Summary
在这里, 我们提出了一个逐步的协议, 以研究线粒体呼吸和糖酵解功能在白色念珠菌使用一个额外的通量分析仪。
Abstract
线粒体是细胞代谢和生存所必需的细胞器。线粒体中发生了多种关键事件, 如细胞呼吸、氧化代谢、信号转导和凋亡。因此, 线粒体功能障碍被报道在病原真菌的抗真菌药物耐受性和毒力中起着重要作用。最近的数据也使人们认识到线粒体作为真菌发病机制的重要因素的重要性。尽管线粒体在真菌生物学中的重要性, 但了解其功能的标准化方法还是很不发达。在这里, 我们提出了一个程序来研究基础耗氧率 (OCR), 线粒体呼吸的测量, 和细胞外酸化率 (ECAR), 一个测量糖酵解功能的 c. 白色念珠菌菌株。本文描述的方法可应用于任何念珠菌菌株, 而无需纯化完整的真菌细胞中的线粒体。此外, 该协议还可以定制, 以筛选线粒体功能抑制剂在白色念珠菌菌株。
Introduction
侵袭性真菌感染每年在全球造成150多万人死亡。这一数字正在上升, 原因是免疫受损的人数增加, 包括老年人、早产儿、移植接受者和癌症患者1。白色念珠菌是一种机会性的人类真菌病原体, 是人类微生物群的一部分。它也居住黏膜表面和胃肠道作为一个共同的有机体。白色念珠菌在有免疫缺陷、接受过手术或接受过长期抗生素治疗的人身上会产生严重的全身性疾病。在人类2、3、4、5、6、7的医院传染病 (nid) 中,念珠菌物种名列前三到四个。每年全球念珠菌血液感染的数量估计约为 400, 000 例, 相关死亡率为 46-751。仅在美国, 因念珠菌病而导致的年死亡率就约为 10, 000 人。真菌引起的 NID 的范围也反映在天文数字的病人费用5中。在美国, 治疗侵袭性真菌感染的年度费用超过20亿美元, 给已经不堪重负的医疗系统增加了巨大的压力。目前, 由于毒性、耐药性日益普遍和药物相互作用, 现有的标准抗真菌疗法有限。因此, 迫切需要确定新的抗真菌药物靶点, 从而为高危患者提供更好的治疗选择。然而, 发现新的药物作用于真菌目标是复杂的, 因为真菌是真核生物。这极大地限制了特定于真菌的药物靶标的数量。
最近的研究表明, 线粒体是真菌毒力和抗真菌药物耐受性的关键因素, 因为线粒体对细胞呼吸、氧化代谢、信号转导和凋亡都很重要。 , 9,10,11。糖酵解代谢和非糖酵解代谢对哺乳动物宿主 12、13、14、15、16的生存至关重要。此外, 一些缺乏线粒体蛋白的白色念珠菌突变体, 如 goa1、Srr1、Gem1、sam37 等, 在丝状化方面也有缺陷, 这是白色念珠菌17的一个重要毒力因子,18,19,20,21,22. 此外, 在17、18、19、20、21的小鼠模型中, 这些突变体也因毒力而减弱 ,22。因此, 真菌线粒体是药物发现的一个有吸引力的靶点。然而,白色念珠菌线粒体功能的研究具有挑战性, 因为白色念珠菌是小阴性 23, 这意味着它不能生存没有线粒体基因组。
在这里, 我们描述了一个协议, 可以用来研究线粒体和糖酵解功能在c.白色, 而无需净化线粒体。该方法也可以进行优化, 以研究遗传操作或化学调节剂对白色念珠菌线粒体和糖酵解途径的影响。
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Protocol
注: 分析的详细逐步协议如下所述, 原理图协议如图 1所示。
1.白色念珠菌菌株和生长条件
- 在30°c的孵化器振动台中, 在液体酵母提取物-苯并酮-右旋 (ypd) 中培养白色念珠菌菌株。
注: 保持念珠菌菌株作为冷冻库存和生长在 ypd 琼脂 (1% 酵母提取物, 2% 肽, 2% 葡萄糖, 和2% 琼脂)。
2. 试剂的制备
- 准备检测介质, 如下所示:
- 对于线粒体功能检测, 溶解1.04 克罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 1640 粉末和2克葡萄糖 (2%)在90毫升无菌水中, 将介质加热至37°c。使用 5M NaOH 将 pH 值调整到 7.4, 并用无菌水将体积调节到100毫升。
- 对于糖酵解应力检测, 将 1.04 g RPMI 1640 粉末单独溶解在90毫升无菌水中, 将介质加热到 37°c, 并将 pH 值调整为7.4。用无菌水将体积增加到100毫升。RPMI 1640 粉末没有碳酸氢盐, 这对于监测 pH 值的变化至关重要, 因为在测定过程中, 它是糖酵解的一种测量指标。
- 注射化合物。
- 在无菌水中准备 1 M 葡萄糖, 并储存在-20°c。
- 准备 100 mM 的低霉素库存, 以二甲基亚硫醚 (DMSO), 小容量的脂肪, 并存储在-20°c。
- 在 DMSO 中准备 100 mM 抗霉素 A 库存, 小批量的脂肪, 并储存在-20°c。
- 在测定当天用乙醇制备 100 mM sam (水杨酸)。
- 在检测当天在无菌水中制备 1m KCN。
3. 用多 d-赖氨酸 (PDL) 涂装检测板
注: 在层流罩中执行以下所有步骤。
- 将聚 d 赖氨酸溶解在组织培养等级的水中, 使其最终浓缩50μgml。将其很好地混合到 1.5 mL 的微离心管中, 并长期存放在-20°c。
注: 每口井需要 50μl, 24 口井需要 1.2 mL 升。因此, 每管至少1.3 毫升。 - 每口井加入 50μl, 在室温下孵育, 盖上盖子1-2小时。
- 吸入溶液, 用500μl 无菌组织培养等级的水冲洗一次。
- 打开盖子, 让水井风干。在同一天使用该板材或在4°c 下存放, 最长为2-3天。
4. 传感器墨盒的水合作用
注: 在实验前一天执行此步骤。
- 打开额外的通量检测套件并删除内容物。将传感器墨盒倒置到公用板旁边 (图 2)。
- 用1毫升的校准器填充公用板的每口井, 然后将传感器墨盒放回原处。确保含有荧光的传感器 (用于测量氧气和 pH 值) 被淹没在校准器中。
- 在37°c 的非 co2 孵化器中孵育传感器墨盒一夜。
5. 在 pdl 涂层板中生长和播种细胞
- 在 YPD 肉汤中接种白色念珠菌,在30分钟的振动台中长出, 每分钟200转。
注: 根据分析设计和兴趣,白色念珠菌也可以在 ypg 或最小介质中生长。 - 在检测当天, 稀释检测介质中适当数量的细胞, 以产生每 100μl 100, 000 细胞的最终浓度。
- 在检测板的每一口井中加入100Μl 的稀释细胞, 但井 A1、B4、C3 和 D6 除外, 在这些井中, 只添加100Μl 的检测介质进行背景校正 (图 3)。
- 将板材转移到37°c 的非二氧化碳孵化器, 孵育 60分钟, 使细胞粘附在板表面。
6. 检测协议
注: 此处概述的协议适用于24孔格式的仪器。如果使用另一种格式, 则需要调整卷。
- 线粒体功能检测
- 化合物的制备
- 为线粒体功能检测准备10倍浓度的化合物: 在相应的检测介质中制备 20 mM sham、100Μm Oligomycin、100μm KCN 和20μm 安蒂霉素 A。
- 在端口 A 中加入 50μl SHAM, 将 55Μl Oligomycin 添加到端口 B, 将 62Μl KCN 添加到端口 c 中, 将68Μl 反痛 A 添加到端口 D (图 4)。
- 化合物的制备
- 糖酵解应力分析
- 化合物的制备
- 以10倍浓度的浓度制备化合物用于糖酵解应力测定。在相应的检测介质中制备 100 mM 葡萄糖、100μm 低霉素、500 mM 2-脱氧葡萄糖 (2DG) 和20μm 安提霉素 A。
- 将50Μl 葡萄糖添加到端口 A, 55μl Oligomycin 入端口 b, 62μl 2-DG 加入端口 c, 68Μl 反痛 A 添加到端口 D。
- 化合物的制备
- 采用额外的流量分析仪, 以24孔板的形式测量活细胞的耗氧率 (OCR) 和细胞外酸化率 (ECAR)。提前建立检测方案。
- 打开额外的流量分析仪, 并使用分析向导选项卡设置分析模板, 并按照一步一步的指令填写设置过程中弹出的所有信息。生成类似于图 5所示的组布局。设置协议, 如表 1所示。在检测之前, 请提前设置这些布局, 并将其保存在计算机中。在检测时, 通过在检测向导选项卡中的打开文件选项中打开相应的文件来恢复保存的协议 (图 5)。
- 将10倍化合物装入包含校准器的水合传感器墨盒的相应端口, 并将其加载到额外流量分析仪的托架托架中。按屏幕上的"开始" 按钮开始校准。
- 在井边的电池板上轻轻加入350μl 的检测介质, 以最大限度地减少细胞干扰, 使最终体积达到450μl。
- 将装有校准器的实用板更换为检测板, 然后继续。
- 检测完成后, 取出传感器墨盒和板。将文件保存在相应的目标文件夹中。
7. 数据分析
- 使用软件中的曲线方差分析 (AUC-ANOVA) 分析选项卡下的区域, 通过选择相应的参数 (OCR 或 ECAR) 来计算组之间的显著差异, 如图 6所示。
- 选择需要比较的组。
- 添加到方差分析的分析组, 然后单击 "确定"。
注: 此 AUC 方差分析将向计算每个组的 AUC 的文件中添加一个新工作表, 并由 ANOVA 对它们进行比较。这将给出一个 p 值表, 以显示其重要性。
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Representative Results
本协议的重点是确定由额外通量分析仪评估的白色念珠菌的生物能量功能。缺乏线粒体蛋白 Mam33 的白色念珠菌突变体也随补体株一起被包括在内 , mam33 : mam33研究线粒体蛋白的缺失对 OCR 和 ecar 的影响。Sam33编码了假定的线粒体酸性基质蛋白及其在念珠菌中的功能尚不清楚。
用于额外通量检测的细胞数
我们在额外通量试验中使用了 1x10 5 c 白色念珠菌野生类型细胞, 结果显示 ocr 为 145 Pmom/min (图 7), 在任何细胞外通量检测的最佳范围内。在检测之前或在不同检测之间生长介质组成发生变化时, 滴定细胞数量以获得最佳 OCR 也很重要。
数据分析
软件中的曲线方差分析 (AUC-ANOVA) 分析选项卡下的区域通过选择相应的参数 (OCR 或 ECAR) 来计算组之间的显著差异, 如图 7所示。此分析为每个组计算 auc 的文件中添加了一个新的工作表, 并由 ANOVA 自动对它们进行比较, 该文件提供了一个 p 值表。
线粒体功能检测
在线粒体应力测试中, 该方法首先测量基础氧消耗率 (OCR), 然后注射替代氧化酶 (AOX)、ATP 合成酶和电子转运链配合物 iv 和 III 的抑制剂。除了经典的呼吸链,白色念珠菌还利用 aox 途径发电 24.因此, 我们研究了 AOX 系统通过水杨羟基苯甲酸 (SHAM)25抑制 ocr 活性的影响。线粒体功能, 测量为氧消耗率 (OCR) 在基部和注射各自的抑制剂后的耗氧率 (OCR) 如图 7所示。野生型、哺乳动物 333名/和哺乳动物33的基底 OCR : mam33 菌株无差异 (图 7a 和 b)。同样, 这些菌株之间的基础 ECAR 没有明显差异 (图 7c 和 d)。然而, 通过抑制复杂 IV 由 KCN, 野生类型和mam333名:: MAM33显示了一个实质性的转变向糖酵解, 而mam333/(这明显未能显示出补偿性的糖酵解转变) (图 7) 。e), 表明 c-iv 依赖性糖酵解途径与野生类型和哺乳动物相比, 在哺乳动物中受损。
糖酵解应力分析
在糖酵解应力测试中, 细胞对葡萄糖的缺乏时间为 1小时, 并测量了基础 OCR 和 ECAR。饥饿时 ,与野生类型和 mam33 相比 , mam33 (图 8a 和b ) 和 Ecar (图 8c 和 d) 明显低于 OCR ( 图 8 c 和 d ) : mam33菌株表明葡萄糖的利用率受损当细胞被迫处于饥饿状态时, 用于呼吸和糖酵解。注射葡萄糖后, 所有菌株均表现为 OCR 和 ECAR 的刺激。虽然寡霉素对 OCR 和 ECAR 的影响较小, 但作为糖酵解竞争抑制剂的2-DG 抑制 ocr 和 ECAR。具体而言, 2-DG 部分抑制 ocr, 这是进一步抑制安蒂霉素 A。相反, 2-DG 几乎完全抑制 ECAR。
表1。用于检测的协议命令
图 1.实验的原理图表示请点击这里查看此图的较大版本.
图 2.在添加校准器之前, 传感器墨盒 (绿色) 倒置在实用板附近.荧光体由箭头表示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3.显示背景井 A1、B4、C3 和 D6 的细胞培养板.蓝色标记显示凹槽, 面向左下角。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4.显示端口 A、B、C 和 D 的传感器墨盒的顶部.箭头标记显示凹槽, 面向左下角。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5.在软件中可视化的井的布局和组分配.wt-野生型;MT-MAM33 COMP-MAM33: MAM33补体.箭头标记显示打开的文件选项卡. 请点击这里查看此图的更大版本.
图 6.曲线 (AUC) 方差分析选项卡下的区域计算组之间的重要性.选择需要比较的组, 并将其添加到方差分析组, 然后单击 "确定"。此 AUC 方差分析将向为每个组计算 auc 的文件中添加一个新的工作表, 并由 ANOVA 对它们进行比较。这将给出一个 p 值表, 以显示其重要性。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7。线粒体功能检测白色念珠菌.在野生类型、哺乳动物、哺乳动物和哺乳动物33型白色念珠菌中测定了氧消耗和细胞外酸化率. A) 基础呼吸氧消耗率 (Ocr) 的实时图, 然后依次注射 SAM (2 mM)、低霉素 (10μm)、KCN (10mm) 和安提米霉素 A (2μm)。B) 野生类型、哺乳动物 33 /和哺乳动物 333名/的曲线 (auc) 基部 ocr下面积的比较没有显著差异. C) 在基底糖酵解时细胞外酸化率 (ECAR) 的实时图, 然后依次注射 SAM (2 mM)、少霉素 (10Μm)、KCN (10mm) 和抗霉素 A (2μm)。D ) 野生类型、哺乳动物 33 / 和哺乳动物33 的曲线基部 Ecar 下面积的比较没有显著性差异 . E) 野生类型、 mam333名和 mam33 的曲线 (AUC) ecar 下面积的比较: am33株的白色念珠菌在注射 C-iv 抑制剂 kcn 后显示, Mam33/的糖酵解转变显著下降. 突变体与野生类型和互补菌株的值表示为平均±标准误差均值。* p<0.05, * * p<0.001 被单向方差分析认为具有重要意义。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8.白色念珠菌的糖酵解应激分析。在野生型、哺乳动物饥饿葡萄糖后, 在其缺乏葡萄糖后, 对其耗氧量和细胞外酸化进行了测定, 然后急性注射饱和葡萄糖浓度。A) 细胞接受基础 ECAR 后耗氧率的实时图, 然后依次注射葡萄糖 (10 mM)、寡霉素 (1Μm)、2-DG (40 mM) 和安提皮霉素 A (2μm)。B) 条形图, 显示野生类型、哺乳动物和哺乳动物之间基底糖酵解曲线 ecar 下的面积: mam33株白色念珠菌。C) 细胞接受基础 ECAR 后糖酵解功能的实时图, 然后依次注射葡萄糖 (10 mM)、少霉素 (1Μm)、2-DG (40mM) 和抗霉素 A (2μm)。D) 条形图, 显示野生类型、哺乳动物和哺乳动物之间的基底糖酵解曲线 ecar 下的面积: mam33株的白色念珠菌值表示为平均±标准误差均值。* p<0.05、* * * p<0.0005、* * * p<0.0001 被单向方差分析认为具有重要意义。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
生物能学的额外助焊剂分析是通过实时测量氧化磷酸化 (OXPHOS) 依赖氧消耗来读出线粒体功能的一个很好的工具。此外, 还可以同时在实时分析中研究以细胞外酸化率 (细胞外 pH 值的变化) 来测量的糖酵解功能。
在检测板中成功电镀白色念珠菌是检测过程中的关键步骤之一, 因为 PDL 涂层板中细胞的培养使细胞能够粘附在检测板上。粘附白色念珠菌细胞的可视化是通过光学显微镜完成的。不正确的细胞粘附可能会导致细胞漂浮在井中, 这将影响检测结果与重复之间的读数不一致。同样, 作为本试验的第一步, 必须进行细胞数量滴定, 以获得 10-300 pmol/min 之间的 OCR, 这是一个最佳范围。此外, 对化合物进行滴定以获得最佳浓度对于获得最佳响应也是至关重要的。每当基部培养基组成发生变化时, 都可以执行此操作。
DMEM 是哺乳动物细胞外通量检测中最常用的基部介质。然而, 在我们的手中, RPMI 1640 培养基给出了最佳的结果与白色念珠菌。这主要是由于线粒体电子传输链复合抑制剂的有效性, 它在 RPMI 1640 介质中的作用优于 DMEM。
本试验采用野生型、野生型、哺乳动物、哺乳动物 333个菌株的白色念珠菌来评估线粒体呼吸和糖酵解效率。结果表明, Mam33基因的缺失降低了白色念珠菌在抑制 c-iv 等应激条件下转移到糖酵解的能力 (图 7E和 7e)。同样, 当细胞受到葡萄糖饥饿等压力条件时, 线粒体呼吸和糖酵解效率在哺乳动物中都会受到显著影响, 但在野生类型和补体中不会受到明显影响 (图 8)。因此, 根据实验情况, RPMI 1640 中的碳源也可以修改为甘油或半乳糖, 这迫使细胞使用 OXPHOS 而不是糖酵解。
使用额外通量分析的意义在于, 通过使用干扰线粒体功能的各种底物和化合物, 可以推断细胞利用 OXPHOS 与糖酵解的能力。这可以作为一个信息工具, 以了解任何治疗或基因对线粒体功能和糖酵解的影响, 而不分离线粒体。该检测测量基础耗氧率 (OCR), 这是一种测量线粒体呼吸的指标, 细胞外酸化率 (ECAR), 这是衡量糖酵解功能在葡萄糖存在和葡萄糖饥饿后的一个指标。额外的通量细胞检测在各种哺乳动物模型26中得到了很好的应用。尽管白色念珠菌在医学上具有重要的作用, 但由于缺乏实时研究线粒体功能和糖酵解的标准化实验程序, 真菌线粒体的研究受到了一定程度的阻碍。
该方法为研究白色念珠菌线粒体呼吸和糖酵解效率提供了一种简便的方法。在未来, 该方法也可用于研究药物疗效测试使用常用的抗真菌药物, 如氟康唑。此外, 这种方法未来的另一个潜在应用是药物发现, 特别是用于筛选针对白色念珠菌线粒体功能的化合物。
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Disclosures
作者们没有什么可以透露的
Acknowledgments
NC 实验室的研究得到了国家卫生研究院 R01AI24499 赠款和新泽西卫生基金会赠款的支持, #PC40-18日。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
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