Summary

Анализ миграционных потока индуцированного сдвига мышиных маргинальные зоны B клеток In Vitro

Published: November 26, 2018
doi:

Summary

Маргинальные зоны B клеток (MZBs) реагировать силы сдвига потока путем переориентации их миграции путь вверх поток. Этот протокол показано, как записывать и анализировать миграции с помощью fluidics блока, насоса, Микроскоп съемочной системы и свободного программного обеспечения.

Abstract

Маргинальные зоны B клетки (MZBs) являются население B-клетки, которые находятся в мыши селезеночной маргинальных зонах, которые окутывают фолликулов. Чтобы достичь фолликулов, MZBs необходимо перенести вверх поперечной силы потока крови. Мы представляем здесь метод для анализа этого потока индуцированной MZB миграции в пробирке. Во-первых MZBs изолированы от Хандра мыши. Во-вторых MZBs поселились на Интегрин лигандов в поток камеры слайды, подвергается сдвига потока и образ под микроскопом во время миграции. В-третьих изображения перенос MZBs обрабатываются с помощью MTrack2 автоматическая ячейки отслеживания плагинов ImageJ, и результирующий треков ячейки являются количественно с помощью инструмента хемотаксис Ibidi. Миграции данных показывают, как быстро переместить ячейки, как часто они изменить направление, ли вектор сдвига потока влияет на их направление миграции и какие Интегрин лигандов участвуют. Хотя мы используем MZBs, метод может быть легко адаптирована для анализа миграции лейкоцитов, который реагирует на силы сдвига потока.

Introduction

Иммунные клетки являются наиболее подвижные клетки в организме человека и часто должны бороться с поперечной силы от крови и лимфы. Однако существует сравнительно мало исследований на сдвиг силы индуцированной миграции лейкоцитов1,2,3,,45. Мы представляем здесь надежный и количественный протокол для анализа реакции иммунной клетки потока в пробирке. Выполнение анализа не требуется изготовление компонентов, и все оборудование и расходные материалы являются коммерчески доступными. В протокол, включая анализ очищения и миграции клеток, может выполняться в один день. Наконец хотя мы описываем миграции маргинальной зоне В-клеток (MZBs), протокол может быть адаптирована для анализа миграции против потока других типов иммунных клеток. Таким образом это возможно использовать этот assay систематически анализировать широкий спектр лейкоциты с панелью всеобъемлющего условий.

MZBs являются население B-клеток, которые, в мыши, находятся только в селезенке и трансфер между интерьер фолликулов и маргинальных зонах6,,78,9. Маргинальные зоны — это слой клеток иммунных клеток примерно 5 – 10 толщиной. Слой клетки окружает фолликулов и состоит главным образом из MZBs и макрофагов, но также инвариантные естественных убийца клеток T (iNKT), дендритных клеток (DCs) и нейтрофилов, среди прочих10. Клетки в маргинальной зоне подвергаются однонаправленный кровотока, возникая от Селезеночной артерии, которые заканчиваются в маргинальных синуса, окружающих фолликула. Кровь течет из отверстия в маргинальных пазухи через краевой зоне и затем собраны в венозные синусы в красной пульпы и восстановлен в циркуляции11. Свободный поток крови моет над MZBs и подвергает их антигенов в крови. MZBs нести антигена в фолликул челночные автоматически между маргинальной зоне и внутри фолликула, который не подвергается крови. Таким образом как MZBs к фолликул, они должны перенести вверх поперечная сила в крови поток12 (Рисунок 1A).

В этом протоколе мы описываем как количественно определить, как иммунной клетки, такие, как MZBs реагировать или нет потока потока в пробирке, для того, чтобы выявить, как они запрограммированы для переноса в естественных условиях. На первом шаге MZBs очищаются от мыши селезенки, используя магнитные бусы, сочетании антитела от коммерчески доступных наборов. Свежевыделенных MZBs представил в колодец слайда потока камеры, разрешено селиться на Интегрин лигандов и воздействию потока миграции буфера с помощью насоса системы (рис. 2A). Клетки отражаются с помощью системы покадровой видео микроскопии. Затем изображения обрабатываются для анализа с бесплатный плагин ImageJ, MTrack213,14, автоматически отслеживать клетки. Треки могут быть количественно затем с бесплатный инструмент Ibidi хемотаксис15 для определения различных параметров, включая скорость прямолинейность и миграции индекс. Эти значения могут использоваться для определения воздействия миграции ингибиторы, стимуляторы клеток, chemokines и других химических веществ, влияющих на миграцию на индуцированного сдвига потока миграции для того чтобы понять силы, контролируя иммунные клетки движение в естественных условиях.

Protocol

Все эксперименты, связанные с использованием животных были ранее одобрены Landesverwaltungsamt Галле (Саксония-Анхальт), Германия, в соответствии с все руководящие принципы медицинского факультета OVGU Университета Магдебурга. 1. MZB клетки очистки Изолируйте лейкоцитов.</s…

Representative Results

Мы использовали протокол, описанные выше для сравнения миграции MZBs на слайдах ИКАМ-1-покрытием без потока (0 Дин/см2) и подвергается сдвига потока (4 Дин/см2). Клетки были автоматически отслеживаются с MTrack2 и в результате трек, что файлы были обложил на фильмы ми…

Discussion

Здесь мы описываем метод для анализа миграции клеток, которые обнаружить силы сдвига потока и реагировать, не изменяя их миграции. Анализ MZBs показал, что MZBs спонтанно мигрируют на ИКАМ-1 и в присутствии потока, будет мигрировать вверх поток. В нашей предыдущей работы мы показали, что MZBs н?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантов от «Deutsche Forschungsgemeinschaft» SFB 854/TP11 K.-д.ф.

Materials

VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
  13. ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
  14. . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
  15. . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  17. . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
  18. . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)

Play Video

Cite This Article
Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

View Video