Vi præsenterer her, en trinvis protokol for at undersøge den mitokondrielle respiration og glycolytic funktion i Candida Albicans ved hjælp af en ekstra flux analyzer.
Mitokondrier er væsentlige organelles for cellulære metabolisme og overlevelse. En række vigtige begivenheder sted i mitokondrierne, cellulær respiration, oxidative metabolisme, signaltransduktion og apoptose. Derfor er mitokondriel dysfunktion rapporteret til at spille en vigtig rolle i svampedræbende stof tolerance og virulens af patogene svampe. De seneste data har også ført til anerkendelse af betydningen af mitokondrier som en vigtig bidragyder til svampe patogenese. Trods vigtigheden af mitokondrier i svampe biologi, er standardiserede metoder til at forstå dens funktion dårligt udviklet. Vi præsenterer her, en procedure for at studere basal ilt forbrugssats (OCR), en foranstaltning af mitokondrie respiration og ekstracellulære forsuring satser (ECAR), en foranstaltning af glykolytiske funktion i C. albicans stammer. Den metode beskrevet heri kan anvendes til enhver Candidaspp. stammer uden at skulle rense mitokondrier fra de intakte svampe celler. Desuden, denne protokol kan også tilpasses til skærmen for hæmmere af mitokondrie-funktionen i C. albicans stammer.
Invasive svampeinfektioner dræbe over 1,5 millioner mennesker om året på verdensplan. Dette tal er stigende på grund af en stigning i antallet af mennesker, der lever med kompromitteret immunitet, herunder ældre, forhastet spædbørn, transplanterede og kræft patienter1. C. albicans er en opportunistisk menneskelige svampe patogen, der er en del af den menneskelige mikroflora. Det lever også slimhindeinfektioner og mave-tarmkanalen som en commensal organisme. C. albicans producerer alvorlig systemisk sygdom i mennesker, der har immun mangler, der har gennemgået kirurgi, eller der er blevet behandlet med lange kurser af antibiotika. Candida arter rang blandt de top tre til fire årsager til nosokomielle infektionssygdomme (NID) i mennesker2,3,4,5,6,7. Årlige globale antallet af Candida infektioner i blodet er anslået til at være tilfælde, ~ 400.000, med tilknyttede MORTALITET på 46-75%1. Den årlige dødelighed på grund af candidiasis er omtrent 10.000 i USA alene. Omfanget af NID forårsaget af svampe afspejles også i astronomiske patient udgifter5. I USA overgår den årlige udgift til behandling af invasive svampeinfektioner $2 milliarder, tilføje en stor stamme til allerede overbebyrdet sundhedsvæsen. I øjeblikket er tilgængelige standard svampedræbende behandlingsformer begrænset på grund af toksicitet, stadig mere udbredt resistens og stof-drug interaktioner. Derfor er der et presserende behov for at identificere nye svampedræbende stof mål, der vil resultere i bedre behandlingsmuligheder for højrisiko patienter. Opdagelsen af nye lægemidler på svampe mål er imidlertid komplicerede, fordi svampe er eukaryoter. Dette begrænser stærkt antallet af svampe-specifikke stof mål.
Nylige undersøgelser har vist, at mitokondrier er en kritisk bidragyder til svampe virulence og tolerance at svampemidler da mitokondrier er vigtig for cellulære respiration, oxidative metabolisme, signaltransduktion og apoptose8 ,9,10,11. Både glykolytiske og ikke-glycolytic stofskifte er afgørende for overlevelse af C. albicans i pattedyr vært12,13,14,15,16. Desuden har flere C. albicans mutanter mangler mitokondrielle proteiner, såsom Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. vist sig at være defekt i filamentation, en vigtig virulens faktor af C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Desuden disse mutanter blev også vist sig at være svækket til virulens i en musemodel af formidlet candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Svampe mitokondrier udgør således, et attraktivt mål for drug discovery. Men studiet af mitokondrie-funktionen i C. albicans udfordrende for C. albicans er petite negative23, hvilket betyder, at det ikke kan overleve uden den mitokondrielle genom.
Her, beskriver vi en protokol, der kan bruges til at undersøge mitokondrie og glycolytic funktion i C. albicans uden at skulle rense mitokondrier. Denne metode kan også være optimeret til at undersøge effekten af genetiske manipulation eller kemiske modulatorer på mitokondrie og glycolytic veje i C. albicans.
Bioenergetik ekstra flux assay fungerer som et fremragende værktøj til at læse den mitokondrielle funktion ved at måle oxidativ fosforylering (OXPHOS)-afhængig af iltforbrug i realtid. En glycolytic funktion, som måles som en ekstracellulære forsuring sats (ændring af ekstracellulære pH) kan derudover også undersøges på samme tid i realtid analyse.
Vellykket plating af C. albicans i assay plade er en af de afgørende trin i analysen fordi inkubation af celler i PDL overtru…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i NC lab er støttet af en National Institutes of Health (NIH) grant R01AI24499 og New Jersey Health Foundation (NJHF) tilskud, #PC40-18.
RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
KCN | |||
Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
pH meter | Accumet | AR20 | |
Phenol red | Sigma | P5530 | |
Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
SHAM | |||
Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |