Analys av skjuvning flöde-inducerad Migration av murin marginella zon B-celler In Vitro

Summary

Marginella zon B celler (MZBs) svarar på styrkan av skjuvning flöde genom att omorientera sina migreringssökväg upp flödet. Detta protokoll visar hur att registrera och analysera migreringen med hjälp av en flödesteknik enhet, pump, Mikroskop bildsystem och fri programvara.

Abstract

Marginella zon B celler (MZBs) är en population av B-celler som finns i de mus mjälten marginella zoner som omsluter folliklar. För att nå hårsäckarna, måste MZBs migrera upp tvärkraften av blodflödet. Vi presenterar här en metod för att analysera detta flöde-inducerad MZB migration in vitro. Första är MZBs isolerade från mus mjälte. MZBs är andra bosatte sig på integrin ligander i flow avdelningen bilder, utsatt om du vill skeva flöde och avbildas i Mikroskop medan migrera. Tredje, bilder av de migrerar MZBs bearbetas med cellen MTrack2 automatisk spårning plugin för ImageJ, och de resulterande cellen spår kvantifieras med hjälp av verktyget Ibidi Kemotaxis. Migreringsdata avslöja hur snabbt flytta cellerna, hur ofta de ändrar riktning, om skjuvning flöde vektorn påverkar deras migration riktning och som integrin ligander är inblandade. Även om vi använder MZBs, kan metoden enkelt anpassas för att analysera migration av alla leukocyter som svarar på styrkan av skjuvning flöde.

Introduction

Immuncellerna är de mest motila cellerna i människokroppen och ofta måste brottas med tvärkraften från blod och lymfa flödet. Men finns det förhållandevis få studier om shear kraft-inducerad migration av leukocyter^1,2,3,4,5. Vi presenterar här ett tillförlitliga och kvantitativa protokoll för att analysera en immunceller reagerar på flödet in vitro. Utför analysen kräver inte tillverkning av komponenter och all utrustning och förbrukningsvaror är kommersiellt tillgängliga. Protokollet, inklusive cell rening och migration analys, kan utföras på en enda dag. Slutligen, även om vi beskriver migrering av marginella zon B-celler (MZBs), protokollet kan anpassas för att analysera migration mot flödet av andra typer av immunceller. Därför är det möjligt att använda denna analys att systematiskt analysera ett stort antal leukocyter med en heltäckande panel av villkor.

MZBs är en population av B-celler som i musen, finns bara i mjälte och transfer mellan insidan av folliklar och den marginella zoner^6,7,8,9. Den marginella zon är ett lager av immunceller cirka 5 – 10 celler tjocka. Celllagrar omsluter hårsäcken och består främst av MZBs och makrofager men också invariant naturliga killer (iNKT) celler, dendritiska celler (DCs) och neutrofiler, bland annat¹⁰. Cellerna i den marginella zon utsätts för enkelriktad blodflödet med ursprung från mjälten artärer som avslutar i en marginell sinus som omger follikeln. Blodet rinner från hål i marginell sinus genom den marginella zon och sedan samlas i venös bihålor i röda massan och återställas till omsättning¹¹. Gratis-flödet av blod sköljer över MZBs och utsätter dem för antigener som transporteras i blodet. MZBs bär antigenet i follikeln genom shuttling automatiskt mellan den marginella zon och inuti follikeln, som inte utsätts för blod. Således som MZBs flygplatstransfer mot follikeln, måste de migrera upp tvärkraften av blod flöde¹² (figur 1A).

I detta protokoll, beskrivs hur man kvantitativt bestämma hur immunsystemet celler som MZBs besvara antingen inget flöde eller högt flöde in vitro-, för att avslöja hur de är programmerade för att migrera in vivo. I det första steget renas MZBs från en mus mjälte med magnetiska pärlor kopplat till antikroppar från kommersiellt tillgängliga kit. De färska isolerad MZBs är införs i brunnen av en flöde kammare bild, får sedimentera på integrin ligander och utsätts för flödet av migration buffert med ett pumpsystem (figur 2A). Cellerna är avbildade med hjälp av en time-lapse video mikroskopi system. Bilderna bearbetas sedan för analys med en gratis ImageJ plugin, MTrack2^13,14, att automatiskt spåra cellerna. Spår kan då kvantifieras med gratis Ibidi Chemotaxis verktyg¹⁵ att bestämma olika parametrar inklusive hastighet, rakhet och migration index. Dessa värden kan användas för att avgöra effekterna av migration-hämmare, cell stimulatorer, chemokiner och andra migration-påverkar kemikalier för skjuvning-flöde inducerad migration för att förstå de krafter som styr immunceller rörelse i vivo.

Protocol

Alla experiment som inbegriper användning av djur har tidigare godkänts av den Landesverwaltungsamt Halle (Sachsen-Anhalt), Tyskland, i enlighet med alla riktlinjer för medicinska fakulteten för Magdeburgs OVGU universitet.

1. MZB Cell rening

1. Isolera leukocyter.
   1. Offra en 8 till 16 veckor gamla mus och ta bort mjälten¹⁶. Separera mjälte i 5 mL iskallt cell buffert [fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 0,5% fettsyra-fri bovint serumalbumin (BSA)], genom att antingen använda en vävnad dissociator eller försiktigt mosa mjälte genom en 70 µm cell SIL mesh i en brunn på en 6-well platta med kolven från en 5 mL spruta.
   2. Överföra cellerna i cell buffert i en 15 mL koniska rör. Samla in ytterligare celler genom att lägga till ytterligare 5 mL iskallt cell buffert vävnad dissociator röret eller nylon mesh i brunnen. Överföra de ytterligare 5 mL av cell buffert plus celler till konisk röret. Centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid rumstemperatur (RT, 20 ° C) och Kassera supernatanten.
2. Utföra röd blod cell lysis.
   1. Återsuspendering cellpelleten i 1 mL av röda blodkroppar (RBC) lyseringsbuffert (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA) som är pre värmde RT. Lägg ytterligare 1,5 mL RBC lyseringsbuffert och snurra för att blanda. Inkubera vid RT (20 ° C) för sammanlagt 2 min, inklusive den tid som krävs för att resuspendera pelleten.
   2. Lägga till 7,5 mL iskallt cell buffert cellsuspensionen att stoppa Lys. Centrifugera vid 300 x g - och 4 ° C i 10 min och Kassera supernatanten.
   3. Återsuspendering cellpelleten i 1 mL av cell buffert och lägga till ytterligare 9 mL av cell buffert. Överför med pipett 10 mL cellsuspension genom ett 30 µm före separation filter till en ny 15 mL koniska tub ta bort cellfragment.
   4. Centrifugera celler på 300 x g - och 4 ° C i 10 min och kasta bort supernatanten. Återsuspendering cellpelleten i 500 µL cell buffert. Hålla celler kalla på alla efterföljande steg av förfarandet tills inkubation i flödet kammare bilderna.
3. Rena MZBs.
   1. Tillsätt 50 µL av biotin-kopplade antikroppar från ett kommersiellt tillgängliga kit mot alla oönskade celler, inklusive CD43 (på icke-B-celler), CD4 (på T-celler), CD93 (på omogna B-celler) och Ter119 (på erytrocyter), att cellsuspensionen i ett koniskt rör. Skaka eller snärta röret försiktigt för att blanda, men gör inte vortex cellerna. Låg konisk röret på en bädd av is nästan platt vinkel och rock på 25 rpm i 15 min.
   2. Lägg till magnetiska pärlor kopplat till anti biotin antikroppar i en total volym av 100 µL till cellsuspension. Fortsätta att klippa cellsuspension vid 25 rpm på is för 20 min. Tvätta cellerna genom att lägga 5 mL cell buffert, centrifugering vid 300 x g och 4 ° C i 10 min, och kasta bort supernatanten. Resuspendera cellerna i 1 mL av cell buffert.
   3. Bryter ned cellsuspensionen magnetiska-pärla-kopplade celler genom att behålla dem på en magnetisk kolumn. Kassera märkt celler (alla icke-B-cellerna och omogna B-celler). Samla in icke-märkt cellerna (mogna B-celler) i en 15 mL konisk slang som har funnits före belagda med ett kort program med 5 mL cell buffert, för att förhindra icke-specifik vidhäftning av MZBs.
   4. Tvätta cellsuspension med 5 mL cell buffert. Centrifugera vid 300 x g - och 4 ° C i 10 min och Kassera supernatanten. Resuspendera cellerna i 90 µL cell buffert och tillsätt 10 µL anti-CD23-kopplade pärlor. Rock cellsuspension försiktigt på is i 20 min vid 25 rpm.
   5. Tvätta cellsuspension med 5 mL cell buffert. Centrifugera vid 300 x g - och 4 ° C i 10 min och Kassera supernatanten. Resuspendera cellerna i 1 mL av cell buffert.
   6. Bryter ned cellsuspensionen magnetiska-pärla-kopplade celler genom att behålla dem på en magnetisk kolumn. Kassera de märkta cellerna (follikulärt B-celler). Samla in icke-märkt cellerna (MZBs), i en 15 mL konisk slang som pre har belagts med ett kort program med 5 mL cell buffert. Ta bort 50 µL av cellerna för inventering och kontrollera renhet.
4. Färga de sorterade MZBs att kontrollera för renhet.
   1. Tillsätt 10% volym (5 µL) Fc block till 10.000 celler i 50 µL och inkubera vid 4 ° C i 5 min. Tillsätt 50 µL av cell buffert innehållande 0,3 µL varje B220-FITC (0,15 µg), CD21-PE (0,06 µg), och CD23-APC (0,06 µg) i en total volym på 105 µL (varje antikropp utspädd 1:350) , eller någon annan kombination av fluorophores för att skilja mellan follikulärt B-celler och MZBs. fläcken cellerna vid 4 ° C i mörker i 15 min.
   2. Tvätta de färgade cellerna en gång med 1 mL av cell buffert. Centrifugera vid 300 x g- och 4 ° C i 5 min och Kassera supernatanten. Återsuspendera i 300 µL av cell buffert och förvärva prover med hjälp av en flödescytometer och standardmetoder. Gate på levande lymfocyter, sedan på B220⁺ celler, och slutligen på CD23^låg CD21^hög celler (figur 1B).
      Obs: Förfarandet ger normalt 500 000 MZBs per mjälte från en C57B/6 mus.
5. Förbereda MZBs för flöde migrering.
   1. Tvätta renat MZBs en gång i 1 – 2 mL kall migration buffert [Hanks balanserad saltlösning (HBSS) som innehåller katjoner, 10 mM Hepes, 0,2% fettsyra-fri BSA] för att säkerställa att innehållande migration bufferten inte försvagas av kvarvarande katjon-fri PBS-bufferten. Centrifugera vid 300 x g - och 4 ° C i 10 min och Kassera supernatanten. Återsuspendering MZBs i kall migration buffert till en koncentration av 50 000 MZBs per 30 µL (motsvarar det belopp som lastas i en brunn av en flöde kammare bild).
      Obs: De färska isolerade MZBs bör användas så snart som möjligt. De är dock fortfarande kan migrera för upp till 8 h eller mer efter i början av experimentet för så länge de hålls på is. Optimala temperaturer bör testas för andra celltyper. Exempelvis kan det vara bättre att hålla odlade T-celler vid 37 ° C fram till början av migration.

2. flödet Experiment

1. Coat bilder med integrin ligand.
   1. Dagen före experimentet, Tina en alikvot av ICAM-1 (400 µg/mL). Späd ICAM-1 med en faktor på 1: 80 i PBS att nå en slutlig koncentration på 5 µg/mL. Tillsätt 30 µL av ICAM-1 till en kammare i ett flöde bild varje migrering film krävs. Inkubera bild i en fuktig kammare vid 4 ° C över natten.
      Obs: Varje bild innehåller 6 kammare och upp till 8 filmer i en session kan enkelt spelas in.
2. Blockera belagda brunnarna.
   1. På dagen för experimentet, tvätta kammaren genom att lägga till 100 µL av PBS i en brunn och dra 100 µL från andra väl av kammaren. Tillsätt 100 µL blockerande buffert (2% fettsyra-fri BSA i PBS) till en kammare och inkubera i bilden i en fuktig kammare vid RT för 1,5 h.
   2. Tvätta i kammaren genom att lägga till 100 µL av PBS till en brunn, återkalla det från de andra väl, sedan lägga 100 µL av migration buffert till kammaren. Lagra bilder i en fuktig kammare vid RT tills experimentet.
3. Förbereda enheten flödesteknik.
   1. Koppla in en flytande pump, bifoga flödesteknik enheten och slå på pumpen programvaran. Tvätta slangen en gång med 5 – 10 mL migration buffert, och sedan lägga till 11,7 mL migration buffert lika i båda reservoarer och ta bort luftbubblor.
   2. Klämma slangen ca 10 cm från kontakten lappa. Placera fluidic enheten i uppvärmd inkubation kammaren på mikroskopet.
   3. Ställa in bildspel valet att ”µ-bild VI 0,4” och slangen till ”vitt” i programvaran. Ange önskad Skjuvspänningen (t.ex. 4 dyn cm^-2). Ange tidpunkten för bildframställning till 30 min.
   4. Ställa in kalibreringsfaktorn slangen genom att bestämma flödet genom slangen i mL/min. mått tidsåtgången för 2 mL buffert att flöda från en reservoar av den andra och dividera med 2. Göra minst 4 mätningar för noggrannhet. Använda det faktiska flödet för att ange önskad flöde och skjuvspänning genom att ange värdena i programvaran pump.
4. Förbered det imaging systemet.
   1. Pre värma den Mikroskop inkubation kammare, flödesteknik unit och migration buffert alikvoter till 37 ° C (figur 2B). Test fluidic pumpen genom att säkerställa att migreringen bufferten flödar fram och tillbaka i behållarna och att det finns ingen luft bubblor i systemet.
5. Ladda cellerna på bilden.
   1. Ren botten av bilden med en etanol-dämpade vävnad. Tillsätt 30 µL av cellsuspensionen i en brunn på avdelningen och återkalla 30 µL från andra väl. Inkubera i bilden med en cover på att förhindra avdunstning vid 37 ° C i 30 min så att cellerna att bifoga.
   2. Långsamt lägga pre värmde migration bufferten till varje brunn av flöde kammare bilden tills en positiv menisk stiger ur brunnen och avlägsna eventuella luftbubblor med pipettspetsen.
6. Bifoga bilden till flödesteknik enheten.
   1. Klämma i bilden till Mikroskop scenen. Ta bort den omärkta sidan av fluidic slangen från connector lappa och fylla upp slutet med migration buffert tills en positiv menisk utan luftbubblor stiger ur slutet.
   2. Vänd i slutet av slangen över och infoga det i övre brunnen på flow avdelningen, mopping upp utspillt buffert med en vävnad. Samtidigt hålla slangen fastklämd, upprepa proceduren för markerade slutet av slangen.
7. Bild cellerna.
   1. Växla det imaging systemet till ”Live” för att ställa in fokus på cellerna. Välj ett synfält som är mitt i bilden. Avinstallation fokus cellerna något för att förbättra den svart konturen av cellen och producera en vit interiör, som sedan kan thresholded till en runda svarta cell form på en vit bakgrund för användning med en automatisk spårning program.
   2. Starta bildprogrammet sekvens och posten 1 bild varje 5 s för 30 min med 10 x torr mål. Ta bort klämman från slangen och aktivera pumpen, icke-anhängare celler kommer att tvätta bort och vidhäftande celler börjar migrera. Bild för 30 min eller längre med en 10 x mål eller högre, som önskat. Etikett och spara filmen.
8. Lossa fluidic enheten från bilden.
   1. I slutet av bildprogrammet, återställa pumpen för nästa experimentet: åter fästa klämman till slangen, ta bort slangen från bilden, sätt tillbaka kontakten lappa, öppna klämman och använda manuell kontroll av pumpen för att driva flera mL buffert från en reserv oir till den andra att ta bort luftbubblor. Åter fästa klämman och låg fastspänd slangen på Mikroskop scenen för nästa film.
      Obs: Protokollet kan pausas på obestämd tid här. Om du använder en hämmare eller modifierare av cellmigration, beroende på dess verkningssätt, lägga till det till antingen cellsuspensionen innan bosatte sig i migration kammaren eller migration bufferten i enheten fluidic.

3. migration spår analys

Obs: Celler kan spåras automatiskt använder MTrack2 plugin eller för hand med hjälp av Manuell spårning plugin¹⁷. Automatisk spårning fungerar bra med MZBs eftersom dessa celler är främst runda och förbli detta sätt medan migrerar, gör det lätt att tröskeln bilden av cellerna till svarta objekt på en vit bakgrund. Automatisk spårning är svårare om andra celltyper som används, såsom odlade, aktiveras CD8 + T-celler, eftersom dessa celler sträcka ut under migreringen och bli något öppen, vilket gör det svårt att definiera kanterna. I det här fallet kan antingen (1) celler färgas med en intra vitala fluorescerande färgämne att producera bilder som kan vara thresholded att Visa svarta objekt på en vit bakgrund, eller (2) andra program att beskriva cellerna såsom bild segmentering och/eller kant upptäckt kan vara används. Manuell spårning är ett användbart alternativ när producerar en hög kontrast bild av cell konturer inte är möjligt.

1. Utföra manuell tracking använder plugin.
   1. Installera insticksmodulen ”Manuell spårning” i ImageJ och öppna filmen i ImageJ. Under menyn ”Manuell spårning”, Välj ”Lägg till nytt spår”. Klicka på mitten av en cell som film förskott automatiskt bildruta-för-bildruta. När cellen har valts i varje bildruta, Välj ”Lägg till nytt spår” att börja följa en ny cell.
   2. När spåren har registrerats, kopiera utdata resultaten i ett data-kalkylblad. Ändra formatet för decimal uppvisning för alla kalkylbladsceller till noll platser efter decimaltecknet. Spara filen som en .txt-fil för ”tab separerade med stopp” för efterföljande analys.
      Obs: Normalt spåras 50 – 100 celler, vilket tar ca 1 h till komplett för en 20 min film av omkring 240 bildrutor.
2. Utföra automatisk spårning med hjälp av MTrack2 plugin. Hämta och installera insticksmodulen MTrack2 kt enligt instruktioner i filen (se kompletterande kodning fil).
   1. Tröskelvärde för bilder från cell migration filmen. Öppna bildstapel i ImageJ. Processen bilderna i ImageJ att konvertera video från färg till bilder med hög kontrast visar cellerna som svart objekt på en vit bakgrund (figur 3A).
      1. Skärpa bilderna två gånger, ta bort fläckar i bilder och konvertera bilder till 8 bitar. Välj den ”bild | Justera intensitet/kontrast ”sub-menyn och sätta skjutreglaget kontrast på maximal kontrast, då cellerna kommer att visas som vita objekt på en svart bakgrund. Välj den ”bild | Justera tröskeln ”undermeny till att se till att cellerna visas som svarta objekt på en vit bakgrund.
   2. Kör automatisk cellen spårning plugin ”MTrack2 kt” (se Kompletterande Coding File). Ange följande parametrar på alternativskärmen.
      1. Ange partikelstorlek minsta på 1 pixel och partikelstorlek högsta på 30 bildpunkter för MZBs.
      2. För velocity (maximalt avstånd mellan 2 partiklar på successiva ramar av filmen), om cell densiteten på bilden är hög, detta värde lågt inställd att slippa spåret ”hoppa” från en cell till en annan. För MZBs, anger detta värde på 10 pixlar för att fånga extremvärden, även om MZBs inte kommer i allmänhet överstiga 2 pixlar på successiva ramar som är 5 s apart.
      3. För det minsta antalet ramar som en partikel har att närvara spåras, anger detta värde på antalet bildrutor i filmen för MZBs (e.g., 240) för en 20 min film med 12 ramar/min. Dock om cellerna är tillräckligt snabbt för att lämna synfältet före utgången av imaging, då inställd lägsta antalet bildrutor på mindre än längden på filmen. Till exempel med snabbrörliga T-celler, ange minimiantalet på motsvarande 5-10 min för bildframställning.
         Obs: Spela in ett makro av stegen (tröskelvärde och MTrack2-kt) för att automatisera denna del av förfarandet och spara tid (se Kompletterande Coding File). Använda makrot för att automatiskt spåra en film i ImageJ tar mindre än en minut.
   3. Kopiera utdata resultatet till en data-kalkylblad. Ändra formatet för decimal uppvisning för alla kalkylbladsceller till noll platser efter decimaltecknet. Lägga till en tom rad längst upp i cellen spåren i kalkylbladet och ta bort kolumnen ”D”. Spara filen som en ”tabbavgränsat stop-” .txt-fil för efterföljande analys i verktyget Ibidi Chemotaxis.
      Obs: MTrack2 plugin utgångar cell spåren i rader av 75 parallella kolumner. För analys i verktyget Ibidi Kemotaxis, måste cell spåren vara i en enda kolumn. För att konvertera produktionen, ändrades MTrack2 plugin för att mata ut antingen i det ursprungliga formatet eller som en enda kolumn (figur 3B) (se Kompletterande Coding File ”MTrack2 kt”, som är skrivet i Java). Kopiera filen .java till ImageJ plugins mappen. I ImageJ, Välj ”Plugins > kompilera och kör”. Starta om ImageJ och den modifierade versionen av MTrack2 bör visas i menyn Plugins.
3. För att analysera cell spår med verktyget Ibidi Kemotaxis, Ladda ner Ibidi Kemotaxis och Migration Tool v2.0 (”stand alone”) och öppna programmet.
   1. Välj ”Importera data” och navigera till .txt cell spår filer. Du kan välja flera filer samtidigt. Importerade filerna visas i fönstret ”datamängder” i rött. Välj dem alla och ange rätt värden i menyn ”initiering” nedan för att tillämpa följande inställningar.
   2. Ange antingen det exakta antalet eller ett intervall av antalet skivor (antalet bildrutor i filmen).
   3. I menyn kalibrering (X / Y kalibrering), ange storleken på en pixel. Leta upp denna information i egenskapsfilen av filmen. MZBs användes ett 10 x mål, ger en pixelstorlek på 1.14 µm. I ”kalibrering meny | Tidsintervall ”, ange hur lång tid mellan bildrutor i filmen.
   4. Tillämpa inställningarna. Välj ”Rita data” att se spåret tomter och bekräfta att spåra filer öppnas. Från denna punkt, det finns många alternativ, som beskrivs i dokumentationen för programmet, inklusive märkning spår med olika färger baserat på olika egenskaper och visar enskilda eller genomsnittliga värden för hastighet, vidarebefordra migrering index, direkthet och mer (figur 3B).
      Obs: MZBs tar ca 10 min att upptäcka och svara på flödet, förmodligen av polariserande deras integrin komplex att cellen flöde framåt. En graf över migration index över tiden kommer att visa en inledande nedgång under noll, motsvarar det första par minuter som cellen utsätts för att flöda, följt av en gradvis stiga uppåt tills de framtida migration indexvärdena är positiva. Således kan det vara optimalt att utesluta dessa första minuterna i slutliga beräkningarna, såvida inte denna process är av intresse.

Representative Results

Vi använde det protokoll som beskrivs ovan för att jämföra migration av MZBs på ICAM-1-coated bilder utan flöde (0 dyn/cm²) och utsätts för skeva flöde (4 dyn/cm²). Cellerna var spåras automatiskt med MTrack2 och resulterande banan filer var överlagras på cell migration filmer av inget flöde (0 dyn/cm²) och (4 dyn/cm²) för att Visa fördelningen och formen på spåren (figur 4A). Cell spår var sedan importeras till verktyget Ibidi Chemotaxis (IKT) för att generera spår tomter på varje film (figur 4B). Den genomsnittliga migration index (kallas ”FMIy” i IKT), hastighet, rakhet (kallas ”direkthet” i IKT) och linjärt avstånd (kallas ”euklidiska avstånd” i IKT) cell spår från 4 filmer vardera för båda villkoren beräknades i den Chemotaxis verktyg med kommandot ”uppmätta värden”. Dessa medelvärden kopierades sedan in GraphPad Prism för att generera grafer och beräkna statistisk signifikans (figur 4 c).

Figur 1: MZB shuttling. (A) modell av MZB skytteltrafik mellan den marginella zon och follikeln i mjälten. MZBs kräver internalisering av S1PR1, en receptor för S1P och funktionella CXCR5, en receptor för den CXCL13 chemokine, för att ange follikeln. Dessutom, för att nå follikeln, måste MZBs migrera mot styrkan av blodflödet från porerna i marginell sinus som omsluter hårsäcken. Om en MZB förlorar vidhäftningen till ICAM-1, liganden för LFA-1 integrin, skjuts det in röda massan vid styrkan av flödet, där ökade mängder VCAM-1, liganden för VLA-4, inte skulle stödja migration. (B) flödescytometri gating strategi för att testa renhet sorterade MZBs med antikroppar mot B220, CD23 och CD21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Setup på flödesteknik system, pump, Mikroskop och inkubation avdelningen. (A) bild av systemets pump (Ibidi¹⁸) bestående av en pump med anslutna flödesteknik enhet och laptop som kör programvara för att styra pumpen. Högre förstoring bild: flöde kammare bilden med 6 flöde chambers, varav först är kopplad till slangen av flödesteknik enheten. (B) typisk konfiguration för att mäta in vitro-migrering av MZBs mot flödet. Ett mikroskop som är utrustat med en värme-kammare (svart låda) som innehåller flödesteknik enheten ansluten till en pump (blå fyrkantigt objekt till det nedre högra av mikroskopet) utanför mikroskopet. Högre förstoring bild: flödesteknik enheten inuti mikroskopet värme kammare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: kvantifiering av imaging data. (A) representativa bilder av en bildruta från en film av migrerar MZBs före (vänster) och efter (höger) tröskelvärde bilden att konvertera cellerna till svarta objekt på en vit bakgrund. Skala barer i både låg och hög förstoring bilder = 100 µm. (B) vänstra panelen: bild av typiska resultat utdata från MTrack2 (kolumn) utdatatillägget. Högra panelen: bilden av verktyget Ibidi Kemotaxis och Migration 2.0 efter inmatning av MTrack2 resultat visar en spår tomt migrerar MZBs och en ”uppmätta värden” Visa fönster visar genomsnittet av parametrar inklusive hastighet, migration index och direkthet () gröna rutor), bland andra. Kalibreringsinställningar som visas inkluderar 1.14 µm per pixel PIXELupplösning och ett tidsintervall på 5 s (0,083 min) per filmrutan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: exempel på resultat med hjälp av protokollet för att mäta MZB shuttling. (A) representant stillbilder av migrerar MZBs med en överlagring av spår från ImageJ plugin ”MTrack2 kt”. Obs: spår färgerna fastställdes godtyckligt av ”Manuell spårning” plugin för ImageJ. Skala barer i både låg och hög förstoring inläggningar = 100 µm. (B) representativa spår tomter migrerar MZBs från verktyget Ibidi Kemotaxis och Migration 2.0. Röda linjer och svarta linjer representerar cellen spår som avslutar nedanför eller ovanför den vågräta axeln, respektive. I (A) och (B): vänster, MZBs migrerar med inget flöde (0 dyn/cm²). höger MZBs som migrerar till ett 4 dyn/cm² flöde. (C) Migration index (FMIy), hastighet, rakhet (direkthet) och avstånd för MZBs migrerar med nr flow (0 dyn/cm²) eller flöde (4 dyn/cm²) (n = 4 möss i 4 separata experiment). Felstaplar = medelvärde ± SD; Student's t -test, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1: MTrack2_kt.java. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.  

Discussion

Här beskriver vi en metod för att analysera migration av celler som upptäcka styrkan av skjuvning flöde och svara genom att ändra deras migration. En analys av MZBs visade att MZBs migrera spontant på ICAM-1 och i närvaro av flödet, kommer att flytta upp flödet. I vårt tidigare arbete visade vi att MZBs inte flyttar upp flödet på VCAM-1 men istället vara fast på plats. Murina mjälten marginell zonen innehåller främst ICAM-1, medan den röda massan innehåller både ICAM-1 och VCAM-1. Från dessa data, kunde det utläsas att MZBs skulle migrera upp flödet samtidigt i zonen marginell men inte i den röda massan. Analysen har validerats i vivo med MZBs med defekta vidhäftning som var mislocalized till mjälten röda massan vid styrkan av de flöde¹². Av dessa skäl utgör MZBs en bra positiv kontroll för att testa flödet migrationssystemet beskrivs här, även om systemet används för att studera en annan celltyp.

Den mest kritiska aspekten av förfarandet är att säkerställa enhetlighet i cell hantering i bilden. Eftersom de kvantifierbara aspekterna av cellmigration är beroende av den grad som cellerna följa till bild, skulle någon minskning av cellulär adhesion försvåra reproducerbara resultat. Minskad cellulär adhesion kan leda till inkonsekvens i flera faktorer, inklusive temperaturer av migration bufferten eller rutan uppvärmd inkubation (kyla minskar adhesion), nivåer av katjoner i cellsuspensionen (katjoner påverka integrin bindande), med lucka (trycka eller böjning bilden kunde rubba celler), och cell densiteten (kollisioner mellan celler kan påverka migration parametrar). Andra känsliga punkter under förfarandet omfattar inte pipettering bufferten i bild brunnar med alltför mycket kraft innan fästa slangen (som kan detta minska celladhesion) och att hålla den tid som krävs för protokollstegen konsekvent i varje experiment ( cell lösa tid kan påverka vidhäftning). Sammanfattningsvis måste eventuell påverkan på celladhesion hållas konsekvent genom hela repetitioner att producera tillförlitliga cell migration uppgifter.

Denna metod är lätt att ställa in eftersom den använder kommersiellt tillgänglig utrustning och förnödenheter och ingen av stegen kräver avancerad instruktion. För analys av MZB, liksom andra celltyper som odlade CD8⁺ T celler, beläggning bilderna med olika integrin ligander är tillräckligt att konstatera migreringen upp flödet. Studera flöde-inducerad migration svar på olika integrin ligander leder till direkt identifiering av aktiva integriner på cellytan, eventuellt avslöjande mekanismer berör invivo funktioner som med MZB migration upp flödet på ICAM-1 men inte VCAM-1. Det är dock också möjligt att lägga ett lager endotelceller till flöde kamrarna. Ett exempel av immunceller migration som påverkas av skjuvning flöde är T-cellen extravasering till endotel lager³. Detta förfarande användes nysta aktiveringen av T-cell adhesion via integriner, selectins och chemokiner och modell lymfocyter migration genom på blod - hjärnbarriären. Den enda begränsningen till de celler som kan analyseras med denna metod är att de måste kunna känna styrkan av flöde som en riktad signal.

Även om metoden som beskrivs här används för att karakterisera cellulära beteende till exempel hastighet och svarvning, kan det också förlängas till analys av de molekylära aspekterna av migration. Molekylär komplex relevanta för flöde-inducerad migrering, inklusive integriner som LFA-1 och deras cytoskeletal adaptrar, skulle vara ligger inom 200 nM av yta i bilden, mottagliga för visualisering med Frida mikroskopi. Detta tillägg till metoden skulle vara perfekt för att studera celler från möss med mutationer i integrin - eller cytoskelettet-relaterade proteiner. Eftersom många immunceller migrera på olika stadier i sin utveckling genom blod eller lymfa flyter, kan in vitro-migreringen beskrivs användas att systematiskt testa många typer av odlade eller primära leukocyter för svar på flow och avslöja hur cellerna är programmerad för att migrera i ett immunsvar som är invivo. Sammanfattningsvis ger analysen beskrivs här en tillförlitlig och enkel metod för att analysera flödet-inducerad migration av MZBs som också kan utökas till andra celltyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm	VWR	10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm	Miltenyi	130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit	Miltenyi	130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC	Biolegend	103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC	BD Biosciences	558658
CD23, clone B3B4, PE	Biolegend	101608
HBSS	Biochrom	L2035
D-PBS 1x	Gibco by Life Technologies	14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free	Roth	"0052.3"
ICAM-1	R&D Systems	796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated	Ibidi	80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm	Ibidi	10963
Ibidi Pump system	Ibidi	10902