período de tempo entre os quadros no filme.
    4. Aplique as configurações. Selecione "Plotar dados" para ver os terrenos de faixa e confirmar que os arquivos de faixa serão aberto. A partir daí, muitas opções estão disponíveis, que são descritas na documentação para o programa, incluindo a marcar as faixas com cores diferentes, com base em propriedades diferentes e exibindo os valores individuais ou médios para velocidade, encaminhar migração índice, franqueza e mais (Figura 3B).
      Nota: Os MZBs leva cerca de 10 min para detectar e responder ao fluxo, presumivelmente por seus complexos de integrina ao ponto da célula de fluxo para a frente de polarização. Um gráfico de índice de migração ao longo do tempo vai mostrar uma queda inicial abaixo de zero, correspondente ao primeiro par de minutos que a célula é exposta ao fluxo, seguido por um aumento gradual para cima até que os valores de índice de migração para a frente são positivos. Assim, pode ser ideal para excluir estes primeiros minutos nos cálculos de final, a menos que este processo seja de interesse.

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Representative Results

Usamos o protocolo descrito acima, para comparar a migração de MZBs em slides de ICAM-1-revestido sem fluxo (0 dyn/cm2) e exposto para distorcer o fluxo (4 dyn/cm2). As células foram rastreadas automaticamente com MTrack2 e a faixa resultante arquivos foram sobrepostos sobre os filmes de migração celular de nenhum fluxo (0 dyn/cm2) e (4 dyn/cm2) para mostrar a distribuição e a forma das faixas (Figura 4A). Faixas de célula então foram importadas para a ferramenta de quimiotaxia Ibidi (TIC) para gerar lotes de pista de cada filme (Figura 4B). O índice médio de migração (chamado "FMIy" em TIC), velocidade, retidão (chamado de "franqueza" em TIC) e distância em linha reta (chamada de "Distância euclidiana" em TIC) de célula faixas de 4 filmes, cada um para ambas as condições foram calculados na Ferramenta de quimiotaxia usando o comando "valores medidos". Esses valores médios foram então copiados para GraphPad Prism para gerar gráficos e cálculo de significância estatística (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: MZB shuttling. (A) modelo de MZB vaivém entre a zona marginal e o folículo no baço. MZBs necessitam de internalização da S1PR1, um receptor para S1P e CXCR5 funcional, um receptor do chemokine CXCL13, para entrar o folículo. Além disso, para alcançar o folículo, MZBs deve migrar contra a força do fluxo de sangue proveniente dos poros no seio marginal que envolve o folículo. Se um MZB perde aderência a ICAM-1, o ligante para integrina LFA-1, ele é empurrado para a polpa vermelha pela força do fluxo, onde uma quantidade aumentada de VCAM-1, o ligante para VLA-4, não iria apoiar a migração. (B) citometria de fluxo, retenção de estratégia para testar a pureza do classificados MZBs usando anticorpos contra B220, CD23 e CD21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: instalação da câmara de incubação, bomba, microscópio e sistema de fluidics. (A) imagem do sistema de bomba (Ibidi18) consistindo de uma bomba com unidade conectada fluidics e laptop rodando o software para controlar a bomba. Imagem de ampliação mais elevada: o slide de câmara de fluxo com 6 câmaras de fluxo, o primeiro dos quais é anexado para a tubulação da unidade fluidics. (B) configuração típica para medir in-vitro migração de MZBs contra o fluxo. Um microscópio equipado com uma câmara de aquecimento (caixa preta) que contém a unidade fluidics ligado a uma bomba (objeto quadrado azul para o canto inferior direito do microscópio), fora o microscópio. Imagem de ampliação mais elevada: a unidade de fluidics dentro o microscópio, câmara de aquecimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: quantificação de dados de imagem. (A) de imagens representativas de um frame de um filme de migração MZBs antes (esquerda) e depois (direita) limiarização da imagem para converter as células em objetos pretos sobre um fundo branco. Bares em ambas as imagens de baixa e alta ampliação de escala = 100 µm. (B) painel esquerdo: imagem de saída de resultados típicos do plugin MTrack2 (saída única coluna). Painel direito: imagem da ferramenta após a entrada de MTrack2 resultados mostrando uma trama de faixa de migração MZBs e um "valores medidos" exibem janela mostrando as médias dos parâmetros, incluindo velocidade, índice de migração e franqueza (Ibidi quimiotaxia e migração 2.0 caixas verdes), entre outros. Configurações de calibração mostradas incluem a resolução de pixel de 1.14 µm por pixel e um intervalo de tempo de 5 s (0,083 min) por quadro de filme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: exemplo de resultados usando o protocolo para medir MZB shuttling. (A) representante alambiques de migração MZBs com uma sobreposição de faixas do ImageJ plugin "MTrack2 kt". Nota: as cores da faixa foram arbitrariamente definidas pelo "Controle Manual" plugin para ImageJ. Bares em ambas as inserções de baixa e alta ampliação de escala = 100 µm. (B) faixa representativa parcelas de migração MZBs da ferramenta Ibidi quimiotaxia e migração 2.0. Linhas vermelhas e linhas pretas representam faixas de célula que encerrar abaixo ou acima do eixo horizontal, respectivamente. Em (A) e (B): à esquerda, MZBs, migrando com nenhum fluxo (0 dyn/cm2); direito, MZBs, migrando para um fluxo de2 4 dyn/cm. (C) índice (FMIy), velocidade, retidão (franqueza) e distância para MZBs migrando com não migração (0 dyn/cm2) de fluxo ou fluxo (4 dyn/cm2) (n = 4 ratos em 4 experimentos separados). Barras de erro = média ± SD; Teste t de Student, * p < 0,01, * * * p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: MTrack2_kt.java. Clique aqui para baixar este arquivo.  

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Discussion

Descrevemos aqui um método para analisar a migração de células que a força de cisalhamento do fluxo de detectar e responder, alterando sua migração. Uma análise de MZBs mostrou que MZBs migrar espontaneamente no ICAM-1 e na presença de fluxo, migrará o fluxo. No nosso trabalho anterior, mostramos que MZBs não migrar o fluxo na VCAM-1, mas em vez disso, permanecem fixos no lugar. A zona marginal esplênica murino contém principalmente a ICAM-1, enquanto a polpa vermelha contém ICAM-1 e VCAM-1. A partir desses dados, pode deduzir-se que MZBs iria migrar o fluxo enquanto na zona marginal, mas não na polpa vermelha. A análise foi validada em vivo usando MZBs com adesão defeituosa que foram mislocalized para a polpa vermelha esplênica pela força do fluxo12. Por estas razões, MZBs representam um bom controle positivo para testar o sistema de migração de fluxo descrito aqui, mesmo se o sistema é usado para estudar um tipo de célula diferente.

O aspecto mais importante do processo é garantir a coerência na célula manipulação no slide. Porque os aspectos quantificáveis da migração celular dependem do grau ao qual as células aderem ao slide, qualquer diminuição da adesão celular dificultaria resultados reprodutíveis. Diminuição da adesão celular pode resultar de inconsistência em múltiplos fatores, incluindo temperaturas de buffer de migração ou a caixa de incubação aquecida (frio reduz a adesão), níveis de cátions na suspensão de célula (cátions afetam a ligação integrina), Deslize a manipulação (batendo ou flexionando o slide poderia deslocar células) e densidade da pilha (colisões entre células poderiam afetar parâmetros de migração). Outros pontos sensíveis durante o procedimento incluem não pipetar o buffer nos poços com demasiada força antes de anexar o tubo (como isto poderia reduzir a adesão celular) e manter o tempo necessário para as etapas do protocolo consistentes em cada experimento (slide tempo de acomodação de célula poderia afetar adesão). Em resumo, qualquer possível influência na aderência de célula deve ser mantida consistente ao longo de repetições para produzir dados de migração celular confiável.

Esse método é fácil de configurar, já que ele usa equipamento comercialmente disponível e suprimentos e nenhuma das etapas exigem instrução avançada. Para análise de MZB, bem como outros tipos de célula como CD8 culta+ T células, revestindo os slides com vários ligantes integrina são suficientes para observar a migração o fluxo. Estudando a resposta induzida pelo fluxo de migração para vários ligantes integrina leva a identificação directa das integrinas ativas na superfície da pilha, possivelmente revelando mecanismos relevantes para funções em vivo como com migração MZB o fluxo no ICAM-1, mas não VCAM-1. No entanto, também é possível adicionar uma camada de células endoteliais para as câmaras de fluxo. Um exemplo de migração de células imunes que é afetado pelo fluxo de cisalhamento é o extravasamento de células T através de de camadas endoteliais3. Este procedimento foi usado para desvendar a ativação de célula T adesão através de integrinas, selectinas e quimiocinas e à migração de linfócitos modelo através da barreira hemato - encefálica. A única limitação para as células que podem ser analisadas com esse método é que eles devem ser capazes de sentir a força do fluxo, como um sinal direcional.

Embora o método descrito aqui é usado para caracterizar o comportamento celular, tais como a velocidade e o giro, ele também pode ser estendido para análise dos aspectos moleculares da migração. Complexos moleculares relevantes para migração induzida por fluxo, incluindo integrinas como LFA-1 e seus adaptadores do citoesqueleto, estaria localizados dentro de 200 nM da superfície do slide, passível de visualização com microscopia TIRF. Esta adição ao método seria o ideal para o estudo de células de camundongos com mutações em proteínas integrinas ou citoesqueleto relacionadas. Como muitas células imunes migram em várias fases no seu desenvolvimento através de fluxos de sangue ou linfa, a migração em vitro descrita pode ser usada para testar sistematicamente a muitos tipos de leucócitos cultivados ou primários de resposta ao fluxo e revelam como as células são programado para migrar em uma resposta imune in vivo. Em conclusão, o ensaio descrito aqui fornece um método simples e confiável para a análise de migração induzida pelo fluxo de MZBs que também pode ser estendido para outros tipos de células.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por concessões do "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 para K.-D.F.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

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References

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Tags

Imunologia e infecção edição 141 células B zona marginal migração fluxo de cisalhamento integrinas adesão molécula de adesão-1 (VCAM-1) de células de adesão intercelular molécula-1 (ICAM-1) vascular
Análise de cisalhamento induzida pelo fluxo de migração de murino Marginal Zone B células In Vitro
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Tedford, K., Tech, L., Steiner, M.,… More

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. D. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

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