Summary
Vi præsenterer her, en trinvis protokol for at undersøge den mitokondrielle respiration og glycolytic funktion i Candida Albicans ved hjælp af en ekstra flux analyzer.
Abstract
Mitokondrier er væsentlige organelles for cellulære metabolisme og overlevelse. En række vigtige begivenheder sted i mitokondrierne, cellulær respiration, oxidative metabolisme, signaltransduktion og apoptose. Derfor er mitokondriel dysfunktion rapporteret til at spille en vigtig rolle i svampedræbende stof tolerance og virulens af patogene svampe. De seneste data har også ført til anerkendelse af betydningen af mitokondrier som en vigtig bidragyder til svampe patogenese. Trods vigtigheden af mitokondrier i svampe biologi, er standardiserede metoder til at forstå dens funktion dårligt udviklet. Vi præsenterer her, en procedure for at studere basal ilt forbrugssats (OCR), en foranstaltning af mitokondrie respiration og ekstracellulære forsuring satser (ECAR), en foranstaltning af glykolytiske funktion i C. albicans stammer. Den metode beskrevet heri kan anvendes til enhver Candidaspp. stammer uden at skulle rense mitokondrier fra de intakte svampe celler. Desuden, denne protokol kan også tilpasses til skærmen for hæmmere af mitokondrie-funktionen i C. albicans stammer.
Introduction
Invasive svampeinfektioner dræbe over 1,5 millioner mennesker om året på verdensplan. Dette tal er stigende på grund af en stigning i antallet af mennesker, der lever med kompromitteret immunitet, herunder ældre, forhastet spædbørn, transplanterede og kræft patienter1. C. albicans er en opportunistisk menneskelige svampe patogen, der er en del af den menneskelige mikroflora. Det lever også slimhindeinfektioner og mave-tarmkanalen som en commensal organisme. C. albicans producerer alvorlig systemisk sygdom i mennesker, der har immun mangler, der har gennemgået kirurgi, eller der er blevet behandlet med lange kurser af antibiotika. Candida arter rang blandt de top tre til fire årsager til nosokomielle infektionssygdomme (NID) i mennesker2,3,4,5,6,7. Årlige globale antallet af Candida infektioner i blodet er anslået til at være tilfælde, ~ 400.000, med tilknyttede MORTALITET på 46-75%1. Den årlige dødelighed på grund af candidiasis er omtrent 10.000 i USA alene. Omfanget af NID forårsaget af svampe afspejles også i astronomiske patient udgifter5. I USA overgår den årlige udgift til behandling af invasive svampeinfektioner $2 milliarder, tilføje en stor stamme til allerede overbebyrdet sundhedsvæsen. I øjeblikket er tilgængelige standard svampedræbende behandlingsformer begrænset på grund af toksicitet, stadig mere udbredt resistens og stof-drug interaktioner. Derfor er der et presserende behov for at identificere nye svampedræbende stof mål, der vil resultere i bedre behandlingsmuligheder for højrisiko patienter. Opdagelsen af nye lægemidler på svampe mål er imidlertid komplicerede, fordi svampe er eukaryoter. Dette begrænser stærkt antallet af svampe-specifikke stof mål.
Nylige undersøgelser har vist, at mitokondrier er en kritisk bidragyder til svampe virulence og tolerance at svampemidler da mitokondrier er vigtig for cellulære respiration, oxidative metabolisme, signaltransduktion og apoptose8 ,9,10,11. Både glykolytiske og ikke-glycolytic stofskifte er afgørende for overlevelse af C. albicans i pattedyr vært12,13,14,15,16. Desuden har flere C. albicans mutanter mangler mitokondrielle proteiner, såsom Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. vist sig at være defekt i filamentation, en vigtig virulens faktor af C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Desuden disse mutanter blev også vist sig at være svækket til virulens i en musemodel af formidlet candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Svampe mitokondrier udgør således, et attraktivt mål for drug discovery. Men studiet af mitokondrie-funktionen i C. albicans udfordrende for C. albicans er petite negative23, hvilket betyder, at det ikke kan overleve uden den mitokondrielle genom.
Her, beskriver vi en protokol, der kan bruges til at undersøge mitokondrie og glycolytic funktion i C. albicans uden at skulle rense mitokondrier. Denne metode kan også være optimeret til at undersøge effekten af genetiske manipulation eller kemiske modulatorer på mitokondrie og glycolytic veje i C. albicans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Detaljeret trinvis protokollen af analysen er beskrevet nedenfor, og den skematiske protokol er vist i figur 1.
1. C. albicans stammer og vækstbetingelser
- Vokse C. albicans stammer i flydende gær Extract-pepton-Dextrose (YPD) medium ved 30 °C i en inkubator shaker natten over.
Bemærk: Fastholde Candida stammer som frosne bestande og vokse på YPD agar (1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% dextrose og 2% agar).
2. forberedelse af reagenser
- Forberede assay medium som følger:
- Til mitokondrie funktion assay, opløse 1,04 g Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 pulver og 2 g glukose (2%) i 90 mL sterilt vand og varme medier til 37 ° C. PH indstilles til 7.4 med 5 M NaOH og fyldes op til 100 mL med sterilt vand.
- For glycolytic stress assay, opløse 1,04 g RPMI 1640 pulver alene i 90 mL sterilt vand, varme medier til 37 ° C og ph indstilles til 7,4. Fyldes op til 100 mL med sterilt vand. RPMI 1640 pulver har ingen bikarbonat, som er kritiske for overvåge pH ændringen som en foranstaltning af glykolyse under analysen.
- Injektion forbindelser.
- Forberede 1 M glukose lager i sterilt vand og opbevares ved-20 ° C.
- Forberede 100 mM oligomycinets lager i dimethylsulfoxid (DMSO), alikvot i små mængder og opbevares ved-20 ° C.
- Forberede 100 mM antimycin A materiellet i DMSO, alikvot i små mængder og opbevares ved-20 ° C.
- Forberede 100 mM FINGERET (salicylhydroxamic syre) bestand i ethanol på dagen for analysen.
- Forberede 1 M KCN i sterilt vand om dagen i analysen.
3. belægning assay plade med Poly-D-lysin (PDL)
Bemærk: Udføre alle de nedenstående trin i en laminar hætte.
- Opløse Poly-D lysin i vævskultur grade vand for at gøre 50 µg/mL endelige koncentration. Bland det godt og alikvot i en 1,5 mL microcentrifuge rør og opbevares ved-20 ° C på lang sigt.
Bemærk: 50 µL pr. brønd er nødvendig, og til 24 wells, 1,2 mL er påkrævet. Derfor alikvot mindst 1,3 mL pr microcentrifuge tube. - Tilsæt 50 µL pr. brønd og Inkuber ved stuetemperatur med låg dækket for 1-2 h.
- Opsug løsningen og skyl én gang med 500 µL sterilt vævskultur grade vand.
- Åbn låget og tillade brønde til luft tørre. Brug pladen på den samme dag eller opbevares ved 4 ° C i højst 2-3 dage.
4. hydrering af sensor patron
Bemærk: Udføre dette trin en dag før forsøget.
- Åbn den ekstra flux Assay Kit og fjerne indholdet. Placer sensoren patron op og ned ved siden af den nytte plade (figur 2).
- Fyld hver godt af nytte plade med 1 mL af kalibratoren og placere sensoren blækpatronen tilbage. Sørg for, at sensorer, der indeholder fluorophores (for at måle ilt og pH) er nedsænket i kalibratoren.
- Inkuber sensor patronen natten over i en ikke-CO2 inkubator ved 37 ° C.
5. dyrkning og såning celler i PDL-belagte plader
- Podes C. albicans i YPD bouillon og vokse natten over ved 30 ° C i en shaker på 200 rpm.
Bemærk: Baseret på analysen design og interessen, kan C. albicans også dyrkes i YPG eller minimal medium. - På dagen for assay, fortyndes et passende antal celler i assay medium at give en endelig koncentration på 100.000 celler pr. 100 µL.
- Tilføj 100 µL af de fortyndede celler i hver brønd af assay pladen undtagen wells A1, B4, C3 og D6, hvor tilføje kun 100 µL af assay medium for baggrundskorrektion (figur 3).
- Overføre pladen til en ikke-CO2 inkubator ved 37 ° C og Inkuber i 60 min, som vil lade cellerne overholde plade overflade.
6. assay protokol
Bemærk: Den protokol, der er skitseret her er for formatet 24-godt af instrumentet. Diskenheder skal justeres, hvis en anden format bruges.
- Mitokondrie-funktion assay
- Forberedelse af forbindelser
- Forberede forbindelser på 10 x koncentration til mitokondrie funktion assay: forberede 20 mM SHAM, 100 µM oligomycinets, 100 mM KCN, og 20 µM Antimycin A i den tilsvarende assay medium.
- Tilsæt 50 µL SHAM ind på port A, 55 µL oligomycinets i port B, 62 µL KCN i port C og 68 µL Antimycin A i port D (figur 4).
- Forberedelse af forbindelser
- Glycolytic stress assay
- Forberedelse af forbindelser
- Forberede forbindelser på 10 x koncentration for glycolytic stress assay. Forberede 100 mM glukose, 100 µM oligomycinets, 500 mM 2-Deoxy glukose (2DG) og 20 µM Antimycin A i den tilsvarende assay medium.
- Tilsæt 50 µL glukose i port A, 55 µL oligomycinets i port B, 62 µL 2-GD til port C og 68 µL Antimycin A til havn D.
- Forberedelse af forbindelser
- Ansætte ekstra flux analyzer, som måler ilt forbrug (OCR) og ekstracellulære forsuring sats (ECAR) af levende celler i en 24-godt plade format. Oprettet af assay protokollen på forhånd.
- Åbn ekstra flux analyzer og oprettet skabelonen analyse ved hjælp af fanen assay guiden og følg trin for trin instruktion til at udfylde alle de oplysninger, der springer ud under opsætningen. Generere gruppe layout som ligner vist i figur 5. Oprettet protokollen, som vist i tabel 1. Konfigurere disse layouts nå frem før analysen og gemme på computeren. På tidspunktet for analysen, skal du gendanne den gemte protokol ved at åbne den tilsvarende fil i den åbne fil valgmulighed i fanen assay guiden (figur 5).
- Indlæse 10 x forbindelser i de respektive havne hydreret sensor patron indeholdende kalibratoren og indlæse i bakken transportør af ekstra flux analyzer. Starte kalibreringen ved at trykke på knappen Start på skærmen.
- Tilføje 350 µL af assay medium forsigtigt til celle plade langs siden af brøndene at minimere celle forstyrrelser for at bringe de endelige mængden til 450 µL.
- Erstatte nytte pladen som indeholder kalibratoren med assay plade og fortsætte.
- Fjerne sensoren patron og pladen, når analysen er afsluttet. Gem filen i destinationsmappen passende.
7. dataanalyse
- Bruge arealet under kurven - variansanalyse (AUC-ANOVA) analyse fanen i softwaren til at beregne den betydelige forskel mellem grupper ved at vælge de respektive parametre (OCR eller ECAR), som vist i figur 6.
- Vælg de grupper, der skal sammenlignes.
- Tilføje til grupperne analyse for ANAVA og klik på Ok.
Bemærk: Denne AUC ANOVA analyse vil tilføje et nyt ark til den fil, hvor AUC er beregnet for hver gruppe og i forhold mellem dem af ANOVA. Dette vil give en tabel af p-værdier til at vise betydningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fokus i denne protokol er at fastslå de bioenergetic funktioner af C. albicans vurderet af ekstra flux analyzer. En C. albicans mutant mangler mitokondrie protein Mam33 er også inkluderet sammen med dens komplement stamme, mam33Δ/Δ::MAM33 at studere virkningerne af sletning af en mitokondrie protein på OCR og ECAR. MAM33 koder til en formodede mitokondrie sure matrix protein og dens funktion i Candida er ikke kendt.
Celle numre for ekstra flux assay
Vi ansat 1 x 105 C. albicans vildtype celler pr. brønd i ekstra flux analyse, som viste en OCR på 145 pmol/min (figur 7), som er inden for det optimale interval på 100-300 pmol/min for enhver ekstracellulære flux assay. Det er også vigtigt at titrere celle nummer for at få en optimal OCR før analysen, eller når der sker en ændring i vækst medium sammensætningen mellem forskellige assays.
Analyse af data
Arealet under kurven - variansanalyse (AUC-ANOVA) analyse fanen i softwaren blev brugt til at beregne den betydelige forskel mellem grupper ved at vælge de respektive parametre (OCR eller ECAR), som vist i figur 7. Denne analyse har tilføjet et nyt ark til filen, hvor AUC blev beregnet for hver gruppe og i forhold mellem dem af ANOVA automatisk, hvilket gav et bord af p-værdier.
Mitokondrie-funktion assay
I mitokondrie stresstesten starter analysen med at måle basal ilt forbrugssats (OCR) efterfulgt af injektion af hæmmere af en alternativ oxidase (AOX), ATPsyntase og elektron transport kæde komplekser, IV og III. Ud over den klassiske respiratorisk kæde udnytter C. albicans også AOX vej for energi generation24. Derfor, vi undersøgte effekten af AOX system på OCR ved at hæmme dets aktivitet ved hjælp af salicylhydroxamic syre (SHAM)25. Mitokondrie-funktion, som blev målt som en ilt forbrugssats (OCR) i pmol/min på basal og efter indsprøjtning respektive hæmmere er vist i figur 7. Den basale OCR af vilde stammer, type, mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 viste ingen forskelle (fig. 7A og B). På samme måde, ingen signifikant forskel i de basale ECAR blev observeret mellem disse stammer (figur 7C og D). Men ved at hæmme komplekse IV af KCN, vildtype og mam33Δ/Δ::MAM33 viste et betydeligt skift i retning af glykolyse i modsætning til mam33Δ/Δ, som væsentligt undlod at vise en kompenserende glycolytic Skift (figur 7 E), hvilket tyder på, at C-IV afhængige glycolytic pathway er forringet i mam33Δ/Δ mutant sammenlignet med vildtype og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer.
Glycolytic stress assay
I de glykolytiske stresstest, celler blev sultet for glukose for 1t og basal OCR og ECAR blev målt. På sult, mam33Δ/Δ viste betydeligt lavere OCR (fig. 8A og B) og ECAR (figur 8C og D) sammenlignet med vildtype og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer tyder på en nedsat udnyttelse af glukose for både respiration og glykolyse når cellerne er tvunget til sult-tilstand. Efter injektion af glukose, viste alle stammer stimulation af både OCR og ECAR. Selvom oligomycinets har mindre effekt på både OCR og ECAR, 2-GD, som er en kompetitiv inhibitor af glykolyse, hæmmer både OCR og ECAR. Specifikt, hæmmer 2-GD delvist OCR, som hæmmes yderligere af Antimycin A. I modsætning hertil hæmmer 2-GD næsten helt ECAR.
Tabel 1. Protokollen kommandoer for analysen
Figur 1 . Skematisk fremstilling af eksperimentet venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Sensor patron (grøn) placeret hovedet nær nytte plade før du tilføjer kalibratoren. Fluorophores er angivet med pile. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Celle kultur plade viser baggrunden wells A1, B4, C3 og D6. Det blå mærke viser notch, orienteret mod nederst til venstre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Den øverste del af sensor patronen viser havne A, B, C og D. Varemærket pil viser notch, orienteret mod nederst til venstre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Layout af brønde og tildeling som visualiseret i softwaren. WT - vildtype; MT - mam33Δ/Δ mutant; COMP-mam33Δ/Δ::MAM33 supplere stamme. Pil mark viser fanen Åbn fil venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Arealet under kurven (AUC) ANOVA analyse fanen til at beregne betydningen mellem grupperne. Vælg de grupper, der skal sammenlignes og tilføje til grupperne analyse for ANAVA og klik på ok. Denne AUC ANOVA analyse vil tilføje et nyt ark til den fil, hvor AUC er beregnet for hver gruppe og i forhold mellem dem af ANOVA. Dette vil give en tabel af p-værdier til at vise betydningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Mitokondrie-funktion assay i C. albicans. Forbrug af ilt og ekstracellulære forsuring priser blev målt i vilde type, mam33 Δ/Δ, og mam33 Δ/Δ::MAM33 stammer af C. albicans. A) en real-time graf af ilt forbrugssats (OCR) på basal respiration efterfulgt af sekventielle injektion af FINGERET (2 mM), oligomycinets (10 µM), KCN (10 mM), og Antimycin en (2 µM). B) sammenligning af arealet under kurven (AUC) basal OCR mellem vilde type, mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer af C. albicans viser ingen signifikant forskel. C) en real-time graf af ekstracellulære forsuring sats (ECAR) på basal glykolyse efterfulgt af sekventielle injektion af FINGERET (2 mM), oligomycinets (10 µM), KCN (10 mM), og Antimycin en (2 µM). D) sammenligning af arealet under kurven (AUC) basal ECAR mellem vilde type, mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer af C. albicans viser ingen signifikant forskel. E) sammenligning af arealet under kurven (AUC) ECAR mellem vilde type, mam33Δ/Δ og mam33 Δ/Δ::MAM33 stammer af C. albicans efter injektion af C-IV hæmmer KCN viser signifikant fald i glykolytiske skift i mam33Δ/Δ mutant sammenlignet med vildtype og supplerende stammer værdier udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse middelværdi. * p < 0,05, ** p < 0,001 anses som betydelige af en-vejs ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 . Glycolytic stress assay i C. albicans. Forbrug af ilt og ekstracellulære forsuring blev målt i vildtype, mam33Δ/Δ mutant efter de blev sultet for glucose efterfulgt af akut indsprøjtning af mættede glukose koncentration. A) en real-time graf af ilt forbrugssats efter celler blev udsat for basal ECAR efterfulgt af sekventielle injektion af glukose (10 mM), oligomycinets (1 µM), 2-GD (40 mM), og Antimycin en (2 µM). B) søjlediagrammet viser arealet under kurven ECAR af basal glykolyse mellem vilde type, mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer af C. albicans. C) en real-time graf for funktionen glycolytic efter celler blev udsat for basal ECAR efterfulgt af sekventielle injektion af glukose (10 mM), oligomycinets (1 µM), 2-GD (40 mM), og Antimycin en (2 µM). D) søjlediagrammet viser arealet under kurven ECAR af basal glykolyse mellem vildtype, mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer af C. albicans værdier udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse middelværdi. * p < 0,05, *** p < 0.0005, *** p < 0,0001 anses som betydelige af en-vejs ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bioenergetik ekstra flux assay fungerer som et fremragende værktøj til at læse den mitokondrielle funktion ved at måle oxidativ fosforylering (OXPHOS)-afhængig af iltforbrug i realtid. En glycolytic funktion, som måles som en ekstracellulære forsuring sats (ændring af ekstracellulære pH) kan derudover også undersøges på samme tid i realtid analyse.
Vellykket plating af C. albicans i assay plade er en af de afgørende trin i analysen fordi inkubation af celler i PDL overtrukne plader tillade celler til at overholde assay plade. Visualisering af vedhængende C. albicans celler opnås ved lysmikroskopi. Forkert celle overholdelse kan føre til celler flydende i brønde, som vil påvirke analysen resultatet med inkonsekvent aflæsninger mellem replikater. Det er ligeledes vigtigt at udføre celle nummer titreringen som det første skridt i denne analyse at få en OCR mellem 100-300 pmol/min, hvilket er en optimal rækkevidde. Også, tilsætningen forbindelser for at opnå den optimale koncentration er også afgørende for at opnå den optimale svar. Dette kan udføres når der sker en ændring i den basale medium sammensætning.
DMEM er den mest almindeligt anvendte basal medium i ekstra flux assay for pattedyrsceller. Men i vores hænder, RPMI 1640 medium gav de optimale resultater med C. albicans. Det var primært på grund af effekten af mitokondrie elektron transport kæde kompleks hæmmere, der fungerede bedre i RPMI 1640 medium i forhold til DMEM.
I denne analyse, vildtype, blev mam33Δ/Δ, og mam33Δ/Δ::MAM33 stammer af C. albicans brugt til at vurdere mitokondrie respiration og glycolytic effektivitet. Resultaterne viser tydeligt, at sletningen af MAM33 gen reduceret C. albicans evne til at skifte til glykolyse under stress tilstande såsom hæmning af C-IV (figur 7C og 7E). På samme måde, når celler blev udsat for stress tilstand som glukose sult, både mitokondrie respiration og glycolytic effektivitet er betydeligt kompromitteret i mam33Δ/Δ mutant, men ikke i vildtype og supplement stammer ( Figur 8). Derfor, afhængigt af eksperimenter, carbon kilder i RPMI 1640 kan også ændres til glycerol eller galactose, som styrker cellerne til at bruge OXPHOS i stedet for glykolyse.
Betydningen af at anvende ekstra flux assay er, at cellerne evnen til at udnytte OXPHOS versus glykolyse ved hjælp af forskellige substrater og forbindelser, forurolige mitokondrie funktion, kan udledes. Dette kan bruges som et oplysende værktøj til at forstå virkningen af eventuelle behandlinger eller gene på mitokondrie-funktion og glykolyse i Candida albicans uden isolering af mitokondrier. Analysen måler basal ilt forbrugssats (OCR), som er en foranstaltning af mitokondrie respiration, og ekstracellulære forsuring sats (ECAR), som er en foranstaltning af glykolytiske funktion i både tilstedeværelsen af glucose og efter glukose sult. Ekstra flux cellulære assay er godt ansat i en lang række pattedyr modeller26. Trods medicinsk betydningen af C. albicans, været forskning i svampe mitokondrier lidt hæmmet på grund af manglen på standardiserede eksperimentelle procedurer at studere mitokondrie-funktion og glykolyse i realtid.
Denne metode giver en nem og bekvem måde at undersøge mitokondrie respiration og glycolytic effektivitet ved hjælp af real-time ekstracellulære flux assay i C. albicans. Dette assay kan i fremtiden også anvendes til at studere den stof-effektivitetsforsøgene ved hjælp af almindeligt ansat svampemidler såsom fluconazol. Derudover er en anden potentielle fremtidige anvendelse af denne metode i drug discovery, især for screening forbindelser målretning mitokondrie funktion af C. albicans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Forskning i NC lab er støttet af en National Institutes of Health (NIH) grant R01AI24499 og New Jersey Health Foundation (NJHF) tilskud, #PC40-18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
