Summary

Autorradiografía como un método sencillo y potente para la visualización y caracterización de dianas farmacológicas

Published: March 12, 2019
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Summary

El método de autorradiografía se utiliza habitualmente para estudiar atascamiento de radioligands para las secciones de tejido para la determinación de la farmacología cuantitativa o cualitativa.

Abstract

Autorradiografía in vitro tiene como objetivo visualizar la distribución anatómica de una proteína de interés en tejidos de animales experimentales como en seres humanos. El método se basa en la unión específica de un radioligando a su destino biológico. Por lo tanto, las secciones de tejido congelado se incuban con la solución así, y el atascamiento al objetivo posteriormente se localiza por la detección de radiactividad, por ejemplo, mediante el uso de película fotosensible o las placas de la proyección de imagen de fósforo. Autoradiograms digitales resultantes muestran notable resolución espacial, que permite la cuantificación y localización de unión de radioligando en distintas estructuras anatómicas. Por otra parte, la cuantificación permite la caracterización farmacológica de la afinidad del ligando por medio de constantes de disociación (Kd), constantes de inhibición (K), así como la densidad de sitios de unión (Bmax) en los tejidos seleccionados. Así, el método proporciona información sobre la localización del objetivo y la selectividad del ligando. Aquí se ejemplifica la técnica autorradiográfica caracterización del ácido alta afinidad γ-hidroxibutírico (GHB) sitios en tejido fino del cerebro mamífero, con especial énfasis en consideraciones metodológicas sobre el análisis de enlace de Unión parámetros, la elección de la radioligand y el método de detección.

Introduction

Autorradiografía es un método que proporciona imágenes de decaimiento radiactivo. La técnica se utiliza habitualmente para el estudio de la distribución en los tejidos de una proteína de interés en vitro basada en una interacción farmacológica específica entre un compuesto radiomarcado y su objetivo. Esto proporciona información directa acerca de la selectividad del ligando el destino. Autorradiografía in vitro también se puede utilizar para la determinación cuantitativa de parámetros de enlace farmacológico de radioligands, tales como la constante de disociación (Kd) y la densidad de sitios de unión (Bmax), así como para determinar la constante de inhibición (Ki) de competencia ligandos1,2. Comparado con el tradicional homogeneizado así vinculante, autorradiografía tiene la ventaja de ser capaces de visualizar la anatomía espacial y sucintos datos de patrones de expresión regional3. El método de autorradiografía es por lo tanto una alternativa relevante para inmunocitoquímica, especialmente en la ausencia de un anticuerpo validado. Autorradiografía se implementa fácilmente en un laboratorio de radioisótopos estándar dado la disponibilidad de un radioligando apropiado con la especificidad farmacológica necesaria, acceso a un criostato para Microtomo para preparación de tejido y una adecuada proyección de imagen dispositivo que es capaz de analizar la distribución de la radioactividad en las secciones de tejido respectivo. En particular, un criterio de selección importante para el así es una cantidad limitada de enlace a sitios de destino no. Esto puede ser a otras proteínas, las membranas o materiales como plástico o filtros y colectivamente se conoce como fijación no específica. Generalmente, fijación no específica es no saturable, pero puede ser saturable si se trata de una proteína específica del objetivo. La mejor manera de validar la verdadera unión específica es comparar a tejidos que carecen el objetivo, por ejemplo, genéticamente diseñados (knock-out) tejido4.

Aquí, la metodología se ilustra con la caracterización autorradiográfica del sitio de unión de alta afinidad para el ácido γ-hidroxibutírico (GHB) en el cerebro mamífero. Comprensión de la interacción farmacológica entre el GHB y su sitio de Unión es de relevancia como el GHB es una droga tanto clínicamente útil en el tratamiento de la narcolepsia y alcoholismo5, pero también un componente natural del cerebro mamífero y un recreo drogas6. Sitios de unión de alta afinidad GHB primero fueron descritos usando Unión de GHB de [3H] a de homogeneizado de cerebro de rata7. Con los años, nuevos estudios de autorradiografía con [3H] GHB y el análogo [3H] NCS-382 ha demostrado una alta densidad de sitios en regiones del cerebro anterior de rata8,9,10, ratón9 de Unión ,11y mono humano cerebro12del cerdo. Sin embargo, la identidad molecular y relevancia funcional exacta de estos sitios de Unión se han mantenido esquivos.

Con la intención de caracterizar los sitios de Unión y facilitar los estudios sobre el papel fisiológico de GHB, se han desarrollado múltiples radioligands incorporando diferentes isótopos con afinidades diferentes ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA y [125I] BnOPh-GHB)13,14,15,16(revisado en17) (figura 1). La combinación de radioligands selectivo de alta afinidad y una densidad muy alta del tejido del enlace sitios han permitido la producción de imágenes de alta calidad usando el fósforo imagen técnica9,11. Junto con un resumen de los puntos prácticos en establecer un experimento autorradiográfica y una ilustración para ejemplificar detalles, hará hincapié en la sección discusión i) la elección de los radionucleidos, ii) la elección de las condiciones analíticas y iii) el uso de fósforo placas de imagen frente a la película de radiografía. El objetivo general de este trabajo es aportar detalles técnicos, metodológicos y científicos en la técnica de autorradiografía para informar sobre la distribución del tejido y análisis farmacológico de dianas de la proteína.

Protocol

Manejo de los animales fue realizado cumpliendo con las directrices de la inspección de Experimentación Animal danés. Nota: El protocolo descrito aquí cubre preparación de tejido (es decir, tejido de cerebro de ratón), el ensayo autorradiográfica en vitro en suficiente detalle para configurar el método en un nuevo laboratorio, la exposición a las placas de la proyección de imagen de fósforo así como posterior análisis densitométrico de autoradiograms (<strong cl…

Representative Results

Utilizando el protocolo descrito, la distribución anatómica de los sitios de unión de alta afinidad GHB se visualizó con el análogo radiolabelled de GHB [3H] HOCPCA en cerebro de ratón, que fue cortado en secciones coronales, sagitales y horizontales (figura 3 ). Se observaron altos niveles de enlace en el hipocampo y la corteza, enlace inferior en striatum y no vinculante fue detectados en cerebelo, correspondiente a los patrones de expresi?…

Discussion

La calidad de un ensayo autorradiográfica más a menudo se determina por la sensibilidad del radioligando. Un factor que contribuye es el radioisótopo seleccionado, que es dado por la disponibilidad de los ligandos conocidos o por la viabilidad de técnicas específicas de etiquetado para ligandos con actividad específica adecuada(es decir, la cantidad de radiactividad por la mole de la unidad de un radioligando)23y con cantidades limitadas de degradación química. Un gran número de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo fue financiado por la Fundación Lundbeck (Grant R133-A12270) y el Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Los autores agradecen a Dr. Aleš Marek para el suministro de radioligando [3H].

Materials

Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20×40 cm – Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597

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Cite This Article
Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).

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