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Neuroscience

Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

Published: March 12, 2019 doi: 10.3791/58879
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

Summary

O método de autoradiografia é rotineiramente usado para estudar a ligação de radioligands para cortes de tecido para determinação da farmacologia qualitativa ou quantitativa.

Abstract

Em vitro autoradiografia pretende visualizar a distribuição anatômica de uma proteína de interesse em tecido de animais experimentais, bem como os seres humanos. O método baseia-se a vinculação específica de um radioligantes ao seu alvo biológico. Portanto, seções congeladas do tecido são incubadas com radioligantes solução, e a ligação para o destino é posteriormente localizada por detecção de decaimento radioativo, por exemplo, usando filme fotossensível ou imagem de placas de fósforo. Autoradiograms Digitas resultantes exibem notável resolução espacial, que permite a quantificação e localização da ligação de radioligantes em estruturas anatômicas distintas. Além disso, quantificação permite a caracterização farmacológica de afinidade de ligante através de constantes de dissociação (Kd), constantes de inibição (Keu), bem como a densidade dos sítios de ligação (Bmáx) em tecidos selecionados. Assim, o método fornece informações sobre localização de alvo e seletividade de ligante. Aqui, a técnica é exemplificada com eosina caracterização do ácido de alta afinidade γ-hidroxibutírico (GHB) vinculação sites no tecido do cérebro de mamíferos, com ênfase especial em considerações metodológicas sobre o ensaio parâmetros, a escolha do radioligantes e o método de deteção.

Introduction

Autoradiografia é um método que fornece imagens de decaimento radioativo. A técnica é usada rotineiramente para estudar a distribuição de tecido de uma proteína de interesse em vitro com base em uma interação farmacológica específica entre um composto marcadas com radioisótopos e seu destino. Isto fornece informação directa sobre a seletividade do ligante para o alvo. Em vitro autoradiografia pode também ser utilizada para a determinação quantitativa dos parâmetros de ligação farmacológica de radioligands, tais como a constante de dissociação (Kd) e a densidade dos sítios de ligação (Bmáx), bem como para a determinação a constante de inibição (Ki) de concorrentes ligantes1,2. Comparado aos tradicionais homogenate radioligantes vinculação, autoradiografia tem a vantagem de ser capaz de visualizar a anatomia espacial e dando detalhes sucintas de padrões de expressão regional3. O método de autoradiografia, portanto, é uma alternativa relevante de imunocitoquímica, especialmente na ausência de um anticorpo validado. Autoradiografia é facilmente implementada em um laboratório de radioisótopos padrão dado a disponibilidade de um radioligantes adequado com a necessária especificidade farmacológica, acesso a um criostato micrótomo para a preparação de cortes de tecido e uma imagem adequada dispositivo que é capaz de analisar a distribuição de radioatividade nas seções respectivas tecido. Nomeadamente, um critério importante de seleção para o radioligantes é uma quantidade limitada de ligação a sites não-alvo. Isto pode ser para outras proteínas, membranas ou materiais como plástico ou filtros e é coletivamente conhecido como inespecificas. Geralmente, inespecificas é não saturável, mas podem ser saturável se envolve uma proteína específica de fora do alvo. A melhor forma de validar a verdadeira ligação específica é comparar aos tecidos falta o alvo, por exemplo, geneticamente projetado tecido (nocaute)4.

Aqui, a metodologia é ilustrada com a eosina caracterização do sítio de ligação de alta afinidade para ácido γ-hidroxibutírico (GHB) o cérebro de mamíferos. Compreender a interação farmacológica entre o GHB e o seu sítio de ligação é de relevância como o GHB é uma droga ambos clinicamente útil no tratamento da narcolepsia e alcoolismo5, mas, também, um constituinte natural do cérebro de mamíferos e um recreio Droga,6. Locais de alta afinidade GHB obrigatórios foram primeiro descritos usando vinculação de GHB [3H] de cérebro de rato homogenate7. Ao longo dos anos, mais estudos autoradiografia com [3H] GHB e o análogo [3H] NCS-382 mostrou uma alta densidade de binding sites em regiões prosencéfalo de rato8,9,10, rato9 , cérebro de macaco/humano e1112de porco. No entanto, a identidade molecular e a relevância funcional exata desses sites de ligação permaneceram indescritíveis.

Com a intenção de caracterizar ainda mais os sítios de ligação e para facilitar os estudos sobre o papel fisiológico de GHB, foram desenvolvidos vários radioligands, incorporando diferentes isótopos dotados com afinidades diferentes ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA e [125eu] BnOPh-GHB)13,14,15,16(revisto em17) (Figura 1). A combinação de radioligands de alta afinidade seletiva e uma densidade muito alta de tecido de binding sites permitiram a produção de imagens de alta qualidade usando o fósforo de imagem técnica9,11. Juntamente com um resumo dos pontos na criação de uma experiência de eosina e uma ilustração para exemplificar detalhes práticos, a seção de discussão enfatizará i) a escolha do radionuclídeo, ii) a escolha das condições de ensaio e iii) a utilização de fósforo placas de imagem contra a película de raio x. O objetivo geral deste trabalho é fornecer detalhes técnicos, metodológicos e científicos sobre a técnica de autoradiografia para informar sobre a distribuição tecidual e análise farmacológica de alvos de proteína.

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Protocol

Todo animal manipulação foi realizada em conformidade com as diretrizes da Inspetoria de Experimentação Animal dinamarquês.

Nota: O protocolo descrito aqui aborda a preparação do tecido (ou seja, tecido de cérebro de rato), em vitro ensaio eosina em detalhes suficientes para a criação do método em um novo laboratório, a exposição de imagem de placas de fósforo, bem como subsequente análise densitométricos de autoradiograms (Figura 2) com o objetivo de localizar e quantificar radioligantes vinculação em estruturas anatômicas distintas. Para comparação histológica, um protocolo para coloração de cresilo violeta está incluído. Além disso, a determinação de ligação não-específica com um ligante concorrente está incluída dentro do protocolo. Para uma descrição detalhada sobre como determinar Kd, Bmáx ou Keu, consulte anterior publicação4.

1. tecido preparação por Cryosectioning

  1. Eutanásia o mouse por deslocamento cervical e imediatamente dissecar o cérebro usando uma tesoura e pinça. Diretamente a prosseguir para a próxima etapa para evitar danos aos tecidos.
  2. Snap-congelar o tecido por submersão em pó gelo seco, gasoso CO2 ou isopentano. Transferir diretamente o tecido congelado para um criostato com a temperatura definida como-20 ° C. Alternativamente, armazene o tecido a-80 ° C até o processamento.
    Nota: Evite descongelar/congelamento repetido para reduzir o dano de tecido.
  3. Deixe o tecido adaptar à-20 ° C em criostato por 20 min antes de processamento adicional para evitar a ruptura do tecido.
  4. Cobrir o suporte do tecido com encastre meio fora do criostato e rapidamente Coloque a amostra de tecido congelado na orientação desejada enquanto meio de encastre é ainda líquido. Por exemplo, coloque o cérebro de rato verticalmente no cerebelo para atingir rostrais secções coronais. Transferir o suporte do tecido para o criostato e expor médio encastre a temperaturas abaixo de-10 ° C para endurecimento.
    Nota: Amostra de tecido frágil deve ser revestida em incorporação médio dentro dos moldes do tecido antes da montagem.
  5. Posicione o suporte do tecido em micrótomo do criostato. Ajuste a orientação do tecido para evitar seções inclinadas.
  6. Corte o tecido com a orientação de um atlas estereotáxica18 nas seções da espessura desejada (12 µm recomendado para [3H] rotulados ligantes). Cuidadosamente endireitar e desdobrar a seção com uma escova de tamanho pequeno, se necessário e degelo-monte a seção numa lâmina de microscópio. Sequencialmente, recolha as seções da região de interesse para replicação técnica desejada (por exemplo, 4 seções por slide).
  7. Permitir que as seções sobre os slides para secar por 1h antes de manusear ainda mais.
    Nota: Adição de material dessecante para slide caixas minimiza a umidade se acumulam sobre as secções de tecido. Procotol pode ser pausado aqui armazenando seções a longo prazo em caixas de slide a-80 ° C.

2. in vitro autoradiografia

PRECAUÇÃO: radioatividade. Trabalha em um laboratório certificado de acordo com os regulamentos locais. Utilizar vestuário de protecção. Elimine em conformidade com o decaimento radioativo ou terceirizar para uma empresa certificada.

  1. Descongele as seções pelo menos 30 min à temperatura ambiente (RT). Rotule os slides com condições experimentais. Use um lápis porque os slides vão ser banhados em álcool etílico durante coloração subsequentes.
  2. Coloque as lâminas na horizontal em bandejas plásticas.
    Nota: Slides sobre uma plataforma elevada dentro de bandejas plásticas de posicionamento facilita a sua manipulação.
  3. Pre-incubate as seções montadas sobre os slides no buffer de ensaio ajustado ao alvo em questão (para protocolo GHB, 50mm KHPO4 tampão pH 6.0 é usado) aplicando cuidadosamente um volume adequado para o slide (700 µ l para roedores secções coronais de 3-4).
    Nota: Certifique-se que cada seção é completamente coberta com o líquido.
    1. Cobrir as bandejas de plástico com uma tampa para evitar a evaporação e pre-incubar a temperatura relevante (para o protocolo GHB pre-incubate por 30 min em RT) sob constante suave (20 rpm) agitando um agitador de placa.
    2. Para a determinação da ligação não-específica, suplemento buffer de ensaio com concentração relevante de rotuladas composto (para o protocolo GHB, 1mm GHB).
      Nota: Pré-incubação pode não ser necessário.
  4. Decantar o líquido de pré-incubação de cada slide e transferir os slides para a bandeja de plástico.
  5. Para evitar a desidratação, incubar imediatamente as seções com concentração relevante de radioligantes no buffer de ensaio sob condições desejadas (para o protocolo GHB, 1 nM [3H] HOCPCA por 1h no RT) cobrindo as seções completamente com o radioligantes solução (700 µ l para roedores secções coronais de 3-4).
    1. Incube sob sob constante suave (20 rpm) tremendo de bandejas plásticas com tampa fechada.
      Nota: A concentração de radioligantes pode ser validada pelo contando uma alíquota em um contador de cintilação líquida.
  6. Remover a solução de incubação por decantar o líquido e transfira os slides em um rack de slide de microscópio. Seguir para a próxima etapa para evitar a desidratação da seção.
  7. Lave os slides. Para o protocolo GHB, lave com buffer de ensaio gelada duas vezes para 20 s e em seguida enxaguar duas vezes por mergulhar as lâminas em bandejas cheias com água destilada gelada para remover os sais. Posicione os slides verticalmente em racks para secar pelo menos 1 h no RT ou seque os slides por 5 min com um soprador de definir a temperatura fria.
    Nota: A lavagem deve ser otimizada, por exemplo, lavagem extensa pode ser úteis para diminuir inespecificas.
  8. Transferi os slides para um fixador externo contendo paraformaldeído (PFA) em pó para fixação da noite com vapores PFA em RT para proteger a integridade do complexo ligante-alvo.
    Atenção: O PFA é tóxico. Fixador de Positionthe no exaustor de fumo e evitar o contato de pele/olho com PFA.
  9. No dia seguinte, transfira os slides para uma caixa de dessecador contendo sílica gel para 3h no RT para eliminar a umidade.

3. exposição de placas de fósforo e digitalização

  1. Coloca as seções em uma gaveta de placa de imagem blindado radiação com o tecido virado para cima. Para posterior quantificação de radioligantes vinculação, incluem uma microescala [3H] em cada gaveta. Organizar as seções aleatoriamente e expor as seções para comparação directa no mesmo.
  2. Apaga o fósforo de trítio sensíveis placa imediatamente antes do uso de imagens, a fim de remover sinais acumulados de armazenamento e para eliminar sinais de fundo. Portanto, carregar a placa na máquina da imagem latente do fósforo e expô-la ao visível/infravermelho luz de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Retirar a placa da máquina da imagem latente do fósforo e imediatamente coloque-a sobre as seções na gaveta. Certifique-se de que a fita está completamente fechada. Expor as seções para a placa de imagem de fósforo por 3 dias no RT, protegido da luz.
  4. Porque a luz apaga sinal da placa de imagem, cuidadosamente Abra a gaveta no escuro e imediatamente transferir a placa de imagem na caixa escura de um Imageador de fósforo ou coloque o tonalizador de fósforo em um quarto escuro.
    Nota: Certifique-se de anotar o arranjo espacial dos slides durante a exposição, a fim de identificar cada amostra na imagem digital após análise. Portanto, placas de imagem de fósforo também exibem um canto cortado num ângulo bem distinto a fim de identificar a orientação correta da placa na imagem digital.
  5. Escaneie a placa com a maior resolução possível obter uma imagem digital.

4. opcional: Cresilo coloração violeta de seções do tecido

  1. Preparar a solução de cresilo violeta 1% através da mistura de 5 g de acetato de cresilo violeta em 500 mL de água desionizada (dH2O) até dissolver (aproximadamente 2h). Filtrar por papel de filtro usando um funil em uma nova garrafa de 500 mL. Ajuste o pH a 3,5-3,8.
  2. Posição o slide coloração definida sob a coifa. Prepare as bandejas com as seguintes soluções em bandejas de polipropileno brancas (exceto para-xileno):
    r. 50% ethanol/50% dH2O
    b. 70% ethanol/30% dH2O
    c. 100% de etanol
    m. 100% de etanol
    e. O 100% dH2
    f. 1% violeta de cresilo
    g. 0.07% de ácido acético (Adicionar 175 µ l de ácido acético a 250 mL de dH2O).
    h. 100% xileno em bandejas resistentes a solventes verdes
    i. 100% xileno em bandejas resistentes a solventes verdes
  3. Transferir os slides para a coifa e colocá-los em um rack de slide.
  4. Dissolva os lipídios através de crescente série graduada de etanol em dH2O a 100% de etanol (bandeja a-d) mergulhando os slides por 1 min.
  5. Hidratar os espécimes para dH2O através de decrescente concentrações de etanol (bandeja um-d em ordem inversa, seguido de bandeja e) mergulhando os slides por 1 min.
  6. Mergulhe as amostras em solução de cresilo violeta por 10 min.
  7. Lave os espécimes em 0.07% de ácido acético, levantando os slides acima e para baixo suavemente durante 4-8 s lavar os slides mergulhando na dH2O por 1 min.
  8. Desidratar os espécimes por imersão dos slides por 30 s em crescente concentração de etanol (bandeja a-d).
  9. Transferi as amostras através de duas bandejas de 100% de xileno (bandeja h e i) para saciar o etanol.
  10. Hidratar os espécimes para dH2O através de decrescente concentrações de etanol (bandeja um-d em ordem inversa, seguido de bandeja e) mergulhando os slides por 1 min.
  11. Remova as lâminas de solução salina com fórceps. Adicionar algumas gotas de solvente orgânico, montagem de mídia por slide e adicionar uma lamínula 24 x 60 mm na parte superior para proteger espécimes. Remova as bolhas de ar entre a amostra e a lamela pressionando suavemente no sentido do lamela.
    Nota: Mantenha as lâminas restantes em xilol durante a montagem para impedir a secagem.
  12. Seca os slides durante a noite em uma coifa no RT
  13. Obter uma imagem de amostra com um microscópio e objectivo de X 1,25.

5. densitométricos análise de imagem Digital

  1. Medir densidades ópticas relativas (hastes) de cada calibração padrão da microescala [3H] com um software de análise de imagem.
    1. Selecione uma área de igual tamanho para cada ponto da microescala [3H] usando uma ferramenta para criação de região de item de menu determinação da região. Atribua um número a cada área selecionada, clicando no número sob o rótulode item de menu.
    2. Exportar os valores de OD para cada ponto de calibração padrão clicando em arquivo | E xportar | relatório 2D região. Transferência de valores de haste para uma planilha e normalizar pelo tamanho da área selecionada. Realize a regressão linear para obter uma curva padrão para uma análise mais aprofundada densitométricos.
      Nota: Certifique-se de que as áreas selecionadas são rotuladas, para identificar os correspondentes valores ROD e amostras.
  2. Realizar a quantificação de autoradiograms usando o proprietário software de imagem, selecionando a região de interesse (ROI) usando uma ferramenta de criação de região em cada seção e medindo suas ODs. Selecione a mesma região em cada seção, criando um modelo para a região de interesse, que é copiado e ajustado manualmente para pequenas variações na anatomia do cérebro para cada autoradiogram. Identifica a anatomia do ROI por comparação de autoradiograms com um cérebro atlas18. Quando vários tratamentos são comparados, efectuar a análise cegos e randomizados para evitar seleção tendenciosa de ROIs.
  3. Exportar valores ROD e tamanhos de áreas selecionadas em uma planilha clicando arquivo | E xportar | relatório 2D região.
  4. Divida a haste medida do ROI selecionados por sua área para obter a densidade por área específica.
  5. Medir a haste do fundo da placa e exportar valores correspondentes de ROD e tamanho da área em uma planilha. Subtrai o sinal do fundo de cada valor de haste de cada ROI.
  6. Média as hastes de repetições de técnicas, ou seja, seção Replica usando tecido do mesmo animal.
  7. Usar a curva padrão para converter as hastes em unidades de radioligantes binding, i. e., equivalentes de tecido nCi/mg (TE).
    Nota: O termo TE é usado porque as normas são geradas com materiais simulando tecido.
  8. Expressam ligação pela conversão do ICN/mg para nmol/mg TE de acordo com a atividade específica do radioligantes (equação 1).
    Equation(1)
  9. Para obter valores de ligação específica, subtrai inespecificas de ligação total.
  10. Média a vinculação de cada biológico replicar usando a média de técnicos Replica de cada animal (obtido na etapa 5.6).

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Representative Results

Usando o protocolo descrito, a distribuição anatômica dos sites alta afinidade de ligação GHB foi visualizada com o análogo GHB marcadas com radioisótopos [3H] HOCPCA no cérebro de rato, que foi cortado em secções coronais, sagitais e horizontais (Figura 3 ). Observaram-se altos níveis de vinculação no hipocampo e córtex, ligação inferior no corpo estriado e não foi detectados no cerebelo, correspondente aos padrões de expressão relatada anterior da alta afinidade GHB sites9,10, 11,12. Como mostrado aqui, as estruturas anatômicas podem ser visualizadas usando diferentes planos de corte e integridade anatômica pode ser suportada pela coloração violeta cresilo. Para sites de alta afinidade de ligação de GHB, especialmente de regiões com baixo radioligantes vinculação, como o cerebelo, são confirmadas com posterior coloração do tecido (Figura 3). Coronais seções são mais frequentemente encontradas na literatura9,10. Eles são práticos para fins quantitativos, como uma maior quantidade de seções pode ser Obtida de um cérebro. Sagitais e horizontais seções têm a vantagem de visualizar a ligação durante a maior parte do cérebro de roedor dentro de uma seção, proporcionando grande visão. A Figura 4ilustra a conservação evolutiva dos sites alta afinidade GHB vinculação do cérebro de mamíferos. [3H] Sítios de ligação do HOCPCA foram detectados no rato, o rato, bem como no tecido de cérebro de porco permitindo comparação da anatomia cerebral bruta entre espécies. Em geral, conservação evolutiva e estudos da distribuição regional podem ajudar significativamente na caracterização de uma proteína de interesse, neste caso um novo alvo e, assim, podem dar indicações sobre a sua função fisiológica19.

Os sítios de ligação de GHB alta afinidade foram analisados com GHB radioligands, que apresentam diferentes afinidades para os locais obrigatórios mas actividades específicas comparáveis (Figura 5). [3H] HOCPCA anteriormente foi mostrado para ter um Kd 74 nM, que é superior do radioligantes comercialmente disponível [3H] NCS-382 com um Kd de 697 nM, ambos determinados em pH 6,0 por autoradiografia quantitativa9. Assim, [3H] HOCPCA é dotado de sensibilidade muito superior, levando a uma excelente relação sinal-ruído. Devido à baixa sensibilidade de [3H] NCS-382, maior radioligantes concentrações devem ser usadas para obter níveis semelhantes de vinculação (comparar y na Figura 5). Quando comparado com [3H] GHB, mesmo a altas concentrações de radioligantes (30 nM) são necessárias para alcançar níveis comparáveis de vinculação. Isto é, predominantemente, devido a afinidade significativamente menor (Keu de 4,5 µM) de radioligantes20. No entanto, a maior concentração de radioligantes também aumenta o nível de inespecificas9,10 , com uma relação sinal-ruído, consequentemente, menor. Esta série de experimentos destaca a importância de ter um radioligantes de alta afinidade para produzir imagens de alta qualidade.

Porque os sites GHB alta afinidade são expressos para níveis tão altos em regiões prosencéfalo (60 pmol/mg-17), a determinação de parâmetros farmacológicos por curvas de saturação é inerentemente difícil utilizando imagens de trítio padrão sensível do fósforo placas, devido ao risco de imagens saturadas. Portanto, Kd valores para [3H] HOCPCA e [3H] NCS-382 foram obtidos pelo primeiro determinante Keu valores de curvas de deslocamento homólogos e cálculo de Kd (Figura 6)9. Para a maioria dos radioligands, uma alternativa seria usar a diluição de isótopos como é feito rotineiramente em ensaios obrigatórios de homogeneizado. Além disso, Kd valores foram determinados valores de pH diferentes. Evidentemente, os sites GHB alta afinidade são rotulados mais eficientemente em pH 6,0 (figura 6A e Figura 6), desde que a mudança do ensaio condições de pH 7,4 substancialmente impacto afinidade de ligante. Assim, o Kd para [3H] HOCPCA em pH 7,4 é aproximadamente 30 vezes superiores numericamente em pH 6,0. Aumentar o pH mais resulta em um maior grau de ligação não-específica, que se torna uma ressalva quando usando [3H] NCS-382, onde apenas pequenas quantidades de ligação específica podem ser obtidas em pH 7,4 (Figura 6E). Isto na verdade dificulta a determinação de parâmetros farmacológicos usando este radioligantes no pH fisiológico9, ilustrando novamente o poder em ter um radioligantes com como alta afinidade quanto possível.

Figure 1
Figura 1: estruturas de radioligands os sítios de ligação alta afinidade GHB. O ácido carboxílico [3H] 3-hydroxycyclopent-1-eno ([3H] HOCPCA)14, [3H] (E, RS) - 6,7,8,9 - tetrahidro-5-hidroxi-5H- benzocyclohept-6-ilideno ácido acético (NCS-382) ([3H] NCS-382)15 e o ácido γ-hidroxibutírico [3H] ([3H] GHB)16 como tritiada radioligands com atividade específica comparável (20-40 Ci/mmol), bem como [125I]4-hydroxy-4-[4-(2-iodoben-zyloxy)phenyl]butanoate ([ 125eu] BnOPh-GHB)13 , com uma actividade molar estimada de 2000 Ci/mmol21. O elemento estrutural do GHB é destacado em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Visão esquemática do protocolo em vitro autoradiografia. (1) o animal é sacrificado, tecido é dissecado e snap-congelado em gelo seco. Tecido é então seccionado em um criostato, degelo-montadas em corrediças do microscópio e (2) seções são incubadas com radioligantes até a vinculação do equilíbrio. Para determinação da ligação não-específica, soluções são complementadas com um deslocador rotulada de uma estrutura química relacionada, mas não idêntica. (3) posteriormente, radioligantes desacoplado é removido por lavagem no buffer de ensaio e sais são eliminados por lavagem com água destilada H2O. Quando as seções estão secas, fixação do paraformaldehyde (PFA) é executada para estabelecer permanentemente a interação ligante-proteína. Seções são expostas então a imagem de placas de fósforo. (4) após suficiente tempo de exposição, as placas são verificadas para obter autoradiograms Digitas. (5), em última análise, análise de imagem é executada usando as definições das regiões de interesse (ROIs), e a ligação é quantificada. No exemplo mostrado, densidades ópticas (ODs) são ilustradas nas seções de córtex de rato (à esquerda) e o hipocampo (médio). Quantificação é feita por expor seções juntamente com uma microescala [3H] (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Seções do cérebro autoradiograms representativas de 1 ligação de HOCPCA nM [3H] para mouse. (A) radioligantes vinculando coronal, sagital e horizontal cortes histologicos para ilustrar a importância do seccionamento de avião a visibilidade das estruturas anatômicas. (B) cresilo violeta coloração correspondente de seções do tecido para verificar regiões anatômicas, particularmente de regiões com baixa/ausente radioligantes vinculação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Representação autoradiograms de 1 ligação de HOCPCA nM [3H] em espécies diferentes. Comparação de rato (A), (C) e (B) rato porco em vitro autoradiograms a fim de ilustrar a conservação evolutiva de ligação de sites a regiões corticais e hippocampal juntamente com bruto no cérebro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Fatias de quantificação de vinculação para os sítios de ligação de GHB alta afinidade com diferente sensibilidade para radioligands GHB por autoradiografia em vitro no cérebro do rato do córtex e hipocampo. Total vinculação é relatada como equivalentes de tecido fmol/mg (TE) para o (A) [3H] radioligands HOCPCA (1 nM) e (B) [3H] NCS-382 (7 nM) e (C) [3H] GHB (30 nM) (atividades específicas semelhantes). Ligação não-específica não foi detectada na presença de 1 mM GHB ou 1 mM HOCPCA para qualquer um do radioligands (não mostrado). Dados são apresentados como média ± DP de quatro repetições biológicas que cada um realizado em três repetições de técnicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Resultados representativos de eosina determinação do Kd e B valoresmáximo pelo deslocamento competitivo homólogo de [3H] HOCPCA e [3H] NCS-382 nas seções cortical de rato em pH 6.0 e pH 7,4 a fim de ilustra a influência do pH na afinidade de radioligands. (K,d e B omáximo foram calculadas utilizando o mesmo composto como radioligantes e concorrente,através de determinação inicial de K valores de22 ). (A) Autoradiograms com a melhor relação sinal-ruído para 1 ligação de HOCPCA nM [3H] em pH 6,0. (B) alterar o tampão de pH para 7,4 requer uma concentração mais elevada de HOCPCA [3H] (8 nM) para atingir níveis de vinculação significativa. (C) curvas de ligação de log-concentração resultante; média ± SEM. (D) 5 ligação de NCS-382 nM [3H] em pH 6.0 resulta em baixa inespecificas, Considerando que (E) 40 nM [3H] NCS-382 é insuficiente para obter ligação em pH 7,4. Curvas de ligação de log-concentração resultante (F); média ± SEM. dados foi obtido a partir de 3-4 repetições biológicas que cada um realizado em 3-5 repetições técnicas, apenas experimentos de NCS-382 [3H] em pH 7,4 foram realizadas com apenas 2 repetições biológicas. Para ambos os radioligands, 1mm que GHB foi utilizado para a determinação da ligação não-específica. Para obter detalhes sobre análise e cálculo de Kd e B omáximo, consulte9. Esta figura tem sido adaptada e reproduzida a partir de publicação anterior9 com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A qualidade de um ensaio de eosina mais frequentemente é determinada pela sensibilidade do radioligantes. Um grande fator que contribui é o radioisótopo selecionado, que é dado pela disponibilidade de ligantes conhecidos ou pela viabilidade de técnicas específicas de rotulagem para produzir ligantes com atividade específica apropriada (ou seja, a quantidade de radioatividade por mole de unidade de um radioligantes)23e com quantidades limitadas de degradação química. Um grande número de radioligands de ligantes conhecidos é rotulado com trítio9,10,24,25,,26, que infere várias vantagens. Em primeiro lugar, o trítio (3H) é caracterizado por uma longa meia-vida (12,43 anos) promovendo o armazenamento a longo prazo de lotes individuais. Em segundo lugar, a interação ligante-alvo não é distorcida por radionuclídeo como 3H-ligantes são biologicamente indistinguível de seus compostos de pai. Trítio emite baixa energia β–-partículas, que viajam apenas curtas distâncias no tecido, resultando em alta resolução espacial e, posteriormente, a maior distinção entre anatômico estruturas4. Não obstante, trítio rotulagem só pode ser produzido para render moderadamente altas actividades específicas. Isto é devido ao fato de que disponíveis 3H-fontes estão contaminados com hidrogênio não-radioativo. Geralmente, quanto maior a actividade específica, a menos radioligantes é necessária para produzir a deteção sensível23. Além disso, deve-se considerar que 3H-ligantes têm a possibilidade de se submeter a troca de hidrogênio com a água, dependendo da estabilidade das 3H-rótulo. Para compensar a expressão baixa ou muito baixa atividade específica, o iodo-125 pode ser usado como o radionuclídeo13. A actividade específica máxima de iodo-125 é aproximadamente 100 vezes maior do que a de trítio. No entanto, várias considerações adicionais precisa ser feita quando se trabalha com iodo-125. Por exemplo, a adição de iodo-125 normalmente induz alterações estruturais na molécula que podem impactar as interações ligante-alvo. Como iodo-125 tem uma meia-vida de 60 dias, correção de decadência diária deve ser considerada para atividade específica e quantificação de ligante-alvo interações23. 125 Eu-ligantes emitem fótons-γ e sensibilidade muito superior, apesar de produzem imagens de baixa resolução. Isto é devido a relação inversa entre a resolução e a energia máxima do isótopo (como discutido abaixo). Finalmente, em comparação com trítio, aumento tenha cuidado ao manusear o iodo-125, devido a maior energia do radionuclídeo.

Dependendo do nuclido, espessura de corte de tecidos pode influenciar a resolução. A baixa energia β–-radiação de trítio limita seu alcance de tecido para aproximadamente 5 µm devido ao egocentrismo. Como consequência, quantificação não é influenciada pela espessura do tecido quando a espessura for superior a 5 µm27,28. Pelo contrário, o decaimento radioativo de alta energia isótopos tem uma maior penetração do tecido, resultando em baixa resolução de imagem porque ligantes com uma maior distância para o meio da deteção, também, contribuir para a formação de imagem. Por conseguinte, seções mais finas promovem maior resolução para radionuclídeos de alta energia1.

O estabelecimento de um protocolo de eosina requer conhecimento das condições ideais de vinculação (por exemplo, buffer, pH e temperatura) e parâmetros farmacológicos do radioligantes em termos de afinidade e cinética. Se o Radioligante não tem sido caracterizada antes, estudos exploratórios são necessárias29. Escolher uma concentração ideal de radioligantes é guiada tanto por afinidade do radioligantes e a abundância de sítios de ligação. Normalmente, uma concentração refletindo 5 - 6 vezes Kd é usada para certificar-se de que todos os sites de ligação estão saturados de30. Outra abordagem visa produzir a maior relação de total-para-não-específica, vinculação selecionando radioligantes concentrações abaixo Kd31 e salvando radioligantes solução ao mesmo tempo. Esta abordagem é particularmente útil quando o sítio de ligação é altamente abundante no tecido examinado desde radioligantes altas concentrações aumentaria a chance de oversaturating autoradiograms, como o caso para [3H] HOCPCA e o GHB de alta afinidade sites de ligação9. Além disso, a fim de eficientemente rotular toda a população da proteína alvo, o radioligantes idealmente devem ligar para todas as conformações de um possível alvo. Especialmente na autoradiografia do receptor, o uso de agonistas pode revelar apenas um número parcial de receptores totais desde que alguns podem estar presentes nos Estados de baixa afinidade agonista. Em contraste, antagonistas neutras mais frequentemente exibem afinidade pelos receptores todos Estados26,29.

Além disso, experiências de vinculação são geralmente realizadas sob condições de ligação do equilíbrio. Portanto, o tempo necessário para chegar a vinculação de equilíbrio nas condições experimentais desejadas (concentração de radioligantes fixo, buffer e temperatura) deve ser determinado em experimentos de associação para garantir a vinculação do equilíbrio no âmbito da experiência de23,4,30. Após a incubação de radioligantes, radioligantes desacoplado é lavado pela incubação do vários com buffer de ensaio e normalmente seguida por lavagem em água destilada H2O. sinal-ruído rácios podem ser otimizados, ajustando a temperatura e o tempo depende da taxa de dissociação de radioligantes26,30,31.

Radioligands pode exibir ligação para materiais não-biológico, ou seja, ligação não-específica. Vinculação de radioligantes para componentes celulares que não sejam o alvo pretendido é definida como vinculação inespecíficas. A contribuição de ligação inespecífica a quantidade total de ligação de radioligantes é avaliada na presença de um ligante rotulado concorrente que tem como alvo o mesmo sítio de ligação como o radioligantes. Como o composto não-radioativo (propulsor) é fornecido em 10,000-fold excesso, ocupa o sítio de ligação e o radioligantes só podem vincular a sites26,31,32fora do alvo. Crucialmente, o composto sem rótulo deve ser de uma estrutura química diferente do radioligantes desde que isto diminui o risco de deslocando ambos vinculação específica, bem como não-específica,23. Ligação não-específicos decorrentes da ligação às membranas pode ser um grande problema, especialmente no caso de radioligands bastante lipofílicos. Em alguns casos, os procedimentos de lavagem extensa podem remover radioligantes limite non-receptor e, portanto, melhorar o específico de vinculação rácios29.

Ao escolher um buffer de ensaio, é crucial para considerar o efeito da força iônica e pH na interação ligante-alvo. Especialmente eletrostáticas interações entre ligantes polares e hidrofílicas componentes de vinculação sites são influenciadas pela força iônica do buffer. Portanto, a suplementação com íons monovalentes ou divalentes pode impactar a afinidade eficaz constante23,33. Se a composição do tampão ideal para a interação ligante-alvo estudada é desconhecida, amortecedores comuns diferentes devem ser exploradas em experiências piloto. Amortecedores também podem ser complementadas com antioxidantes como o ácido ascórbico e inibidores da degradação de enzimas29,34. Além disso, a ionização de grupos específicos dentro do site de ligação ou sobre o ligante em si é influenciada pelo pH e tem efeitos críticos sobre a constante ligação de equilíbrio, as constantes de velocidade cinética e inespecificas de23,33. Por exemplo, sondando o GHB alta afinidade ligação local com diferentes radioligands GHB bem ilustra a importância de pH sobre o destino de vinculação (Figura 6). Caracterizar o pH ideal para a interação ligante-receptor pode também dar pistas sobre a importância do alvo em relação à sua relevância biológica.

Outro fator crítico na autoradiografia digital é o tempo de exposição, ou seja, o tempo necessário para alcançar autoradiograms quantificáveis, expondo as seções marcadas com radioisótopos tecido para imagem de placas de fósforo. Estimativas são baseadas na quantidade de radioactividade na amostra, a energia e a meia-vida do isótopo, bem como a relação sinal-ruído desejada. Prolongada em particular, os resultados de tempo de exposição em imagens saturadas e sinal de fundo elevado. Sinal de fundo elevado pode ser reduzida por armazenar fitas dentro de ambientes de chumbo-blindados para evitar a radiação cósmica1,4. No entanto, se suboptimal autoradiograms são alcançados, a amostra pode ser exposta várias vezes, desde que o complexo ligante-alvo é fixo e permite-a meia-vida do radionuclídeo.

Placas de imagem de fósforo podem ser reutilizado e têm uma longa vida útil quando tratado corretamente, ou seja, flexão deve ser evitado e as placas devem ser armazenadas em um ambiente seco. A manipulação de imagens de placas de fósforo é guiada por sua sensibilidade à radiação cósmica e luz. Assim, é importante apagar a placa antes de cada uso para minimizar o sinal de fundo. Exposição de seções marcadas com radioisótopos do tecido para as placas de imagem é feita em fitas de radiação blindado completamente desprovido de luz. Ao transferir a placa para o scanner no final do tempo de exposição, qualquer luz ambiente também deve ser evitado como nem curto contato com luz branca reduz sinal acumulada. Além disso, as placas devem ser examinadas imediatamente após a remoção da amostra para evitar atenuação de sinal. Uma desvantagem do uso de imagem de placas de fósforo é o potencial aparecimento de artefactos e residual 'imagens fantasma' após uso repetido das placas1.

Trabalhar com trítio requer placas sem um revestimento protetor para permitir que a radiação de baixa energia alcançar os cristais de fósforo de imagem. Placas de imagem de fósforo de trítio sensível são, portanto, mais sensíveis à contaminação ou danos devido ao manuseio incorreto. Uma vez contaminados, placas de trítio-sensível não podem ser limpo e precisam ser substituídos. Fixação do complexo ligante-alvo com vapor de PFA reduz a contaminação potencial da placa, aumentando sua vida útil. Além disso, a desidratação do tecido na sequência de fixação é um passo crucial desde placas sensíveis de trítio são sensíveis à umidade. Devido à sua natureza delicada, placas de trítio-sensível não devem ser usadas para outros isótopos1,4. Em contraste, as placas para isótopos de alta energia, tais como o iodo-125 são mais robustas e sua superfície nem pode ser limpos esfregando-se com etanol a 70%.

Radiosensitive filme tem sido tradicionalmente usada para a gravação espacial do decaimento radioativo. Enquanto imagens com alta resolução podem ser obtidas, autoradiografia filme tem várias limitações. Além da necessidade de produtos químicos perigosos e uma câmara escura para o desenvolvimento, a película de raio x caracteriza-se por uma estreita faixa dinâmica. Portanto, pode ser necessário para expor seções marcadas com radioisótopos repetidamente com tempos de exposição diferentes para alcançar imagens saturadas não quantificáveis35. Além disso, a película de raio x apresenta sensibilidade limitada, resultando em tempos de exposição sustentada por espécime marcadas com isótopos de baixa energia, ou seja. decaimento do trítio pode exigir vários meses de exposição. Baixa sensibilidade combinada com pequena escala linear faz a técnica extremamente demorado, especialmente quando as condições de ensaio ideal tem que ser determinado primeiro1,35.

Com o desenvolvimento de placas de imagem de fósforo, várias destas limitações foram abordados35,36,,37. As placas de imagem servem para armazenar temporariamente imagens de decaimento radioativo, que representa o arranjo espacial de radioligantes na amostra de tecido. Photostimulable BaFBr:Eu2+ cristais de fósforo são usados para capturar a energia radioativa emitida pela amostra, como resultados de radiação (por exemplo, raios x, raios gama ou partículas beta) de alta energia na excitação de UE2+ UE3+ e consequente captura de elétron lançado no fósforo lattice de4,,37. Expondo a placa de imagem de luz visível ou infravermelho reverte a reação, ou seja, o elétron preso é liberado e durante a transformação da UE3+ a UE2+ luminescência é emitida. A luz emitida é proporcional à quantidade de radioactividade e sua detecção por um fotomultiplicador permite a criação de um autoradiogram digital37. Este sistema proporciona um aumento na sensibilidade acompanhada por uma acentuada redução no tempo de exposição do mês para dias3. Além disso, a gama dinâmica linear é consideravelmente aumentada, que reduz a possibilidade de imagens saturadas. Linearidade é dado dentro de quatro a cinco ordens de magnitude e foi validada repetidamente3,35,36,37,38. Apesar de autoradiografia filme ainda fornece resolução espacial superior, esforços em tecnologia de digitalização resultaram na melhoria da resolução de 300 a 25 µm (tamanho de pixel), permitindo a diferenciação detalhada entre regiões anatômicas3. Em geral, placas de imagem de fósforo são facilitar a aquisição de autoradiograms Digitas, tanto devido a um aumento linear de alcance e sensibilidade. Tempo de exposição reduzido e uma técnica de desenvolvimento simplificado significativamente levam a diminuição do tempo de análise de dados, permitindo uma taxa de transferência.

Comparado a autoradiografia, parâmetros farmacológicos úteis como afinidade e densidade caracterizam-se também comumente pela aplicação de radioligands em tecido homogeneizado vinculação ensaios. Este método tem a vantagem de produzir resultados medindo a radioatividade emitida por β com um detector de cintilação líquida em uma maneira eficiente de2. Sendo realizada em uma abordagem multi bem, por exemplo, em placas de 96 poços da microplaca, tais ensaios são úteis para triagem de bibliotecas de compostos e para um maior número de relações de concentração-dependente. Além disso, realizar análise de saturação com esta configuração é mais viável em comparação com autoradiografia, que exibe um risco de imagens saturadas com radioligantes altas concentrações. No entanto, realizar deslocamento homólogo de uma concentração de radioligantes baixa fixa com ligantes não-radioativo a fim de obter Kd e Bmáx contorna o problema de imagens saturadas (Figura 6)22. Autoradiografia e vinculação Homogenate produzem estimativas semelhantes para constantes de afinidade do ligante Considerando que a densidade do tecido da proteína de interesse pode ser subestimada na ligação homogeneizado. Assim, foi proposto que rompimento da membrana celular concomitante com a homogeneização do tecido pode resultar em perda de receptores ou alterado a vinculação condições3,33. Além disso, erros na dissecação de tecido podem produzir homogenates contaminados com tecido de regiões do cérebro adjacente. Em comparação, os padrões de vinculação nem complexo em pequenos núcleos são visualizados e diferenciável devido a resolução espacial anatômica na autoradiografia3,33.

Imuno-histoquímica também visualiza a distribuição de uma proteína de interesse anatomicamente. O método é capaz de produzir imagens com alta resolução anatômica, como componentes discretos de tecido podem ser identificados no nível celular e subcellular mesmo níveis usando microscopia eletrônica. Níveis de expressão são avaliados com base na intensidade da coloração. Não obstante, a quantificação absoluta dos níveis de expressão é difícil devido à falta de padrões de referência adequado39. Além disso, a imuno-histoquímica é dependente da disponibilidade de um anticorpo seletiva, bem validado, que muitas vezes é um problema na pesquisa do receptor.

Antes de decidir sobre a realização em vitro autoradiografia, várias considerações precisam ser feitas. Primeiro de tudo, preparação de tecido post mortem incluindo corte bem como repetidos congelamentos e descongelamentos possa influenciar a preservação de binding sites2. Além disso, o método depende da disponibilidade de uma adequada radioligantes, que apresenta alta afinidade e seletividade para o destino em questão2. O radioligantes não devem exibir a vinculação significativa para sites fora do alvo, e isso também deve demonstrar um perfil cinético favorável. Isto é necessário porque o complexo ligante-alvo deve permanecer intacto durante o escopo da experiência. Além disso, quando existem compostos não-radioativo adequados, a introdução do radionuclídeo pode tornar-se um fator crítico. Assim, a molécula de interesse deve ser equipada com adequada grupos funcionais para radiomarcação eficiente, que permite a produção de radioligands com atividade específica suficientemente elevada e estabilidade química40. Outra desvantagem em vitro autoradiografia é que o método só permite o uso de um animal uma vez. Mais elegantemente é a extensão na vivo por imagens métodos tais como a posição de emissão de positrões (PET), que permite a digitalização repetida do mesmo animal e determinação de ocupação e características de vinculação dinâmica. Animal de estimação é especialmente valiosa para o estudo da maior mamíferos41 e para otimização de dose em estudos pré-clínicos 42,,43,44.

Diversas modificações da técnica eosina estendem sua aplicação, tanto em termos de caracterização de alvos farmacológicos nos Estados saudáveis e doentes, bem como no desenvolvimento e na descoberta da droga. Primeiro de tudo, recentes avanços na tecnologia de imagem levaram ao desenvolvimento da autoradiografia em tempo real. Detectores de gás de partículas-α/β eliminam a necessidade de placas de imagem ou a película por medição directa de desintegrações, produzindo assim rápido digital autoradiograms45.

Além disso, em vitro autoradiografia permite estudos da funcionalidade do G receptores (GPCRs) em cima de informações sobre sua distribuição anatômica nos tecidos post-mortem. Esta variante do método envolve incubação de seções do tecido com uma marcada radioactivamente análogo da guanosina trifosfato (GTP), ou seja, [35S] guanosina 5'-γ-thiotriphosphate ([35S] GTPγS), juntamente com um agonista não-radioativo do GPCR. Quando o agonista liga e provoca uma resposta do GPCR, a incorporação de [35S] GTPγS podem ser localizados e quantificados através de autoradiografia, que reflete apenas o receptor ativado população2,46,47 .

Ex vivo autoradiografia representa uma outra versão da técnica, que avalia a associação regional de um radioligantes após a administração de um animal experimental vivo. Após o sacrifício do animal, cryosectioning do tecido em questão e resultado de exposição eosina em autoradiograms que refletem o radioligantes vinculação na vivo2. Ex vivo autoradiografia é comumente empregada em programas de descoberta e desenvolvimento de drogas para obter informações sobre o perfil farmacocinético de um chumbo composto, ou seja, sua absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) . Autoradiografia particularmente todo o corpo oferece uma visão sobre a distribuição de drogas para todos os órgãos e tecidos. No entanto, determinação da ligação não-específica e quantificação é mais difícil em comparação com em vitro autoradiografia devido à possível metabolismo e degradação do radioligantes e nenhum meio para lavar sem uma ligação ligante48.

Autoradiografia também é usada para testes preliminares e caracterização de ligantes de PET4. O carbono-11 de radionuclídeos de alta energia e flúor-18 são mais frequentemente usados para ligantes de PET. Animal de estimação é uma aplicação proeminente, não-invasivo para radioligands porque quantificáveis imagens 3D do radioligantes obrigatório em um animal vivo podem ser obtidas11,40,49.

In vitro a autoradiografia, usando de imagem de placas de fósforo representa um método de ensaio valioso para a caracterização farmacológica das interações ligante-alvo. O método produz resultados reprodutíveis pelo emprego de um protocolo relativamente simples e rápido, uma vez que foram estabelecidas as condições de ensaio ideal. Distribuição anatômica de uma proteína de interesse é determinada dentro de seu microambiente nativo, que permite o estudo de seu papel fisiológico, farmacológica e patológica nos tecidos saudáveis e doentes post-mortem de animais experimentais, bem como os seres humanos2,,47.

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Disclosures

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Acknowledgments

O trabalho foi financiado pela Fundação Lundbeck (Grant R133-A12270) e a Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Os autores agradecer Dr. Aleš Marek para o fornecimento de radioligantes [3H].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

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Neurociência edição 145 radioligantes radioativo autoradiografia afinidade expressão imagem latente do fósforo HOCPCA farmacologia de NCS-382 quantitativos de GHB ácido γ-hidroxibutírico
Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos
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Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, … More

Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

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