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Immunology and Infection

Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

Summary

Las células de la zona marginal B (MZBs) responden a la fuerza de esquileo del flujo por reorientar su ruta de migración el flujo. Este protocolo muestra cómo grabar y analizar la migración utilizando una unidad de fluidos, bomba, sistema de proyección de imagen del microscopio y software libre.

Abstract

Las células de la zona marginal B (MZBs) son una población de células B que residen en las zonas marginal esplénicas de ratón que envuelven los folículos. Para llegar a los folículos, MZBs debe migrar la fuerza de esquileo del flujo de sangre. Aquí presentamos un método para el análisis de esta migración MZB fluir-inducido in vitro. En primer lugar, MZBs están aislados del bazo de ratón. En segundo lugar, MZBs son colocados en ligandos de integrinas en diapositivas cámara de flujo, expuestas al flujo del esquileo y fotografiadas con un microscopio al migrar. En tercer lugar, imágenes de las migración MZBs son procesados utilizando la célula automática MTrack2 seguimiento de plugin de ImageJ y las pistas de la célula resultante se cuantifican utilizando la herramienta de quimiotaxis Ibidi. Los datos de migración revelan cómo rápidamente las células mueven, con qué frecuencia cambian de dirección, si el vector de flujo afecta la dirección de migración y que ligandos de integrinas están involucrados. Aunque utilizamos MZBs, el método puede ser fácilmente adaptado para el análisis de migración de ningún leucocito que responde a la fuerza de esquileo del flujo.

Introduction

Las células inmunes son las células más móviles del cuerpo humano y a menudo deben lidiar con la fuerza de esquileo del flujo sanguíneo y linfático. Sin embargo, hay relativamente pocos estudios sobre la migración de inducida por la fuerza de esquileo de leucocitos1,2,3,4,5. Aquí presentamos un protocolo confiable y cuantitativo para analizar la respuesta de una célula inmune al flujo in vitro. Realizar el análisis no requiere la fabricación de componentes, y todos los equipos y consumibles están comercialmente disponibles. El protocolo, incluyendo análisis de la depuración y migración de la célula, se puede realizar en un solo día. Finalmente, aunque se describe la migración de células B de zona marginal (MZBs), se puede adaptar el protocolo para analizar la migración contra flujo de otros tipos de células inmunes. Por lo tanto, es factible utilizar este ensayo para analizar sistemáticamente una amplia gama de los leucocitos con un panel amplio de condiciones.

MZBs son una población de células B que en el ratón, sólo se encuentran en el bazo y el transporte entre el interior de los folículos y los marginales6,7,8,9. La zona marginal es una capa de células de células inmunitarias aproximadamente 5 – 10 gruesas. La capa de la célula envuelve el folículo y consta principalmente de MZBs y macrófagos, pero también invariantes naturales killer (iNKT) las células T, células dendríticas (DCs) y neutrófilos, entre otros10. Las células de la zona marginal se exponen al flujo unidireccional de sangre procedentes de las arterias esplénicas que terminan en un seno marginal que rodea el folículo. La sangre fluye de los orificios en el seno marginal a través de la zona marginal es recopilada en los senos venosos de la pulpa roja y restaurada la circulación11. El libre flujo de la sangre lava sobre el MZBs y expone a los antígenos en la sangre. El MZBs llevan el antígeno en el folículo por trasladar automáticamente entre la zona marginal y el interior del folículo, que no está expuesto a la sangre. Así, como lanzadera de MZBs hacia el folículo, debe migrar la fuerza de esquileo del flujo arterial12 (figura 1A).

En este protocolo, se describe cómo determinar cuantitativamente cómo las células inmune tales como MZBs respuesta in vitro de alto flujo o no flujo, para revelar cómo están programados para migrar en vivo. En el primer paso, MZBs son purificadas de un bazo de ratón mediante bolas magnéticas acopladas a anticuerpos de kits disponibles en el mercado. MZBs recientemente aisladas son introducidos en el pozo de una diapositiva de la cámara de flujo, les permitió asentarse en ligandos de integrinas y expuestas al flujo del tampón de migración usando un sistema de bomba (figura 2A). Las células son imágenes mediante un sistema de microscopia video Time-lapse. Las imágenes son luego procesadas para el análisis con un plugin gratuito de ImageJ, MTrack213,14, para seguir automáticamente las células. Las pistas pueden cuantificarse entonces la libre Ibidi quimiotaxis herramienta15 para determinar varios parámetros como velocidad, rectitud y el índice de migración. Estos valores pueden utilizarse para determinar los efectos de los inhibidores de la migración, estimuladores de células, quimiocinas y otros productos químicos que afectan la migración en la migración de esquileo del flujo inducido para entender las fuerzas que controlan el movimiento de células inmunitarias en vivo.

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Protocol

Todos los experimentos que implican el uso de animales han sido aprobados previamente por el Landesverwaltungsamt Halle (Sajonia-Anhalt), Alemania, según todas las pautas de la Facultad de medicina de la Universidad de Magdeburg de OVGU.

1. purificación de células MZB

  1. Leucocitos aislados.
    1. Sacrificar un 8 a 16 semanas de edad ratón y quitar el bazo16. Disociar el bazo en 5 mL de tampón de celda helada [solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 0,5% albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos (BSA)], usando un Disociador de tejido o majar suavemente el bazo a través de una malla de colador celular 70 μm en un pozo de una placa de 6 pozos con el émbolo de una jeringa de 5 mL.
    2. Transferencia de las células en tampón de células en un tubo cónico de 15 mL. Recoger las células adicionales añadiendo otro 5 mL de tampón de celda helada el tubo de Disociador de tejido o la malla de nilón en el pozo. Transferir el adicional 5 mL de buffer celular además de las células al tubo cónico. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT, 20 ° C) y descarte el sobrenadante.
  2. Realizar la lisis de glóbulos rojos.
    1. Resuspenda el precipitado de células en 1 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (gr) (150 m m de NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA) que es precalentado a RT. agregar un adicional 1,5 mL de tampón de lisis RBC y agitar para mezclar. Incubar a temperatura ambiente (20 ° C) para un total de 2 minutos, incluyendo el tiempo necesario para volver a suspender el sedimento.
    2. Añadir 7,5 mL de tampón de celda helada a la suspensión de células para detener la lisis. Centrifugar a 300 x g y 4 ° C por 10 min y descarte el sobrenadante.
    3. Resuspenda el precipitado de células en 1 mL de tampón celular y añadir un adicional 9 mL de tampón de la célula. Pipetear la suspensión de células de 10 mL a través de un filtro de separación previa de 30 μm en un nuevo tubo cónico de 15 mL para eliminar restos celulares.
    4. Centrifugar las células a 300 x g y 4 ° C por 10 min y descarte el sobrenadante. Resuspenda el precipitado de células en 500 μl de tampón de la célula. Mantener las células frías en posteriores pasos del procedimiento hasta la incubación en los portaobjetos de la cámara de flujo.
  3. Purificar MZBs.
    1. Añadir 50 μl de anticuerpos acoplado a biotina de un kit comercialmente disponible contra todas las células no deseadas, incluyendo CD43 (en las células no-B), CD4 (en las células de T), CD93 (en células B inmaduras) y Ter119 (de eritrocitos), a la suspensión de células en un tubo cónico. Agite o mueva el tubo suavemente para mezclar, pero hacer no agitar con vortex las células. Coloque el tubo cónico sobre un lecho de hielo en un ángulo casi plana y roca a 25 rpm durante 15 minutos.
    2. Añadir bolas magnéticas acopladas a anticuerpos anti-biotina en un volumen total de 100 μl de la suspensión de células. Siguen a la suspensión de células a 25 rpm en el hielo durante 20 min lavado las células agregando 5 mL de tampón celular, centrifugación a 300 x g y 4 ° C por 10 min y descartar el sobrenadante. Resuspenda las células en 1 mL de tampón de la célula.
    3. Agotar la suspensión de las células acoplado de grano magnético mediante la retención en una columna magnética. Etiquetado células (linfocitos no B y las células B inmaduras) de descarte. Recoger las células no etiquetados (células B maduras) en un tubo cónico de 15 mL que ha sido previamente revestido con una breve aplicación de 5 mL de tampón de la célula, con el fin de prevenir la adhesión inespecífica por MZBs.
    4. Lavar la suspensión celular con 5 mL de tampón de la célula. Centrifugar a 300 x g y 4 ° C por 10 min y descarte el sobrenadante. Resuspender células en 90 μl de tampón de la célula y añadir 10 μl de anti-CD23-juntado granos. Suspensión de células de la roca suavemente sobre hielo durante 20 minutos a 25 rpm.
    5. Lavar la suspensión celular con 5 mL de tampón de la célula. Centrifugar a 300 x g y 4 ° C por 10 min y descarte el sobrenadante. Resuspenda las células en 1 mL de tampón de la célula.
    6. Agotar la suspensión de las células acoplado de grano magnético mediante la retención en una columna magnética. Deseche el etiquetado (células foliculares B). Recoger las células no etiquetados (MZBs), en un tubo cónico de 15 mL que ha estado previamente cubierto con una breve aplicación de 5 mL de tampón de la célula. Quitar 50 μl de las células para el conteo y comprobación de pureza.
  4. El MZBs ordenadas para verificar la pureza de la mancha.
    1. Añadir 10% volumen (5 μl) del bloque Fc a 10.000 células en 50 μl e incubar a 4 ° C por 5 minutos añadir 50 μl de tampón de la célula que contiene 0,3 μl de B220-FITC (0,15 μg), CD21-PE (0.06 μg) y CD23-APC (0.06 μg) en un volumen total de 105 μl (cada anticuerpo diluido 1: 350) , o cualquier otra combinación de fluoróforos para distinguir entre las células B foliculares y MZBs. tinción de las células a 4 ° C en la oscuridad durante 15 minutos.
    2. Lavar las células una vez con 1 mL de tampón de la célula. Centrifugar a 300 x g y 4 ° C por 5 min y descarte el sobrenadante. Resuspender en 300 μL de tampón celular y adquirir muestras usando un citómetro de flujo y métodos estándar. Puerta energizados linfocitos, luego B220+ de las células y finalmente el CD23baja CD21alta células (figura 1B).
      Nota: El procedimiento por lo general rinde 500.000 MZBs por bazo de un ratón C57B/6.
  5. Preparar la MZBs migración de flujo.
    1. Lavado purificado una vez MZBs en 1 – 2 mL de tampón de migración fría [Hanks había equilibrada solución de sal (HBSS) que contienen cationes 10 mM Hepes, BSA libre de ácidos grasos 0,2%] para asegurarse de que el tampón de migración que contiene el catión no es diluido por tampón de PBS catión libre residual. Centrifugar a 300 x g y 4 ° C por 10 min y descarte el sobrenadante. Vuelva a suspender MZBs en tampón de migración fría a una concentración de 50.000 MZBs por 30 μl (equivalente a la cantidad cargada en un pozo de una diapositiva de la cámara de flujo).
      Nota: MZBs recientemente aisladas deben usarse tan pronto como sea posible. Sin embargo, son todavía capaces de migrar para hasta 8 horas o más después del comienzo del experimento de como se mantienen en hielo. Temperaturas óptimas deben analizarse para otros tipos de células. Por ejemplo, puede ser mejor mantener cultivadas las células T a 37 ° C hasta el comienzo de la migración.

2. flujo experimento

  1. Cubra el portaobjetos con la integrina ligando.
    1. El día antes del experimento, descongele una alícuota del ICAM-1 (400 μg/mL). Diluir el ICAM-1 por un factor de 1: 80 en PBS para alcanzar una concentración final de 5 μg/mL. Añadir 30 μl de ICAM-1 a una cámara en una diapositiva de flujo para cada película de migración requerida. Incubar el portaobjetos en una cámara húmeda a 4 ° C durante la noche.
      Nota: Cada diapositiva contiene cámaras de 6 y hasta 8 películas en una sola sesión puede fácilmente grabar.
  2. Bloquear los pocillos recubiertos.
    1. En el día del experimento, lavar la cámara añadiendo 100 μl de PBS a un pozo y retirar 100 μl del otro pozo de la cámara. Añadir 100 μl de solución amortiguadora de bloqueo (BSA libre de ácidos grasos de 2% en PBS) a una cámara e incubar lo portaobjetos en cámara húmeda a TA durante 1,5 horas.
    2. Lave la cámara mediante la adición de 100 μl de PBS a uno bien, retirar de la otra bien, luego agregar 100 μl de tampón de migración a la cámara. Almacenar los portaobjetos en cámara húmeda a temperatura ambiente hasta el experimento.
  3. Preparar la unidad de fluidos.
    1. Conecte una bomba de fluido, conecte la unidad de fluidos y encender el software de la bomba. Lavar el tubo una vez con 5 – 10 mL de tampón de migración, añada 11,7 mL de tampón de migración igualmente a ambos embalses y eliminar las burbujas de aire.
    2. Abrazadera para el tubo de unos 10 cm de la pieza del conector. Coloque la unidad fluídica en la cámara de incubación climatizadas en el microscopio.
    3. Establezca la opción diapositiva "μ-slide VI 0,4" y el tubo "blanco" en el software. Ajuste la tensión de esquileo deseada (por ejemplo, 4 dyn cm-2). Configurar el tiempo de la proyección de imagen a 30 min.
    4. Establecer el factor de calibración de la tubería mediante la determinación de la tasa de flujo a través de la tubería en mL/min medida el tiempo necesario para 2 mL de la solución del uno depósito del otro y dividir por 2. Hacer al menos 4 mediciones de precisión. Utilice la tasa de flujo real para establecer el caudal deseado y la tensión de esquileo introduciendo los valores en el software de la bomba.
  4. Preparar el sistema de proyección de imagen.
    1. Caliente previamente la cámara de incubación de microscopio, unidad de fluidos y alícuotas de buffer de migración a 37 ° C (figura 2B). Prueba de la bomba fluídica, asegurando que el tampón de migración fluye hacia adelante y hacia atrás en los embalses y que no hay ningún aire de burbujas en el sistema.
  5. Carga de las células en el portaobjetos.
    1. Limpiar la parte inferior de la diapositiva con un tejido empapado en etanol. Añadir 30 μl de la suspensión celular en un pozo de la cámara y retirar 30 μl de otro pozo. Incubar el portaobjetos con tapa en para evitar la evaporación a 37 ° C durante 30 minutos permitir que las células a conectar.
    2. Lentamente añadir el tampón de migración precalentado a cada pocillo de la diapositiva de la cámara de flujo hasta un menisco positivo se levanta fuera del pozo y eliminar las posibles burbujas de aire con la punta de la pipeta.
  6. Coloque el portaobjetos en la unidad de fluidos.
    1. Sujetar el portaobjetos a la platina del microscopio. Quitar el lado no marcado del tubo neumático de la pieza del conector y llenar el extremo con el tampón de migración hasta que un menisco positivo sin burbujas de aire se levanta fuera del final.
    2. Voltear el extremo de la tubería sobre e inserte en el bien superior de la cámara de flujo, absorbiendo derramado buffer con un pañuelo. Manteniendo el tubo con abrazadera, repita el procedimiento para el extremo marcado de la tubería.
  7. Imagen de las células.
    1. Cambiar el sistema de proyección de imagen para "Vivir" para establecer el foco en las células. Seleccione un campo de visión que está en el centro de la diapositiva. Enfoque de las células ligeramente para mejorar el contorno negro de la célula y producir un interior en blanco, que puede entonces ser thresholded a una forma de la célula redonda negro sobre un fondo blanco para su uso con un programa de seguimiento automatizado.
    2. Inicie el programa de secuencia de imágenes y registro 1 imagen cada 5 s durante 30 minutos con el objetivo de 10 x seco. Retire la pinza del tubo y encienda la bomba, entonces las células no adherentes se lavan y células adherentes comenzará a migrar. Imagen de 30 min o más usando un 10 x objetivo o superior, según se desee. Etiquetar y guardar la película.
  8. Separe la unidad fluídica de la diapositiva.
    1. Al final del proyección de imagen programa, reiniciar la bomba para el experimento siguiente: vuelva a colocar la abrazadera a la tubería, retire el tubo de la diapositiva, vuelva a colocar la pieza de conector, abra la abrazadera y utilice el control manual de la bomba para empujar varios mL de tampón de una reserva oir a la otra para eliminar las burbujas de aire. Vuelva a colocar la abrazadera y coloque la tubería sujeta a la platina del microscopio para la próxima película.
      Nota: El protocolo puede ser en pausa indefinidamente aquí. Si usa un inhibidor o modificador de migración de la célula, dependiendo de su modo de acción, añadir a la suspensión de células antes de instalarse en la sala de migración o el tampón de migración en la unidad de neumático.

3. migración análisis de pista

Nota: Las células pueden ser rastreadas automáticamente usando el plugin MTrack2 o a mano usando el plugin Manual de seguimiento de17. Automático de seguimiento funciona bien con MZBs porque estas células son principalmente redondas y permanecen así mientras migran, haciéndola fácil de umbral la imagen de las células a objetos negros sobre un fondo blanco. Seguimiento automático es más difícil si otros tipos de células se utilizan, como cultivan, activación células T CD8 +, ya que estas células se extienden durante la migración y se convierten en algo transparentes, lo que es difícil definir los bordes. En este caso, ya sea (1) las células pueden teñirse con un colorante fluorescente la vital para producir imágenes que pueden ser thresholded mostrar objetos negros en un fondo blanco, o (2) otros programas para delinear las células tales como detección de segmentación o borde de imagen puede ser utilizado. Manual seguimiento es una opción útil cuando se produce una imagen de alto contraste de contornos de la célula no es posible.

  1. Realizar el seguimiento manual usando el plugin.
    1. Instalar el plugin "Manual Tracking" en ImageJ y la película de ImageJ. En el menú de "Seguimiento de Manual", seleccione "Agregar nuevo tema". La película avanza automáticamente fotograma por fotograma, haga clic en el centro de una célula. Cuando la célula ha sido seleccionada en cada fotograma, seleccione "Agregar nuevo tema" para empezar a seguir a una nueva célula.
    2. Después de que las pistas han sido grabadas, copie los resultados de salida en una hoja de cálculo de datos. Cambiar el formato para la visualización de decimal para todas las celdas de la hoja de cálculo a cero lugares después del decimal. Guarde el archivo como un archivo de .txt "tab stop separados" para posterior análisis.
      Nota: Por lo general, 50 – 100 células se realiza el seguimiento, que tarda sobre 1 h para completar para una película de 20 minutos de unos 240 Marcos.
  2. Realizar el seguimiento automático usando el plugin de MTrack2. Descargar e instalar el plugin de kt MTrack2 según las instrucciones en el archivo (ver archivo de codificación complementaria).
    1. Umbral de las imágenes de la película de migración celular. Abra la pila imagen en ImageJ. Proceso de las imágenes en ImageJ para convertir el vídeo de color de imágenes de alto contraste que muestra las células como objetos negros sobre un fondo blanco (Figura 3A).
      1. Afilar las imágenes dos veces, refinar las imágenes y convertir las imágenes a 8 bits. Seleccione la "imagen | colocar y ajustar el brillo/contraste"en el menú el deslizador de contraste en contraste máximo, entonces las células aparecerán como objetos blancos sobre fondo negro. Seleccione la "imagen | ajuste umbral"submenú para asegurarse de que las células aparecen como objetos negros sobre un fondo blanco.
    2. Ejecutar la célula automática rastreo plugin "MTrack2 kt" (véase Archivo de codificación complementaria). Fijar los siguientes parámetros en la pantalla de opciones.
      1. Establecer el tamaño de partícula mínimo a 1 píxel y el tamaño de partícula máximo a 30 píxeles de MZBs.
      2. Para la velocidad (distancia máxima entre 2 partículas en sucesivos fotogramas de la película), si la densidad de células en el portaobjetos es alta, establezca este valor baja para no tener la pista de "saltar" de una célula a otra. Por MZBs, establezca este valor en 10 píxeles para capturar afloramientos, aunque MZBs generalmente no excederá de 2 pixeles en cuadros sucesivos que son 5 s apart.
      3. Para el número mínimo de fotogramas que una partícula tiene que estar presente para realizar un seguimiento, establezca este valor en el número de fotogramas en la película de MZBs (e.g., 240) para una película de 20 minutos con 12 marcos/min. Sin embargo, si las células son lo suficientemente rápidas como para dejar el campo de visión antes del final de la proyección de imagen, luego definir el número mínimo de fotogramas a menos de la duración de la película. Por ejemplo, con las células T de rápido movimiento, definir el número mínimo en el equivalente de 5-10 minutos de la proyección de imagen.
        Nota: Grabar una macro de estos pasos (umbralización y MTrack2-kt) para automatizar esta parte del procedimiento y ahorrar tiempo (véase Archivo de codificación complementaria). Usando la macro para registrar automáticamente una película en ImageJ tarda menos de un minuto.
    3. Copiar los resultados de salida en una hoja de cálculo de datos. Cambiar el formato para la visualización de decimal para todas las celdas de la hoja de cálculo a cero lugares después del decimal. Agregar una fila vacía en la parte superior de las pistas de la celda en la hoja de cálculo y eliminar la columna "D". Guarde el archivo como un archivo de .txt "tab stop separados" para posterior análisis la herramienta Ibidi Chemotaxis.
      Nota: El plugin de MTrack2 salidas de las pistas de células en hileras de columnas paralelas 75. Para el análisis de la herramienta de quimiotaxis Ibidi, las pistas de la célula deben estar en una sola columna. Para convertir la salida, el plugin de MTrack2 fue modificado para la salida ya sea en el formato original o como una sola columna (Figura 3B) (ver Archivo de codificación complementaria "MTrack2 kt", que está escrito en Java). Copie el archivo. Java en la carpeta de plugins ImageJ. En ImageJ, seleccione "Plugins > compilar y ejecutar". Reiniciar ImageJ y la versión modificada del MTrack2 deben aparecer en el menú de Plugins.
  3. Analizar celular pistas con la herramienta Ibidi Chemotaxis, descargar el v2.0 Ibidi quimiotaxis y migración de herramienta ("stand alone") y abrir el programa.
    1. Seleccione "Importar datos" y desplácese hasta los archivos de txt celular pista. Pueden seleccionar varios archivos al mismo tiempo. Archivos importados aparecen en el panel de "Datos" en rojo. Seleccione todos ellos y entrar los valores correctos en el menú de "Inicialización" para aplicar la configuración siguiente.
    2. Introduzca el número exacto o un rango del número de sectores (el número de fotogramas de la película).
    3. En el menú de calibración (X / Y calibración), introduzca el tamaño de un píxel. Busque esta información en el archivo de propiedades de la película. Para MZBs, se utilizó un objetivo de 10 x, proporciona un tamaño de pixel de 1.14 μm. En "menú de calibración | Intervalo de tiempo", introduzca la longitud de tiempo entre los fotogramas de la película.
    4. Aplicar la configuración. Seleccione "Trama de datos" para ver las parcelas de la pista y confirmar que abrirá los archivos de track. Desde este punto, muchas opciones están disponibles que se describen en la documentación del programa, incluyendo las pistas de la marca con diferentes colores basados en diferentes propiedades y muestra los valores individuales o promedio de la velocidad, hacia adelante la migración índice, relación directa y más (figura 3B).
      Nota: El MZBs toman unos 10 minutos para detectar y responder al flujo, presumiblemente por polarizando sus complejos integrina hasta el punto de flujo de avance de la célula. Un gráfico del índice de migración con el tiempo mostrará una caída inicial por debajo de cero, correspondiente a la primera pareja de minutos que la célula está expuesta al flujo, seguido por un incremento gradual hacia arriba hasta que los valores de índice de migración hacia adelante son positivos. Así, puede ser óptimo para excluir esos primeros minutos en los cálculos finales, a menos que este proceso es de interés.

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Representative Results

Se utilizó el protocolo descrito para comparar la migración de MZBs en portaobjetos recubiertos con ICAM-1 sin flujo (0 dyn/cm2) y expuestos a esfuerzo cortante flujo (4 dyn/cm2). Las células fueron seguidas automáticamente con MTrack2 y la pista que archivos eran overlaid en las películas de migración celular de no flujo (0 dyn/cm2) y (4 dyn/cm2) para mostrar la distribución y forma de las pistas (Figura 4A). Pistas de célula fueron importadas a la herramienta Ibidi quimiotaxis (TIC) para generar diagramas de pista de cada película (Figura 4B). El índice de migración media (llamados «FMIy» en las TIC), velocidad, rectitud (llamado "franqueza" en las TIC) y distancia en línea recta (llamada "Distancia Euclídea" en las TIC) de temas de celular de 4 peliculas cada una de ambas condiciones se calcularon en el Herramienta de quimiotaxis utilizando el comando "valores medidos". Estos valores promedio se copiaron en GraphPad prisma para generar gráficos y cálculo de significación estadística (figura 4).

Figure 1
Figura 1: MZB transporte. (A) modelo de MZB realizar la transición entre la zona marginal y el folículo en el bazo. MZBs requieren internalización de S1PR1, un receptor de S1P y CXCR5 funcional, un receptor del chemokine CXCL13, para entrar en el folículo. Además, para alcanzar el folículo, MZBs debe migrar contra la fuerza del flujo de sangre que emana de los poros en el seno marginal que envuelve el folículo. Si un MZB pierde adherencia a ICAM-1, el ligando para la integrina LFA-1, se empuja en la pulpa roja por la fuerza del flujo, donde cantidades crecientes de VCAM-1, el ligando para VLA-4, no apoyaría la migración. (B) flujo cytometry gating estrategia para probar la pureza del clasificado MZBs usando los anticuerpos contra B220, CD23 y CD21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: configuración de la cámara de incubación, la bomba, microscopio y sistema de fluidos. (A) imagen del sistema de bomba (Ibidi18) que consiste en una bomba con unidad de fluidos conectado y portátil ejecuta el software para el control de la bomba. Mayor imagen de ampliación: la diapositiva de cámara de flujo con 6 cámaras de flujo, el primero de ellos está conectado a la tubería de la unidad de fluidos. (B) configuración típica para medir migración in vitro de MZBs contra flujo. Un microscopio equipado con una cámara de calefacción (caja negra) que contiene la unidad de fluidos conectada a una bomba (objeto cuadrado azul a la parte inferior derecha del microscopio) fuera del microscopio. Mayor imagen de ampliación: la unidad de fluidos dentro del microscopio cámara de calefacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: cuantificación de imágenes datos. (A) imágenes representativas de un fotograma de una película de migración MZBs antes (izquierda) y después (derecha) umbral la imagen para convertir las células a objetos negros sobre un fondo blanco. Barras de escala en las dos imágenes de alta y baja magnificación = 100 μm. (B) panel de la izquierda: imagen de salida de resultados típicos del plugin MTrack2 (salida de una sola columna). Panel de la derecha: imagen de la herramienta después de la entrada de los resultados de la MTrack2 que muestra un diagrama de la pista de migrar MZBs y "valores medidos" Mostrar la ventana que muestra los promedios de parámetros como velocidad, índice de migración y franqueza (Ibidi quimiotaxis y migración 2.0 verde cajas), entre otros. Ajustes de calibración mostrados incluyen la resolución de pixel de 1.14 μm por píxel y un intervalo de tiempo de 5 s (0,083 min) cada fotograma de la película. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: ejemplo de resultados utilizando el protocolo para medir MZB transporte. (A) representante de imágenes fijas de MZBs migrantes con un recubrimiento de pistas desde el plugin de ImageJ "MTrack2 kt". Nota: los colores de la pista fueron fijados arbitrariamente por el plugin "Manual de seguimiento" para ImageJ. Barras de escala en ambos márgenes de alta y baja magnificación = 100 μm. (B) pista representante parcelas de migrar MZBs de la herramienta Ibidi quimiotaxis y migración 2.0. Rojo y negro líneas representan pistas de la célula que terminan por debajo o por encima del eje horizontal, respectivamente. En (A) y (B): a la izquierda, MZBs migrar con ningún flujo 0 dyn/cm2; derecha, MZBs migrar a un flujo de2 4 dyn/cm. (C) índice (FMIy) migración, velocidad, rectitud (franqueza) y la distancia de MZBs migrar no flujo (0 dyn/cm2) o flujo (4 dyn/cm2) (n = 4 ratones en 4 experimentos separados). Barras de error = media ± SD; Prueba de t de Student, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo adicional 1: MTrack2_kt.java. Haga clic aquí para descargar este archivo.  

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Discussion

Aquí describimos un método para el análisis de la migración de las células que detectan la fuerza de esquileo del flujo y responde modificando su migración. Un análisis de MZBs demostró que MZBs migran espontáneamente en ICAM-1 y en presencia de flujo, migrará el flujo. En nuestro trabajo anterior, mostramos que MZBs no migrar el flujo en VCAM-1, pero en cambio permanecen fijos en su lugar. La zona marginal esplénica murina contiene principalmente ICAM-1, mientras que la pulpa roja contiene ICAM-1 y VCAM-1. De estos datos, se podría inferir que MZBs migra el flujo mientras que en la zona marginal, pero no en la pulpa roja. Se validó el análisis en vivo con MZBs adherencia defectuosa que se mislocalized a la pulpa roja esplénica por la fuerza de flujo12. Por estas razones, MZBs representan un buen control positivo para la prueba el sistema de migración de flujo descrito aquí, incluso si el sistema es utilizado para el estudio de un tipo de células diferentes.

El aspecto más crítico del procedimiento es garantizar la coherencia en el manejo de la diapositiva de la célula. Debido a los aspectos cuantificables de la migración de la célula dependen del grado en que las células se adhieren a la diapositiva, cualquier disminución de la adhesión celular dificultaría resultados reproducibles. De inconsistencia en múltiples factores, incluyendo las temperaturas del tampón de migración o la caja de incubación climatizada puede resultar en disminución de adherencia celular (frío reduce la adherencia), niveles de cationes en la suspensión de células (cationes afectan a Unión de la integrina), Deslice el manejo (golpeando ligeramente o flexión de la diapositiva podría desalojar células) y densidad de la célula (colisiones entre células podrían afectar a parámetros de migración). Otros puntos sensibles durante el procedimiento son no pipetear el búfer en los pocillos de la diapositiva con demasiado fuerza antes de colocar el tubo (como esto podría reducir la adherencia de la célula) y mantener el tiempo necesario para los pasos de protocolo consistentes en cada experimento ( el tiempo de adaptación celular podría afectar la adherencia). En Resumen, cualquier posible influencia en la adherencia de la célula debe mantenerse constante a lo largo de repeticiones para producir datos de migración celular confiable.

Este método es fácil de configurar ya que utiliza el equipo disponible en el mercado y suministros y ninguno de los pasos requieren instrucción avanzada. Para el análisis de MZB, así como otros tipos de células como CD8 cultivadas+ T las células, las diapositivas con diferentes ligandos de integrinas de la capa son suficientes para observar la migración el flujo. Estudio de migración inducida por el flujo de respuesta a varios ligandos de integrinas conduce a identificación directa de activa integrins en la superficie de la célula, posiblemente revelando mecanismos relevantes para las funciones en vivo como con la migración de MZB el flujo en el ICAM-1 pero no VCAM-1. Sin embargo, también es posible añadir una capa de células endoteliales a las cámaras de flujo. Un ejemplo de la migración de células inmunes que es afectado por el flujo de cizalla es extravasación de células T a través de las capas endoteliales3. Este procedimiento se utiliza para desentrañar la activación de quimiocinas, selectinas y T cell adhesión a través de integrinas y a la migración de linfocitos del modelo a través de la barrera blood - brain. La única limitación a las células que pueden analizarse con este método es que debe ser capaces de sentir la fuerza del flujo como una señal direccional.

Aunque el método aquí descrito se utiliza para caracterizar el comportamiento celular como velocidad y giro, también se puede extender al análisis de los aspectos moleculares de la migración. Complejos moleculares correspondientes a migración inducida por el flujo, incluyendo integrinas LFA-1 y sus adaptadores citoesqueleto, se encuentra a 200 nM de la superficie de la diapositiva, susceptible de visualización con microscopía TIRF. Esta adición al método sería ideal para el estudio de las células de los ratones con mutaciones en las proteínas relacionadas con el citoesqueleto o el integrin. Muchas células inmunes emigrar en diversas fases de su desarrollo a través de flujos de sangre o linfa, la migración in vitro descrita puede utilizarse para probar sistemáticamente muchas clases de leucocitos cultivados o primarios para respuesta y revelan cómo son las células programado para migrar a una respuesta inmune in vivo. En conclusión, el análisis aquí descrito ofrece un método fiable y sencillo para analizar la migración inducida por el flujo de MZBs que puede extenderse también a otros tipos celulares.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 a K.-D.F.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

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References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
  13. ImageJ. MTrack2. , Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018).
  14. MTrack2. , Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018).
  15. ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018).
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).
  17. ImageJ. Manual Tracking. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018).
  18. ibidi. ibidi Pump System. , Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. (2018).

Tags

Inmunología e infección número 141 de las células B zona marginal migración flujo del esquileo integrinas adherencia adherencia intercelular molecule-1 (ICAM-1) vasculares de la célula molécula 1 de adhesión (VCAM-1)
Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro
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Tedford, K., Tech, L., Steiner, M.,… More

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. D. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

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