Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Yamultma akış kaynaklı geçiş antikorundan marjinal bölge B hücrelerinin in Vitro analizine

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

Summary

Marjinal zon B hücreleri (MZBs) kesme akışı gücüne geçiş yollarına kadar debi yeniden yönlendirme tarafından yanıt. Bu iletişim kuralı, kayıt ve analiz akışkanlar birim, pompa, mikroskop görüntüleme sistemi ve özgür yazılım kullanarak geçiş gösterilmiştir.

Abstract

Marjinal zon B hücreleri (MZBs) köklerinin örtmek fare splenik marjinal bölgeler içinde bulunan B hücreler nüfusu vardır. Folikülleri ulaşmak için MZBs kan akışını kesme kuvvetleri kadar geçirmeniz gerekir. Biz burada bu akış kaynaklı MZB geçiş tüp bebek analiz etmek için bir yöntem mevcut. İlk olarak, MZBs fare dalak izole edilmiştir. İkinci olarak, MZBs integrin ligandlar akışı odası slaytlarında yerleşmiş, akış yamultmak için maruz ve mikroskop altında geçiş sırasında görüntüsü. Üçüncü olarak, geçirme MZBs görüntülerini eklenti için ImageJ izleme MTrack2 otomatik hücre kullanılarak işlenir ve Ibidi kemotaksisi aracını kullanarak elde edilen hücre parça sayılabilir. Göç veri hücreleri nasıl hızlı hareket, ne kadar sıklıkla yönünü değiştirmek, yamultma akışı vektör kendi geçiş yönünü etkileyip ve hangi integrin ligandlar söz konusu ortaya koyuyor. Biz MZBs kullansa da, yöntem kolayca kesme akışı gücüne yanıt verir herhangi bir lökosit göç analiz etmek için adapte edilebilir.

Introduction

Bağışıklık hücreleri insan vücudunda en hareketli hücreler ve sık sık kan ve lenf akıştan kesme kuvvetleri ile uğraşmak zorundadır. Ancak, kesme kuvvetleri kaynaklı göç lökosit1,2,3,4,5nispeten az çalışma vardır. Burada bir bağışıklık hücre yanıt akış tüp bebek için analiz etmek için güvenilir ve nicel bir iletişim kuralı mevcut. Tahlil gerçekleştirmek bileşenleri imalatı gerekmez ve tüm ekipmanları ve sarf malzemeleri ticari olarak kullanılabilir. Hücre analizi, arıtma ve geçiş dahil olmak üzere iletişim kuralı, bir gün içinde gerçekleştirilebilir. Son olarak, her ne kadar biz göç marjinal zon B hücre (MZBs) tanımlamak, protokol geçiş akış bağışıklık hücreleri başka tür karşı analiz etmek için uyarlanabilir. Bu nedenle, bu tahlil sistematik olarak geniş bir lökosit koşulların kapsamlı bir paneliyle çözümle kullanmak mümkün olabilir.

MZBs olan nüfus, fare, sadece dalak ve servisi bulunan B hücre iç köklerinin ve marjinal bölgeler6,7,8,9arasında. Marjinal zon bağışıklık hücreleri yaklaşık 5-10 hücre kalın bir katmandır. Hücre katmanı folikül zarf ve öncelikle MZBs ve makrofajlar ama aynı zamanda değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri, dendritik hücreler (DC) ve nötrofil, diğerleri arasında10oluşur. Marjinal zon hücrelerinde folikül çevreleyen bir marjinal sinüs sonlandırmak splenik arter kaynaklanan tek yönlü kan akışına maruz kalır. Kan marjinal bölgesi ile marjinal sinüs delikleri üzerinden akar ve sonra kırmızı hamuru venöz sinüsler içinde toplanır ve dolaşım11' e geri. Serbest akışı kan MZBs üzerinde yıkar ve onları kanda taşınan antijenleri için ortaya çıkarır. MZBs antijen kan maruz kalmaz folikül içinde ve marjinal zon arasında mekik tarafından otomatik olarak folikül taşımak. Böylece, folikül doğru MZBs Servisi, kan akışı12 (Şekil 1A) kesme kuvvetleri kadar geçirmeniz gerekir.

Bu iletişim kuralı, kantitatif MZBs hiçbir akışı veya yüksek akış tüp bebek için yanıt gibi nasıl bağışıklık hücreleri belirlemek anlatan, içinde vivogeçirmek için nasıl olduklarını ortaya çıkarmak için programlanmış. İlk adımda, MZBs manyetik boncuklar karşı antikorlar için piyasada kitleri birleştiğinde kullanarak bir fare dalak gelen saf. Taze izole MZBs integrin ligandlar yerleşmek için izin, bir akış odası slayt kuyunun içine tanıtıldı ve pompa sistemi (Şekil 2A) kullanarak geçiş arabellek akışına maruz. Hücreleri bir time-lapse video mikroskobu sistemi kullanarak yansıma. Görüntüleri daha sonra otomatik olarak hücreleri izleme MTrack213,-14, bir ücretsiz ImageJ eklentisi ile analiz için işlenir. Parça sonra hız, doğruluk ve geçiş dizin dahil olmak üzere çeşitli parametreleri belirlemek için ücretsiz Ibidi kemotaksisi aracı15 ile sayısal. Bu değerler bağışıklık hücre hareketi içinde vivo kontrol güçleri anlamak için kesme-akış indüklenen geçiş geçiş inhibitörleri, hücre uyarıcılar, kemokinler ve diğer geçiş etkileyen kimyasal etkileri belirlemek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneylerin hayvanlar kullanımını içeren önceden Landesverwaltungsamt Halle tarafından (Saksonya-Anhalt), Almanya, Magdeburg övgü Üniversitesi Tıp Fakültesi tüm kılavuzlarınıza uygun olarak onaylanmış olması.

1. MZB hücre arıtma

  1. Lökosit yalıtmak.
    1. Bir 8-16 hafta-yaşlı fare kurban ve dalak16kaldırın. Dalak 5 ml buz gibi hücre arabellek ayırmak [fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) + %0.5 yağ asidi içermeyen Sığır serum albumin (BSA)], doku dissociator kullanarak ya da hafifçe üzerinden 70 µm hücre süzgeç kafes 6-şey plaka üzerinde bir kuyuya dalak ezme 5 mL şırıngadan pistonu ile.
    2. Hücre arabellek hücrelerde 15 mL konik tüp içine aktarın. Ek hücreleri doku dissociator tüp ya da naylon mesh iyi başka bir 5 mL buz gibi hücre arabelleği ekleyerek toplamak. Hücre arabellek artı hücreleri ek 5 mL konik tüp aktarın. Vasıl 300 x g (RT, 20 ° C) Oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  2. Kırmızı kan hücre lizis gerçekleştirin.
    1. Hücre Pelet RT. Ekle ek bir 1,5 mL RBC lizis arabelleği önceden ısıtılmış kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) 1 ml yeniden askıya alma ve karıştırmak için girdap. RT (20 ° C) 2 dk Pelet yeniden askıya almak için gereken süreyi de dahil olmak üzere, toplam için kuluçkaya.
    2. Buz gibi hücre arabellek 7.5 mL lizis durdurmak için hücre süspansiyon ekleyin. 300 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    3. Hücre pelet 1 mL hücre arabellek yeniden askıya alma ve hücre arabellek bir ek 9 mL ekleyin. 10 mL hücre süspansiyon hücre artıkları kaldırmak için bir yeni 15 mL konik tüp bir 30 µm ön ayırma filtreden pipette.
    4. Hücreleri vasıl 300 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hücre Pelet hücre arabellek 500 µL içinde yeniden askıya alma. Hücreler yordam tüm sonraki adımlar akış odası slaytlar kuluçka kadar soğuk tutmak.
  3. MZBs arındırmak.
    1. Piyasada bulunan bir kit CD43 (üzerinde B hücreleri), CD4 (üzerinde T hücreleri), CD93 (üzerinde olgunlaşmamış B hücreleri) ve Ter119 (eritrositler), tarih de dahil olmak üzere tüm istenmeyen hücrelere karşı antikorların biotin birleştiğinde 50 µL konik tüp içinde hücre süspansiyon ekleyin. Sallamak ya da yavaşça karıştırın ama değil girdap hücreleri tüp hafifçe vur. Konik tüp neredeyse düz açılı buz ve kaya 15dk için 25 rpm bir yatakta yatıyordu.
    2. Manyetik boncuklar için anti-biotin antikorlar hücre süspansiyon için 100 µL toplam hacmine birleştiğinde ekleyin. 20 dk. Yıkama için buz üzerinde 25 RPM hücre süspansiyon hücreleri hücre arabelleği, 300 x g centrifuging 5 mL ve 4 ° C'de 10 dakika ekleme ve süpernatant atarak sallamaya devam edin. Hücrelerde hücre arabelleği 1 mL yeniden askıya alma.
    3. Manyetik boncuk birleştiğinde hücre hücre süspansiyon manyetik bir sütun koruyarak tüketmek. Hücreleri (tüm B hücreleri ve olgunlaşmamış B hücreleri) etiketli atma. 5 mL hücre arabelleği, non-spesifik yapışma MZBs tarafından önlemek için kısa bir uygulama ile önceden kaplanmış oldu 15 mL konik tüp içinde sigara etiketli hücreleri (olgun B hücreleri) toplamak.
    4. Hücre süspansiyon hücre arabelleği 5 mL ile yıkayın. 300 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hücrelerde hücre arabelleği 90 µL yeniden askıya alma ve anti CD23 birleştiğinde boncuk 10 µL ekleyin. Rock hücre süspansiyon buz 25 rpm'de 20 dakika hafifçe üfleyin.
    5. Hücre süspansiyon hücre arabelleği 5 mL ile yıkayın. 300 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hücrelerde hücre arabelleği 1 mL yeniden askıya alma.
    6. Manyetik boncuk birleştiğinde hücre hücre süspansiyon manyetik bir sütun koruyarak tüketmek. Etiketli hücreleri (Folliküler B hücreleri) atmak. Sigara etiketli hücreleri (MZBs), hücre arabelleği 5 mL kısa bir uygulama ile ön kaplamalı bir 15 mL konik tüp toplamak. Hücre sayımı ve saflık denetlemek için 50 µL kaldırın.
  4. Saflık için kontrol etmek için sıralanmış MZBs leke.
    1. % 10 birim (5 µL) 50 µL 10.000 hücrelerde Fc bloğunu ekleyin ve 5 dk. Ekle 50 µL 0.3 µL her B220-FITC içeren hücre arabelleği için 4 ° C'de kuluçkaya (0.15 µg), CD21-PE (0,06 µg) ve CD23 APC (0,06 µg) 105 µL (her seyreltilmiş antikor 1:350) Toplam hacmine , veya diğer herhangi bir birleşimi için 15 dakika karanlıkta 4 ° C'de hücreler Folliküler B hücreleri ve MZBs. leke arasında ayrım fluorophores.
    2. Lekeli hücreleri hücre arabelleği 1 mL ile yıkayın. 300 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hücre arabellek 300 µL içinde resuspend ve bir akış sitometresi ve standart yöntemleri kullanarak örnekleri elde etmek. Kapı canlı lenfositler ve sonra B220+ hücreleri ve nihayet CD23düşük CD21yüksek üzerinde (Şekil 1B) hücreleri.
      Not: Yordam genellikle bir C57B/6 fare dalak başına 500.000 MZBs verir.
  5. MZBs akışı geçiş için hazırlama.
    1. Yıkama MZBs bir kez 1-2 ml soğuk geçiş arabelleği [Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) içeren özellikler, 10 mM Hepes, % 0,2 BSA yağ asidi içermeyen] ba * içeren geçiş arabellek kalan katyon ücretsiz PBS arabellek tarafından seyreltilmiş değil emin olmak için saf. 300 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. MZBs soğuk geçiş arabelleğe 30 µL (akış odası slayt bir kuyuda yüklü miktar eşdeğeridir) başına 50.000 MZBs bir konsantrasyon içinde yeniden askıya alma.
      Not: En kısa zamanda taze izole MZBs kullanılmalıdır. Ancak, onlar en fazla 8 saat veya daha fazla deneme için başladıktan sonra buz üstünde tutulur sürece geçiş hala yeteneğine sahip. Optimum sıcaklık derecesi-meli var olmak sınav diğer hücre türleri için. Örneğin, kültürlü T hücreler 37 ° C'de geçiş başlayana tutmak için daha iyi olabilir.

2. akış deney

  1. İntegrin ligand ile kat slaytlar.
    1. Deneme önce gün, ICAM-1'in bir aliquot çözülme (400 µg/mL). ICAM-1 5 µg/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için PBS 1:80 bir faktörle oranında seyreltin. Gerekli her geçiş film için akış slayttaki bir odasına ICAM-1 30 µL ekleyin. Slayt 4 ° C'de nemli bir odasında gecede kuluçkaya.
      Not: Her bir slayt 6 odaları içerir ve bir oturum 8 filmler kadar kolayca kaydedilebilir.
  2. Kaplamalı wells engelleyin.
    1. Deneme günü, bir şey için PBS 100 µL ekleyerek ve 100 µL odası diğer iyi çekilmesi odası yıkayın. Bir odaya engelleme arabelleği (%2 yağ asidi içermeyen BSA PBS içinde) 100 µL ekleyin ve 1,5 saat için RT, nemli bir odasında slayt kuluçkaya.
    2. Oda bir şey, bu odaya diğer iyi o zaman ekleyerek 100 µL geçişi arabelleği geri çekilmesi için PBS 100 µL ekleyerek yıkayın. Slaytları RT nemli bir odasında deneme kadar saklayın.
  3. Akışkanlar birim hazırlayın.
    1. Bir sıvı pompa tak, akışkanlar birim eklemek ve pompa yazılım açmak. Tüp geçişi arabelleği, 5-10 mL ile bir kez yıkama sonra geçiş arabelleği 11.7 mL eşit her iki rezervuarlar için eklemek ve hava kabarcıkları kaldırın.
    2. Yaklaşık 10 cm bağlayıcı parçasındaki boru kelepçe. Mikroskop üzerinde ısıtmalı kuluçka odasında sıvı birimi yerleştirin.
    3. Slayt seçim için "µ-slayt VI 0,4" ve "beyaz" boru yazılımda ayarlayın. İstenen kesme stres (örneğin, 4 dyn cm-2) ayarlayın. Görüntüleme için 30 dk saati.
    4. Boru Kalibrasyon faktörü boru diğer bir rezervuar akış ve 2'ye bölün için tampon 2 mL için gereken süreyi mL/dak ölçü birimi aracılığıyla akış hızı belirlenerek ayarlayın. Doğruluk için en az 4 ölçümleri yapmak. Gerçek akış hızı istenen debi ve yamultma stres pompa yazılım değerleri girerek ayarlamak için kullanın.
  4. Görüntüleme sistemi hazırlamak.
    1. Mikroskop kuluçka odası, akışkanlar birim ve geçiş arabellek aliquots 37 ° c (Şekil 2B) önceden ısıtmak. Sıvı pompa geçiş arabellek ileri geri rezervuar akar ve hava vardır sağlayarak sistemdeki kabarcıklar testi.
  5. Slaytta hücreleri yükleyin.
    1. Etanol nemlendirilmiş bir doku ile slayt alt temiz. Hücre süspansiyon 30 µL odası bir kuyunun içine ekleyin ve 30 µL diğer kuyudan çekmek. Bir kapak ile slayt için hücreleri eklemek izin vermek 30 dk 37 ° C'de buharlaşma önlemek için üzerinde kuluçkaya.
    2. Yavaş yavaş olumlu bir menisküs kuyudan yükselir kadar önceden ısıtılmış geçişi arabelleği akış odası slayt her şey için ekleyin ve herhangi bir hava kabarcıkları pipet ucu kaldırın.
  6. Slayt akışkanlar birimine ekleyin.
    1. Mikroskop sahneye slayt kelepçe. İşaretsiz yan akışkan hortumunun konektörü parça--dan kaldırmak ve sonunda dışarı hava kabarcığı olmadan olumlu bir menisküs yükselir kadar son geçiş arabellek ile doldurmak.
    2. Tüp üzerinde sonu fiske vurmak ve bir doku ile dökülen tampon paspas akışı odasının üst kuyunun içine ekleyin. Sabitlenmiş tüp tutarken, tüp işaretli sonu için yordamı yineleyin.
  7. Hücreleri görüntü.
    1. "Live" hücreleri üzerinde odak ayarlamak için görüntüleme sistemi geçiş. Slayt ortasında bir görüş alanı seçin. Biraz hücrenin siyah anahat geliştirmek ve daha sonra thresholded bir otomatik izleme programı ile kullanmak için beyaz bir arka plan üzerinde siyah yuvarlak hücre şeklinde olabilir bir beyaz iç üretmek için hücreleri de-odak.
    2. Görüntüleme sırası programını başlatmak ve kayıtlı 1 görüntü her 5 s 30 dk 10 x Kuru amacı istimal için. Kelepçe boru üzerinden kaldırın ve sonra sigara yapışık hücreleri yıkayın ve yapışık hücreleri göç etmeye başlayacak, pompa çevirmek. Resim 30 dakika veya daha uzun bir 10 amaç x veya daha yüksek, istediğiniz gibi kullanma. Etiket ve filminizi kaydedin.
  8. Slayt sıvı biriminden ayırmak.
    1. Görüntüleme programı sonunda, sonraki deneme için pompa sıfırlama: tüp için kelepçe re-attach, tüp slayttan kaldırırken, bağlayıcı parça re-attach, kelepçe açın ve pompa manuel kontrol birkaç mL arabelleği bir rezerv itmek için Oir diğer hava kabarcıkları kaldırmak için. Kelepçe re-attach ve sonraki film için mikroskop sahnede klempe boru yatıyordu.
      Not: İletişim kuralı belirsiz bir süre burada duraklatılmış. Bir engelleyici veya değiştirici eylem, onun moduna bağlı olarak hücre göç kullanıyorsanız geçiş odasında yerleşmeden önce her iki hücre süspansiyon veya sıvı birimi geçiş arabellekte ekleyin.

3. geçiş parça Analizi

Not: Hücreleri izlenen MTrack2 eklenti kullanarak otomatik olarak veya el ile izleme eklentisi17kullanarak elle. Bu hücreler genellikle yuvarlak ve geçiş sırasında bu şekilde kalır çünkü MZBs ile de çalışır eşik hücrelerin görüntüsünü beyaz bir arka plan üzerinde siyah nesnelere kolaylaştırır izleme otomatik. Eğer diğer hücre tipleri kullanılır, gibi kültürlü, çünkü bu hücreler geçiş sırasında yat ve biraz şeffaf hale CD8 + T hücreleri, kenarları tanımlamak üzere aktif otomatik izleme daha zordur. Bu durumda, her iki (1 hücre içi hayati bir floresan boya resim segmentasyon ve/veya kenar algılama olabilir gibi hücreleri belirlemenizi (2) diğer program veya beyaz bir arka plan üzerinde siyah nesneleri göstermek için thresholded olabilir görüntüler üretmek için boyanabilen kullanılan. El ile izleme hücre özetliyor bir yüksek karşıtlıklı görüntü üretilirken yararlı bir seçenek mümkün değil ki.

  1. El ile izleme eklentisi kullanarak gerçekleştirin.
    1. ImageJ içinde "Manuel izleme" eklentiyi kurmak ve film ImageJ içinde açın. "Manuel izleme" menüsünün altında "yeni parça eklemek" seçin. Bir hücrenin merkezine otomatik olarak çerçevelemek-yanında-çerçevelemek film gelişmeler ' ı tıklatın. Hücre her çerçeve içinde seçili olduğunda, "yeni bir Kanal Ekle'yi seçin" yeni bir hücre takip başlatmak için.
    2. Parçalar kaydettikten sonra çıkış sonuçları verileri elektronik tabloya kopyalayın. Tüm elektronik tablo hücreleri için ondalık görüntülenmek sıfır yerlere ondalık biçimini. Daha sonraki analiz için "sekme durağı ayrılmış".txt dosyası olarak kaydedin.
      Not: Genellikle, yaklaşık 240 kare 20 dk film için tamamlamak için yaklaşık 1 h aldığı 50-100 hücreleri izlenir.
  2. Otomatik izleme MTrack2 eklentisi kullanarak gerçekleştirin. Karşıdan yükleyip talimatlara göre MTrack2 kt eklenti dosyasında (bakınız ek kodlama dosyası).
    1. Eşik hücre göç film görüntüleri. Görüntü yığını içinde ImageJ açın. Hücreleri (Şekil 3A) beyaz zemin üzerine siyah nesneler olarak gösterilen yüksek kontrastlı görüntüler için video dönüştürmek için ImageJ görüntülerde renk süreci.
      1. İki kez görüntüleri netleştirmek, görüntüleri lekeleri temizlemek ve görüntüleri dönüştürmek için 8 bit. Seçin "görüntü | Parlaklık/Kontrast ayarlama"alt menü ve koydu en yüksek kontrast kontrast kaydırıcıyı sonra hücreleri siyah bir zemin üzerine beyaz nesneler olarak görünür. Seçin "görüntü | alt menü eşik ayarlayın"hücreleri beyaz bir arka plan üzerinde siyah nesneler olarak görüntülendiğinden emin olmak için.
    2. Eklenti "MTrack2 kt" izleme otomatik hücre çalıştırmak ( Ek kodlama dosyasınabakın). Seçenekleri ekranında aşağıdaki parametreleri ayarlayın.
      1. Partikül büyüklüğü ve parçacık boyutu 1 piksel minimum maksimum MZBs için 30 piksel çözünürlükte ayarlayın.
      2. Slaytta yer alan hücre yoğunluğu yüksek ise, için hız (film izleyen çerçevelerde 2 parçacıklar arasındaki maksimum mesafe), bu değeri düşük parça önlemek için "Zıpla" bir hücreden diğerine ayarlayın. MZBs genellikle 2 piksel 5 ardışık çerçevelerde tutarınızı geçmez, ancak MZBs için 10 piksel çözünürlükte outliers, yakalamak için bu değer küme s ayrı.
      3. Bir parçacık izlenmesi gereken mevcut olmak zorunda çerçeveler en az sayısını ayarlamak için bu değeri kare film sayısı, MZBs için (örneğin, 240) 12 kare/dk ile 20 dk film için. Hücreleri görüntüleme sonundan önce görüş alanı terk etmek hızlı, ancak, o zaman çerçeveleri en az sayıda film süre daha az, ayarlayın. Örneğin, hızlı hareket eden T hücreleri ile en düşük sayı 5-10dk görüntüleme denk ayarlayın.
        Not: aşağıdaki adımları (eşik ve MTrack2-kt) bu yordamın parçası otomatikleştirmek ve zaman kazanmak için bir makro kaydedin ( Ek kodlama dosyasınabakın). Otomatik olarak ImageJ bir film izlemek için makro kullanarak bir dakikadan az sürer.
    3. Çıkış sonuçları verileri elektronik tabloya kopyalayın. Tüm elektronik tablo hücreleri için ondalık görüntülenmek sıfır yerlere ondalık biçimini. Elektronik tablodaki hücre parça üstündeki boş bir satır ekleyin ve "D" sütun Sil. Ibidi kemotaksisi aracında daha sonraki analiz için "sekme durağı ayrılmış".txt dosyası olarak kaydedin.
      Not: MTrack2 eklenti 75 paralel sütun satır hücre parça verir. Ibidi kemotaksisi Aracı analizi için hücre parça tek bir sütunda olması gerekir. Çıkış dönüştürmek için MTrack2 eklentisi ya çıkış için güncellenmiştir özgün biçiminde veya tek bir sütun (şekil 3B) olarak (Java ile yazılmış Ek kodlama dosya "MTrack2 kt"bakın). .Java dosyasını ImageJ plugins klasörüne kopyalayın. ImageJ içinde "Eklentiler > derlemek ve seçme"koşmak. Yeniden ImageJ ve MTrack2 değiştirilmiş versiyonu eklentileri menüsünde görüntülenmesi gerekir.
  3. Hücre parça Ibidi kemotaksisi aracı ile analiz etmek, download Ibidi kemotaksisi ve geçiş aracı v2.0 ("tek başına") ve programı açın.
    1. "Veri" seçin ve .txt hücre parça dosyalarına gidin. Birden fazla dosya aynı anda seçilebilir. İçe aktarılan dosyaları kırmızı "Veri" bölmesinde görünür. Bunların tümünü seçin ve aşağıdaki ayarları uygulamak için aşağıdaki "Başlatma" menü doğru değerleri girin.
    2. Tam sayı veya dilim (film kare sayısı) sayısı aralığı girin.
    3. Kalibrasyon menüsünde (X / Y kalibrasyon), bir piksel boyutu girin. Bu bilgi film özellikleri dosyayı bulun. MZBs için 10 x objektif bir piksel boyutu 1.14 µm veren kullanıldı. İçinde "kalibrasyon menü | Aralığı zaman", film kareleri arasında geçen süreyi girin.
    4. Ayarlar uygulanır. "Verileri çizmek" seçin parça araziler görüntülemek ve parça dosyaları açacak onaylamak için. Bu noktadan sonra birçok seçenek hangi parçaları farklı özelliklerine göre farklı renklerle işaretleme içeren programın belgelerine açıklanmıştır ve geçiş iletmek için hız, bireysel veya Ortalama değerlerini görüntüleyen mevcuttur Dizin, açıklık ve daha fazla (Şekil 3B).
      Not: MZBs algılamak ve akışı için muhtemelen kendi integrin kompleksleri hücre akışı ileri noktaya polarize tarafından yanıt vermek için yaklaşık 10 dakika al. Bir grafik zaman içinde göç dizinin ilk açılan ilk birkaç hücreyi akmaya, ileri geçiş Dizin değerleri pozitif olana kademeli bir artış tarafından yukarı takip maruz dakika için karşılık gelen sıfırın gösterir. Bu nedenle, bu işlem ilgi olmadığı sürece Son hesaplamalar, bu ilk dakikada dışlamak için en uygun olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz MZBs geçiş akış (0 dyn/cm2) olmadan ICAM-1-kaplı slaytlarda karşılaştırmak için yukarıda belirtilen protokolü kullanılan ve akış (4 dyn/cm2) yamultmak için maruz. Hücreleri otomatik olarak MTrack2 ve dosyaları overlaid elde edilen parça ile hücre göç film akışı yoktur (0 dyn/cm2) ve (4 dyn/cm2) dağılımını göstermek için ve parça (Şekil 4A) şeklinde takip. Hücre parça parça araziler her film (Şekil 4B) oluşturmak için Ibidi kemotaksisi aracını (ICT) sonra ithal edildi. Ortalama geçiş dizin (ICT içinde "FMIy" olarak adlandırılır), hız, doğruluk (ICT "açıklık" olarak adlandırılır) ve doğrusal mesafe 4 film her iki koşul için hesaplanan hücre parça (ICT "Öklid uzaklığı" olarak adlandırılır) "Ölçülen değerler" komutunu kullanarak kemotaksisi aracı. Bu ortalama değerler sonra grafikler oluşturma ve istatistiksel anlamlılık (Şekil 4 c) hesaplamak için GraphPad prizma kopyalandı.

Figure 1
Şekil 1: MZB mekik. (A)Model, marjinal zon ve dalak folikül arasında mekik MZB. MZBs S1PR1, bir reseptör S1P ve fonksiyonel CXCR5, bir reseptör CXCL13 kemokin için içselleştirilmesi folikül girmek için gerektirir. Ayrıca, folikül ulaşmak için MZBs kan akımı folikül zarf marjinal sinüs gözenekleri üzerinden yayılan kuvvet karşı geçirmeniz gerekir. Bir MZB ICAM-1, LFA-1 integrin, ligand yapışma kaybederse VCAM-1, ligand VLA-4 için artan miktarlarda geçiş desteği nerede değil akış, zorla kırmızı hamuru içine itilir. (B) akış sitometresi saflığı sınamak için strateji çoğunluğuna sıralı B220, CD23 ve CD21 karşı antikor kullanarak MZBs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Kurulum akışkanlar sistemi, pompa, mikroskop ve kuluçka odası. Bir pompa bağlı akışkanlar birim ve belgili tanımlık bilgisayar yazılımı çalıştıran dizüstü bilgisayar pompa kontrol ile oluşan(a)pompa sisteminin görüntüsünü (Ibidi18). Yüksek büyütme resim: ilki akışkanlar birim boru için bağlı akış odası slayt 6 akışı chambers ile. (B) normal kurulum MZBs tüp geçiş karşı akış ölçme. Akışkanlar birimini içeren bir Isıtma Odası ile (kara kutu) donatılmış mikroskop mikroskop dışında bir pompa (mavi kare nesneye sağ mikroskop altında) bağlı. Yüksek büyütme resim: akışkanlar birim odası Isıtma mikroskop içinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: veri görüntüleme Quantification. Geçiş bir filmden bir kare(a)temsilcisi görüntülerini MZBs önce (solda) ve sonra (sağda) eşik hücreleri beyaz bir arka plan üzerinde siyah nesnelere dönüştürmek için görüntü. Ölçek çubukları her iki düşük ve yüksek büyütme Albümdeki 100 µm. (B) sol panelde =: görüntü MTrack2 (tek sütun çıkış) eklenti çıkışının tipik sonuçları. Doğru kapı aynası: görüntü giriş MZBs ve bir "ölçülen değerler" hız, geçiş dizin ve telaş (dahil olmak üzere parametreleri ortalamalara gösteren penceresi görüntülemek, geçirme bir parça Arsa gösterilen MTrack2 sonuçlarının sonra Ibidi kemotaksisi ve geçiş 2.0 aracı yeşil kutuları), diğerleri arasında. Gösterilen kalibrasyon ayarları dahil 1.14 µm / piksel piksel çözünürlüğe ve bir zaman aralığı 5 s film çerçevesini (0,083 dk). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: örnek MZB mekik ölçmek için iletişim kuralını kullanarak sonuçları. (A)temsilcisi fotoğraf bir bindirme parça "MTrack2 kt" ImageJ eklenti dan ile geçirme MZBs. Not: parça renkler keyfi ImageJ için "Kılavuzu izleme" plugin tarafından kuruldu. Her iki düşük ve yüksek büyütme insets ölçek çubukları, geçirme 100 µm. (B) temsilcisi parça araziler = MZBs Ibidi kemotaksisi ve geçiş 2.0 aracı. Kırmızı çizgiler ve siyah çizgiler altına veya üstüne yatay eksen, sırasıyla feshetme hücre parça temsil eder. İçinde (A) ve (B): sol, MZBs geçiş ile herhangi bir akışı (0 dyn/cm2); Evet, bir 4 dyn/cm2 akışına geçiş MZBs. (C) geçiş dizin (FMIy), hız, doğruluk (açıklık) ve mesafe MZBs Hayır ile geçiş için akış (0 dyn/cm2) veya akış (4 dyn/cm2) (n = 4 ayrı deneylerde 4 fareler). Hata çubukları ortalama ± SD; = Öğrenci t testi, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 1: MTrack2_kt.java. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.  

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz burada geçiş kesme akış gücü algılayan ve onların geçiş değiştirerek yanıt hücre analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. MZBs bir analizini MZBs kendiliğinden ICAM-1 ve akış huzurunda geçirmek, akış geçireceği gösterdi. Önceki çalışmalarda, MZBs kadar debi VCAM-1 geçiş ama bunun yerine yerde sabit kalır gösterdi. İçerirken, kırmızı hamuru ICAM-1 ve VCAM-1 fare splenik marjinal zon esas olarak ICAM-1, içerir. Bu veri, MZBs kadar debi marjinal zon ama kırmızı hamuru içinde geçirmek anlaşılmaktadır. Analizi ile dalak kırmızı öldüresiye akışı12zorla mislocalized arızalı yapışma MZBs kullanarak vivo doğrulandı. Bu nedenlerden dolayı MZBs bile sistem farklı hücre tipi incelemek için kullanılır burada, anlatılan akış geçiş sistemi test etmek için iyi bir olumlu denetim temsil eder.

En önemli bir özelliği, işlem tutarlılığı slayt üzerinde işlem hücrede garanti etmektedir. Hücre göç ölçülebilir yönleriyle için slayda hücreleri uygun derecesine bağlıdır çünkü herhangi bir azalma hücre adezyon tekrarlanabilir sonuçlar zor olur. Birden fazla etkene sıcaklıklar geçiş arabellek veya ısıtmalı kuluçka kutusunun tutarsızlık azalma hücre adezyon sonucu (soğuk yapışma azaltır), hücre süspansiyon katyonlar düzeyde (katyonlar etkiler integrin bağlama), Slayt işleme (dokunarak veya slayt esneme çıkarmak hücreleri) ve hücre yoğunluğu (çarpışmalar hücreler arasında geçiş parametreleri etkileyebilir). Diğer hassas noktaları işlemi sırasında arabellek slayt wells (Bu hücre adezyon azaltmak olabilir gibi) tüp takılması ve protokol adımlar her deney (tutarlı için gereken süre tutarak önce çok fazla kuvvet ile içine pipetting değil dahil hücre halledilmesi zaman yapışma etkileyebilir). Özet olarak, hücre adezyon mümkün herhangi bir etkisi güvenilir hücre göç veri üretmek için tekrarlama tutarlı tutulmalıdır.

Ticari olarak mevcut ekipman kullanır ve malzemeleri ve adımların hiçbiri gelişmiş öğretim gerektirir beri kurmak kolay bir yöntemdir. MZB yanı sıra diğer hücre tipleri gibi kültürlü CD8 analizi için+ T hücreleri, çeşitli integrin ligandlar slaytlarla kaplama geçiş kadar debi gözlemlemek için yeterli. Akış kaynaklı geçiş yanıt-e doğru çeşitli integrin ligandlar eğitim doğrudan Kullanıcı kimliğini active integrinler muhtemelen mekanizmaları içinde vivo işlevlerine kadar debi ICAM-1 ama değil VCAM-1 MZB geçiş ile ilgili ifşa hücre yüzeyinde yol açar. Ancak, akışı odalarına bir endotel hücre katmanı eklemek mümkündür. Bir kesme akış tarafından etkilenen bağışıklık hücre göç ile endotel katmanları3T hücre ekstravazasyonu örnektir. Bu yordamı harekete geçirmek yolu ile T hücre adezyon integrinler, selectins ve kemokinler ve için modeli lenfosit göç yoluyla kan - beyin bariyerini çözmek için kullanıldı. Bu yöntemle analiz edilebilir hücreleri tek sınırlama onlar akışı olarak bir yönlü sinyal gücünü anlamaya gerekir olduğunu.

Burada özetlenen yöntemi hız ve dönüm gibi hücresel davranışını tanımlamak için kullanılır, ancak aynı zamanda geçiş moleküler yönlerini analiz için genişletilebilir. Moleküler komplekslerin integrinler LFA-1 ve hücre iskeleti onların adaptörleri gibi de dahil olmak üzere, akış kaynaklı göç ile ilgili 200 içinde bulunduğu nM slayt, görselleştirme TIRF mikroskobu ile mükellef ve yüzey. Yöntem bu ek mutasyonlar integrin veya sitoiskeleti ilişkili proteinler ile fareler hücrelerden eğitim için ideal olacaktır. Gelişimleri kan veya lenf akışı aracılığıyla çeşitli aşamalarında birçok bağışıklık hücreleri göç gibi açıklanan tüp geçiş sistematik olarak pek çok kültürlü veya birincil lökosit yanıt-e doğru akış ve nasıl hücrelerdir ortaya çıkarmak için test etmek için kullanılamaz bir bağışıklık yanıtı içinde vivo geçirmek için programlanmış. Sonuç olarak, burada açıklanan tahlil akış kaynaklı göç diğer hücre türleri için aynı zamanda genişletilebilir MZBs analiz etmek için güvenilir ve basit bir yöntem sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Bu eser K.-D.F. için "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 gelen hibe tarafından desteklenmiştir

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
  13. ImageJ. MTrack2. , Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018).
  14. MTrack2. , Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018).
  15. ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018).
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).
  17. ImageJ. Manual Tracking. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018).
  18. ibidi. ibidi Pump System. , Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. (2018).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 141 B hücreleri marjinal zon göç yamultma akışı integrinler adezyon adezyon molekülü-1 (ICAM-1) vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1)
Yamultma akış kaynaklı geçiş antikorundan marjinal bölge B hücrelerinin in Vitro analizine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M.,… More

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. D. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter