Summary
Här presenterar vi ett stegvis protokoll för att undersöka den mitokondriella respiration och glycolytic funktion i Candida Albicans använder en extra flux analysator.
Abstract
Mitokondrierna är väsentliga organeller för cellulär metabolism och överlevnad. En mängd viktiga händelser sker i mitokondrierna, såsom cellandningen, oxidativ metabolism, signaltransduktion och apoptos. Mitokondriell dysfunktion rapporteras därför spela en viktig roll i svampdödande läkemedel tolerans och virulens sjukdomsalstrande svampar. Senaste data har också lett till ett erkännande av betydelsen av mitokondrierna som en viktig bidragsgivare till svamp patogenes. Trots betydelsen av mitokondrierna i svamp biologi, är standardiserade metoder för att förstå dess funktion dåligt utvecklade. Här presenterar vi ett förfarande för att studera basala syre materialåtgången (OCR), ett mått på mitokondriell respiration och extracellulära försurning priser (ECAR), ett mått på glycolytic funktion i C. albicans stammar. Den metod som beskrivs häri kan tillämpas på någon Candidaspp. stammar utan att behöva rena mitokondrier från intakt svamp cellerna. Dessutom detta protokoll kan också anpassas till skärmen för hämmare av mitokondriell funktion i C. albicans stammar.
Introduction
Invasiva svampinfektioner döda över 1,5 miljoner människor per år i hela världen. Detta nummer är på uppgång på grund av en ökning i antalet personer som lever med nedsatt immunitet, inklusive äldre, prematura spädbarn, transplantation mottagare och cancer patienter1. C. albicans är en opportunistisk mänsklig svamp patogener som är en del av den mänskliga mikrofloran. Den lever också slemhinnor och mag-tarmkanalen som kommensaler organism. C. albicans producerar allvarliga systemisk sjukdom hos personer som har immunbrister, som har genomgått en operation, eller som har behandlats med långa kurser av antibiotika. Candida arter rang bland topp tre till fyra orsakar av nosokomiala infektionssjukdomar (NID) i människor2,3,4,5,6,7. Av Candida infektioner blodomloppet årliga antalet uppskattas vara ~ 400 000 fall, med tillhörande mortaliteten 46-75%1. Den årliga dödligheten på grund av candidiasis är ungefär 10 000 i USA ensam. Omfattningen av NID orsakade av svamp återspeglas också i astronomiska patientens kostnader5. I USA överträffar den årliga kostnaden för behandling av invasiva svampinfektioner 2 miljarder dollar, att lägga till en enorm påfrestning för redan överbelastade hälso-och sjukvården. För närvarande är tillgängliga standard antimykotiska behandlingar begränsad på grund av toxicitet, allt vanligare läkemedelsresistens och läkemedelsinteraktioner. Därför finns det ett brådskande behov att identifiera nya svampdödande målmolekyler som resulterar i bättre behandlingsalternativ för patienter med hög risk. Upptäckten av nya läkemedel som agerar på svamp mål är emellertid komplicerat eftersom svampar är eukaryota organismer. Detta begränsar kraftigt antalet svamp-specifika målmolekyler.
Nyligen genomförda studier har visat att mitokondrierna är en viktig bidragsgivare till svamp virulens och tolerans mot svampdödande läkemedel eftersom mitokondrierna är viktiga för cellandningen, oxidativ metabolism, signaltransduktion och apoptos8 ,9,10,11. Glycolytic såväl som icke-glycolytic metabolism är avgörande för överlevnaden av C. albicans i däggdjur värd12,13,14,15,16. Dessutom har flera C. albicans mutanter saknar mitokondrie proteiner, såsom Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. visat sig vara defekt i filamentation, en viktig virulens faktor C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Dessutom dessa mutanter visades också att mildras för virulens i en musmodell av disseminerad candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Sålunda, svamp mitokondrier representerar ett attraktivt mål för läkemedelsutveckling. Studien av mitokondriell funktion i C. albicans är dock en utmaning eftersom C. albicans är petite negativa23, vilket innebär att det inte kan överleva utan det mitokondriella genomet.
Här beskriver vi ett protokoll som kan användas för att undersöka mitokondrie och glycolytic funktion i C. albicans utan att behöva rena mitokondrier. Denna metod kan också optimeras för att undersöka effekten av genetisk manipulation eller kemiska modulatorer på mitokondriella och glycolytic vägar i C. albicans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Detaljerad stegvis protokollet analysens beskrivs nedan, och protokollet schematiskt visas i figur 1.
1. C. albicans stammar och tillväxtförutsättningar
- Växer de C. albicans stammarna i flytande jäst extrakt-pepton-dextros (YPD) medium vid 30 °C i en inkubator shaker över natten.
Obs: Upprätthålla Candida stammar som fryst lager och växa på YPD-agar (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% dextros och 2% agar).
2. beredning av reagens
- Förbereda analyssubstratet enligt följande:
- För mitokondriefunktion assay, upplösa 1,04 g Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 pulver och 2 g glukos (2%) i 90 mL sterilt vatten och varma media till 37 ° C. Justera pH till 7,4 med 5 M NaOH och göra upp volymen med sterilt vatten till 100 mL.
- För glycolytic stress analys, lös 1,04 g RPMI 1640 pulver ensam i 90 mL sterilt vatten, varma media till 37 ° C och justera pH till 7,4. Fyll till 100 mL med sterilt vatten. RPMI 1640 pulver har ingen bikarbonat, som är avgörande för att övervaka den pH-förändringen som ett mått på Glykolys under analysen.
- Injektion föreningar.
- Förbereda 1 M glukos materiel i sterilt vatten och förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda 100 mM oligomycin lager i dimetyl sulfoxid (DMSO), alikvotens i små volymer och förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda 100 mM antimycin A lager i DMSO, alikvotens i små volymer och förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda 100 mM SHAM (salicylhydroxamic acid) lager i etanol på dagen för analys.
- Laga 1 M KCN i det sterila vattnet på dagen av analysen.
3. beläggning av assay plattan med Poly-D-lysin (PDL)
Obs: Utföra alla de nedanstående steg i en laminär huva.
- Lös Poly-D lysin i vävnadsodling grade vatten för att göra slutliga koncentration av den 50 µg/mL. Blanda väl och alikvotens i en 1,5 mL mikrocentrifugrör och förvaras vid-20 ° C på lång sikt.
Obs: 50 µL per brunn behövs, och för 24 brunnar, 1,2 mL krävs. Därför alikvot minst 1,3 mL per mikrocentrifug rör. - Tillsätt 50 µL per brunn och odla i rumstemperatur med locket täcks för 1-2 h.
- Aspirera lösningen och skölj en gång med 500 µL sterilt vävnadsodling grade vatten.
- Öppna locket och låt brunnarna till luft torka. Använda plattan på samma dag eller förvara vid 4 ° C i högst 2-3 dagar.
4. hydrering av sensorn patron
Obs: Utföra det här steget en dag innan experimentet.
- Öppna den extra fluxen Assay Kit och ta bort innehållet. Placera sensorn kassetten uppochned bredvid verktyget plattan (figur 2).
- Fyll varje brunn av verktyget plattan med 1 mL standard och sensorn kassetten tillbaka. Kontrollera att sensorerna som innehåller fluorophores (för att mäta syre och pH) är nersänkta i standard.
- Inkubera sensor patronen övernattning i en icke-CO2 inkubator vid 37 ° C.
5. växande och seedning celler i PDL-belagda plattorna
- Inokulera C. albicans i YPD buljong och växa över natten vid 30 ° C i en shaker på 200 rpm.
Obs: Baserat på assay designen och räntan, kan C. albicans också odlas i YPG eller minimalmedium. - På dagen för analys, späd ett lämpligt antal celler i analysmediet att ge en slutlig koncentration på 100 000 celler per 100 µL.
- Tillsätt 100 µL utspätt cellerna i varje brunn av assay plattan utom brunnar A1, B4, C3 och D6, som lägga till endast 100 µL av analyssubstratet för bakgrundskorrigering (figur 3).
- Överföra plattan till en icke-CO2 inkubator vid 37 ° C och inkubera i 60 min, som låter cellerna som följer den platta ytan.
6. test protokoll
Obs: Protokollet som beskrivs här är för formatet 24 brunnar av instrumentet. Volymer kommer att behöva justeras om ett annat format används.
- Mitokondriefunktion assay
- Beredning av föreningar
- Förbereda föreningar vid 10 x koncentration för mitokondriefunktion assay: förbereda 20 mM SHAM, 100 µM Oligomycin, 100 mM KCN, och 20 µM Antimycin A i motsvarande analyssubstratet.
- Tillsätt 50 µL SHAM i port A, 55 µL Oligomycin i port B, 62 µL KCN port C och 68 µL Antimycin A i port D (figur 4).
- Beredning av föreningar
- Glycolytic stress analys
- Beredning av föreningar
- Förbereda föreningar vid 10 x koncentration för glycolytic stress analys. Förbereda 100 mM glukos, 100 µM Oligomycin, 500 mM 2-Deoxy glukos (2 GD) och 20 µM Antimycin A i motsvarande analyssubstratet.
- Tillsätt 50 µL glukos i port A, 55 µL Oligomycin i port B, 62 µL 2-DG port C och 68 µL Antimycin A till port D.
- Beredning av föreningar
- Anställa extra flux analyzer, som mäter syre förbrukning (OCR) och extracellulära försurning skattesats (ECAR) av levande celler i ett 24-well platta format. Ställa in protokollet assay i förväg.
- Öppna den extra flux analyzer och konfigurera mallen assay med hjälp av fliken analys guiden och följ steg för steg instruktion att fylla i all information som skjuts ut under installationen. Generera gruppen layout som liknar visas i figur 5. Ställa in protokollet som visas i tabell 1. Ställ in dessa layouter väl framåt innan analys och spara i datorn. Vid tiden för analysen, återställa sparade protokollet genom att öppna motsvarande fil i alternativet Öppna fil i fliken analys guiden (figur 5).
- Ladda 10 x föreningar i respektive portar av hydrerad sensor kassetten som innehåller standard och fyll i transportören facket av extra flux analyzer. Starta kalibreringen genom att trycka på Start -knappen på skärmen.
- Tillsätt 350 µL av analyssubstratet försiktigt till cell plattan längs sidan av brunnarna att minimera cell störningar för att få den slutliga volymen till 450 µL.
- Ersätt verktyget plattan som innehåller standard med assay plattan och fortsätta.
- Ta bort sensorn patronen och plattan när analysen är klar. Spara filen i lämpligt målmappen.
7. dataanalys
- Använda området under kurvan - variansanalys (AUC-ANOVA) analys fliken i mjukvaran för att beräkna den signifikanta skillnaden mellan grupperna genom att välja respektive parametrarna (OCR eller ECAR) som visas i figur 6.
- Välj de grupper som behöver jämföras.
- Lägg till grupperna analys för ANOVA och klicka på Ok.
Obs: Denna AUC ANOVA analys kommer att lägga till ett nytt blad i filen där AUC beräknas för varje grupp och jämfört dem emellan av ANOVA. Detta ger en tabell med p värden att visa betydelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fokus i detta protokoll är att bestämma de bioenergetiska funktionerna av C. albicans bedömas av extra flux analyzer. En C. albicans mutant saknar mitokondriell protein Mam33 ingår också tillsammans med dess komplement stam, mam33Δ/Δ::MAM33 att studera effekterna av strykningen av en mitokondrie protein på OCR och ECAR. MAM33 kodar för en förmodad mitokondriell sura matrix protein och dess funktion i Candida är inte känt.
Cell nummer för extra flux assay
Vi anställd 1 x 105 C. albicans vildtypceller per brunn i extra flux-analysen, som visade en OCR av 145 pmol/min (figur 7), vilket är inom optimala intervallet 100-300 pmol/min för någon extracellulära flux analysmetod. Det är också viktigt att titrera den cell nummer för att få en optimal OCR före analysen eller när det finns en förändring i tillväxt medium sammansättning mellan olika analyser.
Analys av data
Arean under kurvan - variansanalys (AUC-ANOVA) analys fliken i mjukvaran användes för att beräkna den signifikanta skillnaden mellan grupperna genom att välja respektive parametrarna (OCR eller ECAR) som visas i figur 7. Denna analys läggs ett nytt ark till filen där AUC beräknades för varje grupp och jämfört dem emellan av ANOVA automatiskt, vilket gav en tabell över p-värden.
Mitokondriefunktion assay
I mitokondriell stresstestet börjar analysen med mäta basala syre materialåtgången (OCR) följt av injektion av hämmare av en alternativ oxidas (AOX), ATP-syntas och elektrontransport kedja komplex, IV och III. Förutom klassisk respiratoriska kedjan använder C. albicans också AOX smittvägen för energi generation24. Därför har vi undersökt effekten av AOX system på OCR genom att hämma dess aktivitet med hjälp av salicylhydroxamic syra (SHAM)25. Den mitokondriella funktion, som mättes som en syre materialåtgången (OCR) i pmol/min vid basal och efter injektion respektive hämmare visas i figur 7. Den basala OCR av vild typ, mam33Δ/Δ, och mam33Δ/Δ::MAM33 stammar visade inga skillnader (figur 7A och B). Dessutom observerades ingen signifikant skillnad i de basala ECAR mellan dessa stammar (figur 7C och D). Dock genom att hämma komplex IV av KCN, vildtyp och mam33Δ/Δ::MAM33 visade en betydande förskjutning mot i Glykolysen i motsats till mam33Δ/Δ, som avsevärt kunnat visa en kompenserande glycolytic Skift (figur 7 ( E), vilket tyder på att C-IV beroende glycolytic pathway är nedsatt hos mam33Δ/Δ mutant jämfört med vildtyp och mam33Δ/Δ::MAM33 stammar.
Glycolytic stress analys
I glycolytic stresstestet, celler var svalt för glukos för 1 h och de basala OCR och ECAR mättes. Vid svält, mam33Δ/Δ visade signifikant lägre OCR (figur 8A och B) och ECAR (figur 8C och D) jämfört med vildtyp och mam33Δ/Δ::MAM33 stammar tyder på en försämrad utilization av glukos för både andning och Glykolys när cellerna tvingas att villkoret svält. Efter injektion glukos, visade alla stammar stimulering av både OCR och ECAR. Även om oligomycin har mindre effekt på både OCR och ECAR, 2-GD, som är en kompetitiv hämmare av Glykolys, hämmar både OCR och ECAR. Specifikt, hämmar 2-DG delvis OCR, som hämmas ytterligare av Antimycin A. Däremot hämmar 2-DG nästan helt ECAR.
Tabell 1. Protokoll kommandon för analysen
Figur 1 . Schematisk framställning av experimentet vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 . Sensor patron (grön) placeras upp och ner nära verktyget plattan innan du lägger till standard. Fluorophores indikeras förtroendesökvägarna av pilar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Cell kultur plattan visar bakgrunden brunnar A1, B4, C3 och D6. Det blå märket visar skåran, orienterade till nere till vänster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Den övre delen av sensorn patronen visar portar A, B, C och D. Varumärket pilen visar skåran, orienterade till nere till vänster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Layouten av brunnar och grupptilldelning som visualiseras i programvaran. WT - vildtyp; MT - mam33Δ/Δ mutant; COMP-mam33Δ/Δ::MAM33 komplettera stam. Pilen märket visar fliken Öppna filen vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6 . Arean under kurvan (AUC) ANOVA analys fliken att beräkna betydelsen mellan grupperna. Välj de grupper som behöver jämföras och lägga till grupperna analys för ANOVA och klicka på ok. Denna AUC ANOVA analys kommer att lägga till ett nytt blad i filen där AUC beräknas för varje grupp och jämfört dem emellan av ANOVA. Detta ger en tabell med p värden att visa betydelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Mitokondriefunktion-analys C. albicans. Syreförbrukning och extracellulära försurning priser mättes i vilda typ, mam33 Δ/Δ, och mam33 Δ/Δ::MAM33 stammar av C. albicans. ) Ett realtid diagram över syre materialåtgången (OCR) på basal andning följt av sekventiell insprutning av SHAM (2 mM), Oligomycin (10 µM), KCN (10 mM) och Antimycin en (2 µM). (B) jämförelse av arean under kurvan (AUC) basala OCR mellan vilda typ, mam33Δ/Δ, och mam33Δ/Δ::MAM33 stammar av C. albicans visar ingen signifikant skillnad. (C) A realtid diagram av extracellulära försurning andelen (ECAR) på basal Glykolys följt av sekventiell insprutning av SHAM (2 mM), Oligomycin (10 µM), KCN (10 mM) och Antimycin en (2 µM). (D) jämförelsen mellan arean under kurvan (AUC) basala ECAR mellan vilda typ, mam33Δ/Δ, och mam33Δ/Δ::MAM33 stammar av C. albicans visar ingen signifikant skillnad. (E) jämförelse av arean under kurvan (AUC) ECAR mellan vilda typ, mam33Δ/Δ och mam33 Δ/Δ::MAM33 stammar av C. albicans efter injektion av C-IV-hämmare KCN visar betydande minskning glycolytic SKIFT i mam33Δ/Δ mutant jämfört med vildtyp och kompletterande stammar värden uttrycks som genomsnittligt ± medelfel medelvärdet. * p < 0,05, ** p < 0,001 anses som betydande av envägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 . Glycolytic stress analys i C. albicans. Syreförbrukning och extracellulära försurning mäts i vildtyp, mam33Δ/Δ mutant efter de var svalt för glukos följt av akut injektion av mättade glukos koncentration. (A) ett realtid diagram över syre materialåtgången när celler utsattes för basal ECAR följt av sekventiell insprutning av glukos (10 mM), Oligomycin (1 µM), 2-DG (40 mM) och Antimycin en (2 µM). (B) stapeldiagram visar arean under kurvan ECAR av basala Glykolys mellan vilda typ, mam33Δ/Δ, och mam33Δ/Δ::MAM33 stammar av C. albicans. (C) A realtid grafen av funktionen glycolytic efter celler utsattes för basal ECAR följt av sekventiell insprutning av glukos (10 mM), Oligomycin (1 µM), 2-DG (40 mM) och Antimycin en (2 µM). (D) stapeldiagram visar arean under kurvan ECAR av basala Glykolys mellan vildtyp, mam33Δ/Δ, och mam33Δ/Δ::MAM33 stammar av C. albicans värden uttrycks som genomsnittligt ± medelfel medelvärdet. * p < 0,05, *** p < 0,0005, *** p < 0,0001 anses som betydande av envägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bioenergetik extra flux assay fungerar som ett utmärkt verktyg att läsa ut mitokondriefunktion genom att mäta oxidativ fosforylering (OXPHOS)-beroende syreförbrukning i realtid. Dessutom kan en glycolytic funktion som är mätt som årstakt extracellulära försurning (förändring av extracellulära pH) också undersökas samtidigt i realtid analys.
Framgångsrika plätering av C. albicans i assay plattan är en av de kritiska steg i analysen eftersom inkubering av cellerna i PDL belagda plattorna tillåter cellerna att följa assay plattan. Visualisering av vidhängande C. albicans celler sker genom ljusmikroskop. Felaktig cell följsamhet kan leda till celler som flyter i brunnar, som kommer att påverka analys resultatet med inkonsekventa avläsningar mellan replikat. Likaså är det viktigt att utföra cell nummer titrering som det första steget i denna analys att erhålla en OCR mellan 100-300 pmol/min, vilket är en optimal räckvidd. Även är titrering föreningarna för att få den optimala koncentrationen också avgörande för att uppnå den optimala Svaren. Detta kan utföras när det finns en förändring i den basala medium sammansättningen.
DMEM är det vanligaste basala mediet i extra flux-analysen för däggdjursceller. I våra händer gav emellertid RPMI 1640 medium optimala resultat med C. albicans. Detta berodde främst på effekten av mitokondriell elektrontransport kedja komplex hämmare som fungerat bättre i RPMI 1640 medium jämfört DMEM.
I denna analys, vildtyp, användes mam33Δ/Δ, och mam33Δ/Δ::MAM33 stammar av C. albicans för att bedöma mitokondriell respiration och glycolytic effektivitet. Resultaten visar tydligt att borttagningen av MAM33 gen minskat den C. albicans förmåga att skifta till Glykolys under stress förhållanden såsom hämning av C-IV (figur 7C och 7E). Likaså när celler utsattes för stress tillstånd som glukos svält, äventyras både mitokondrie respiration och glycolytic effektivitet betydligt i mam33Δ/Δ mutant men inte i vildtyp och komplement stammar ( Figur 8). Därför beroende på experiment, kan kolkällor den RPMI 1640 också modifierats till glycerol eller galaktos, som tvingar cellerna att använda OXPHOS i stället för Glykolys.
Betydelsen av att använda extra flux analysen är att celler förmågan att utnyttja OXPHOS kontra Glykolys kan härledas genom att använda olika substrat och föreningar som stör mitokondriefunktion. Detta kan användas som en informativ verktyg för att förstå effekten av behandlingar eller gen på mitokondriefunktion och Glykolys i Candida albicans utan att isolera mitokondrier. Analysen mäter basala syre förbrukning (OCR), som är ett mått på mitokondriell andning, och extracellulära försurning skattesats (ECAR), som är ett mått på glycolytic funktion i båda närvaro av glukos och efter glukos svält. Extra flux cellulära analysen är väl anställd i en mängd olika däggdjur modeller26. Trots medicinska betydelsen av C. albicans, har forskning om svamp mitokondrierna hämmats något på grund av bristen på standardiserade experimentella rutiner att studera mitokondriefunktion och Glykolys i realtid.
Denna metod ger ett enkelt och bekvämt sätt att utreda den mitokondriella respiration och glycolytic effektivitet med hjälp av realtid extracellulära flux analys i C. albicans. I framtiden kommer kan denna analys också tillämpas för att studera den drog-effektivitetstestning använder ofta sysselsatta antimykotiska medel såsom flukonazol. Dessutom är en annan potentiell framtida tillämpning av denna metod i läkemedelsutveckling, särskilt för screening föreningar inriktning mitokondriefunktion av C. albicans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Forskning i NC lab stöds av National Institutes of Health (NIH) bidrag R01AI24499 och en New Jersey Health Foundation (NJHF) grant, #PC40-18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
