Summary
Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para investigar la respiración mitocondrial y la función glucolisis en Candida Albicans utilizando un analizador de flujo adicional.
Abstract
Las mitocondrias son organelos esenciales para el metabolismo celular y la supervivencia. Una variedad de eventos clave llevará a cabo en la mitocondria, como la respiración celular, metabolismo oxidativo, transduction de la señal y la apoptosis. En consecuencia, la disfunción mitocondrial se divulga a jugar un papel importante en la tolerancia de antimicóticos y la virulencia de hongos patógenos. Datos recientes también han contribuido al reconocimiento de la importancia de la mitocondria como un contribuyente importante para la patogénesis fúngica. A pesar de la importancia de la mitocondria en biología fúngica, métodos estandarizados para entender su función están poco desarrollados. Aquí, presentamos un procedimiento para estudiar la tasa de consumo de oxígeno basal (OCR), una medida de la respiración mitocondrial y las tasas de acidificación extracelular (ECAR), una medida de la función glucolisis en cepas de C. albicans . El método descrito en este documento puede aplicarse a cualquier Candidaspp. cepas sin la necesidad de purificar las mitocondrias de las células fúngicas intactas. Además, este protocolo puede también ser modificado para requisitos particulares para detectar inhibidores de la función mitocondrial en cepas de C. albicans .
Introduction
Las infecciones fúngicas invasivas mata a más 1,5 millones de personas al año en todo el mundo. Este número va en aumento debido a un aumento en el número de personas con inmunidad comprometida, incluyendo los bebés prematuros, ancianos, trasplantados y cáncer pacientes1. C. albicans es un hongo patógeno humano oportunista que es una parte de la microflora humana. También habita las superficies mucosas y el tracto gastrointestinal como un organismo comensal. C. albicans produce enfermedad sistémica seria en personas con inmunodeficiencias, que han sometido a cirugía o que han sido tratados con cursos largos de antibióticos. El rango de especies de Candida entre las causas de la tapa tres de las enfermedades infecciosas nosocomiales (NID) en los seres humanos2,3,4,5,6,7. Se estima el número global de infecciones de la sangre de Candida ~ 400.000 casos, con mortalidad asociada de 46-75%1. La mortalidad anual a causa de la candidiasis es de aproximadamente 10.000 en los Estados Unidos. El grado de NID causada por hongos también se refleja en gastos astronómicos de paciente5. En los Estados Unidos, el gasto anual para el tratamiento de las infecciones fúngicas invasivas supera los $ 2 billones, añadiendo una gran tensión al sistema de salud ya sobrecargado. En la actualidad, terapias antihongos estándar disponibles son limitadas debido a toxicidad, resistencia a los medicamentos cada vez más frecuentes y las interacciones de fármacos. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de identificar nuevas dianas de antimicóticos que se traducirá en mejores opciones de tratamiento para pacientes de alto riesgo. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos fármacos que actúan sobre dianas fúngicas es complicado porque los hongos son eucariotas. Grandemente, esto limita el número de dianas farmacológicas de fungicidas específicos.
Estudios recientes han indicado que las mitocondrias son un contribuyente fundamental a la virulencia de hongos y la tolerancia a drogas antihongos ya que las mitocondrias son importantes para la respiración celular, metabolismo oxidativo, transduction de la señal y la apoptosis8 ,9,10,11. Metabolismo glicolítico y no glucolisis son esenciales para la supervivencia de C. albicans en el huésped mamífero12,13,14,15,16. Además, varios mutantes de C. albicans que carece de proteínas mitocondriales, como la Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. han demostrado ser defectuoso en la filamentación, un factor importante de virulencia de C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Además, estos mutantes también fueron demostrados para ser atenuada para difusión de virulencia en un modelo murino de candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Así, las mitocondrias hongos representan un atractivo destino para el descubrimiento de medicamentos. Sin embargo, el estudio de la función mitocondrial en C. albicans es difícil debido a que C. albicans es petite negativa23, que significa que no puede sobrevivir sin el genoma mitocondrial.
Aquí, describimos un protocolo que puede utilizarse para investigar la función mitocondrial y glucolisis en C. albicans sin necesidad de purificar las mitocondrias. Este método también se puede optimizar para investigar el efecto de la manipulación genética o moduladores químicos en las vías mitocondriales y glucolisis en C. albicans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: El protocolo paso a paso detallado del análisis se describe a continuación, y el protocolo esquemático se muestra en la figura 1.
1. las cepas de C. albicans y condiciones de crecimiento
- Crecen las cepas de C. albicans en medio líquido de la dextrosa-peptona-Extracto de levadura (YPD) a 30 °C en un agitador incubador durante la noche.
Nota: Mantener cepas de Candida como acción congelada y crecen en agar YPD (Extracto de levadura 1%, 2% peptona, 2% dextrosa y agar al 2%).
2. preparación de reactivos
- Preparar el medio de ensayo como sigue:
- Para análisis de la función mitocondrial, disolver el polvo de 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1,04 g y 2 g de glucosa (2%) en 90 mL de agua estéril y caliente los medios a 37 ° C. Ajustar el pH a 7.4 con 5 M NaOH y enrasar a 100 mL con agua estéril.
- Para análisis de estrés de glucolisis, disolver 1,04 g 1640 RPMI polvo en 90 mL de agua estéril, caliente los medios a 37 ° C y ajustar el pH a 7.4. Enrasar a 100 mL con agua estéril. RPMI 1640 polvo no tiene bicarbonato, que es fundamental para monitorear el cambio de pH como una medida de la glucólisis durante el ensayo.
- Compuestos de la inyección.
- Preparar caldo de glucosa de 1 M en agua estéril y almacenar a-20 ° C.
- Preparar 100 mM oligomycin stock en dimetil sulfóxido (DMSO), alícuota en volúmenes pequeños y almacenar a-20 ° C.
- Preparar acciones 100 mM antimicina en DMSO, alícuota en volúmenes pequeños y almacenar a-20 ° C.
- Preparar 100 mM stock SHAM (ácido salicylhydroxamic) en el etanol en el día del ensayo.
- Preparar 1 M KCN en agua estéril en el día del ensayo.
3. capa de la placa de ensayo con Poly-D-lisina (PDL)
Nota: Realice todos los pasos en una campana laminar.
- D poli lisina en agua de calidad de cultivo de tejidos para hacer la concentración final de 50 μg/mL se disuelven. Mezclarlo bien y alícuota en un tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a-20 ° C a largo plazo.
Nota: se necesita 50 μL por pocillo, y 24 pozos, 1,2 mL se requiere. Por lo tanto, alícuota mínimo 1.3 mL por tubo de microcentrífuga. - Añadir 50 μL por pocillo e incubar a temperatura ambiente con la tapa cubierta para 1-2 h.
- Aspirar la solución y enjuague una vez con agua de calidad de cultivo estériles para tejidos de 500 μl.
- Abra la tapa y deje que se sequen los pozos de aire. Utilizar la placa en el mismo día o a 4 ° C por un máximo de 2-3 días.
4. hidratación de cartucho de sensor
Nota: Realice este paso un día antes del experimento.
- Abrir el flujo adicional Kit de ensayo y retire el contenido. Coloque el cartucho de sensor boca abajo al lado de la placa de utilidad (figura 2).
- Llene cada uno bien de la placa de utilidad con 1 mL de calibrant y coloque el cartucho de sensor nuevo. Asegúrese de que los sensores que contengan fluoróforos (para medir el oxígeno y el pH) se introducen en el calibrant.
- Incubar el cartucho sensor durante la noche en una incubadora sin CO2 a 37 ° C.
5. cultivo y siembra de células en las placas recubiertas de PDL
- Inocular de C. albicans en el caldo YPD y crecer durante la noche a 30 ° C en un agitador a 200 rpm.
Nota: Basado en el diseño del ensayo y el interés, C. albicans puede también cultivarse en YPG o medio mínimo. - En el día del ensayo, diluir un número apropiado de células en el medio de ensayo para obtener una concentración final de 100.000 células por μl 100.
- Añada 100 μl de las células diluidas en cada pocillo de la placa de ensayo excepto pozos A1, B4, C3 y D6, en el que añadir 100 μl del medio de ensayo para la corrección de fondo (figura 3).
- Transferir la placa a una incubadora sin CO2 a 37 ° C e incubar durante 60 minutos, lo que permitirá que las células se adhieren a la superficie de la placa.
6. Protocolo
Nota: El protocolo descrito aquí es para el formato de 24 pocillos del instrumento. Volúmenes tendrá que ajustarse si se utiliza otro formato.
- Análisis de la función mitocondrial
- Preparación de compuestos
- Preparar compuestos en concentración de 10 x para análisis de la función mitocondrial: preparar 20 mM farsa, 100 μm Oligomycin, KCN, de 100 mM y μm Antimycin A 20 en el medio de ensayo correspondiente.
- Añadir 50 μl de simulacro en el puerto A, 55 μl Oligomycin en Puerto B, 62 μl de KCN al puerto C y μl Antimycin A 68 en Puerto D (figura 4).
- Preparación de compuestos
- Ensayo de tensión glucolisis
- Preparación de compuestos
- Preparar compuestos en concentración de 10 x para el ensayo de tensión glucolisis. Preparar 100 mM glucosa, 100 μm Oligomycin, 500 mM 2-deoxi glucosa (2DG) y 20 μm Antimycin A en el medio de ensayo correspondiente.
- Añadir glucosa μl 50 en Puerto A, 55 μl Oligomycin en Puerto B, 62 μl 2-DG en el puerto C y μl Antimycin A 68 en Puerto D.
- Preparación de compuestos
- Utilizar el analizador de flujo extra, el cual mide la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de células vivas en un formato de placa de 24 pozos. Configurar el protocolo de ensayo de antemano.
- Abra el analizador de flujo adicional y configurar la plantilla de ensayo mediante la ficha de asistente de análisis y seguir las instrucciones paso a paso para completar toda la información que sale durante la instalación. Generar el diseño de grupo como similar al mostrado en la figura 5. Configure el protocolo como se muestra en la tabla 1. Configurar estas plantillas bien adelante antes del ensayo y guardar en el ordenador. En el momento de análisis, restablecer el protocolo guardado abriendo el archivo correspondiente en la opción Abrir archivo en la pestaña Asistente de ensayo (figura 5).
- Carga de los compuestos de 10 x en los puertos respectivos del cartucho sensor hidratado que contiene el calibrant y cargue en la bandeja portadora del analizador de flujo extra. Comenzar la calibración pulsando el botón Start en la pantalla.
- Añadir 350 μl del medio de ensayo suavemente a la placa celular en el lado de los pozos para minimizar la alteración de la célula para llevar el volumen final a 450 μl.
- Vuelva a colocar la placa de utilidad que contienen calibrant con la placa de ensayo y continuar.
- Quite el cartucho de sensor y la placa una vez terminado el ensayo. Guarde el archivo en la carpeta de destino apropiado.
7. Análisis de datos
- Utilice el área bajo la curva - análisis de varianza (ANOVA-AUC) análisis ficha en el software para calcular la diferencia significativa entre los grupos, seleccionando los parámetros respectivos (OCR o ECAR) como se muestra en la figura 6.
- Seleccione los grupos que deban compararse.
- Agregar a los grupos de análisis de ANOVA y haga clic en Aceptar.
Nota: Este análisis ANOVA AUC agregará una nueva hoja para el archivo en el que las AUC es calculada para cada grupo y compara entre ellos por ANOVA. Esto le dará una tabla de valores de p para mostrar la importancia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El objetivo de este protocolo es determinar las funciones bioenergéticas de C. albicans por analizador de flujo adicional. Un mutante de C. albicans que carece de proteína mitocondrial Mam33 también está incluido junto con su variedad de complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 para el estudio de los efectos de la eliminación de una proteína mitocondrial en OCR y ECAR. MAM33 codifica para una proteína supuesta matriz mitocondrial de ácidos y su función en la Candida no se conoce.
Número de células para el ensayo de flujo extra
Empleamos 1 x 105 células de tipo salvaje de C. albicans por pozo en el ensayo de flujo adicional, que mostró un OCR de 145 pmol/min (figura 7), que está dentro del rango óptimo de 100-300 pmol/min para cualquier ensayo de flujo extracelular. También es importante valorar el número de celular para obtener una óptima OCR antes el ensayo o cuando hay un cambio en la composición de medio de crecimiento entre los diferentes ensayos.
Análisis de datos
El área bajo la curva - análisis de varianza (ANOVA-AUC) análisis ficha en el software se utilizó para calcular la diferencia significativa entre los grupos, seleccionando los parámetros respectivos (OCR o ECAR) como se muestra en la figura 7. Este análisis ha añadido una nueva hoja al archivo en que las AUC se calcula para cada grupo y se comparó entre ellos por ANOVA automáticamente, el cual dio una tabla de valores de p.
Análisis de la función mitocondrial
En la prueba de estrés mitocondrial, el ensayo comienza con la medición de la tasa de consumo de oxígeno basal (OCR) seguido por la inyección de inhibidores de una oxidasa alternativa (AOX), synthase del ATP y complejos de la cadena de transporte de electrones, IV y III. Además de la clásica cadena respiratoria, C. albicans también utiliza la vía AOX para energía generación24. Por lo tanto, hemos investigado el efecto del sistema AOX en OCR inhibiendo su actividad mediante el uso de salicylhydroxamic ácido (SHAM)25. La función mitocondrial, que se mide como una tasa de consumo de oxígeno (OCR) en pmol/min en basal y después de la inyección de inhibidores respectivos se muestra en la figura 7. El OCR basal de cepas silvestres de tipo, mam33Δ/Δ y mam33Δ/Δ::MAM33 no mostraron diferencias (figura 7A y B). Asimismo, no se observó ninguna diferencia significativa en la ECAR basal entre estas cepas (figura 7C y D). Sin embargo, inhibiendo el complejo IV por KCN, tipo salvaje y mam33Δ/Δ::MAM33 mostraron un cambio sustancial hacia la glucólisis en contraste con mam33Δ/Δ, que significativamente no pudo demostrar un cambio compensatorio de glucolisis (figura 7 E), lo que sugiere que el camino glicolítico dependiente C-IV está deteriorada en el mutante de mam33Δ/Δ en comparación con el tipo salvaje y las cepas de mam33Δ/Δ::MAM33 .
Ensayo de tensión glucolisis
En la glucolisis prueba de estrés, las células estaban hambrientos de glucosa por 1 h y se midió el OCR y ECAR. Sobre hambre, mam33Δ/Δ demostró menor ECAR (figura 8C y D) en comparación con el tipo salvaje y las cepas de mam33Δ/Δ::MAM33 lo que sugiere una utilización deteriorada de la glucosa y OCR (figura 8A y B) para la respiración y la glucólisis cuando las células están obligadas a la condición de hambre. Después de la inyección de glucosa, todas las cepas mostraron estimulación de OCR y ECAR. Aunque oligomycin tiene menos efecto sobre OCR y ECAR, 2-DG, que es un inhibidor competitivo de la glicolisis, inhibe la ECAR y OCR. Específicamente, 2-DG inhibe parcialmente la OCR, que es más inhibida por Antimycin A. En contraste, 2-DG inhibe casi completamente ECAR.
Tabla 1. Comandos del protocolo para el análisis de
Figura 1 . Representación esquemática del experimento haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Cartucho de sensor (verde) colocada boca abajo cerca de la placa de la utilidad antes de agregar el calibrant. Fluoróforos están indicados por flechas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Placa de cultivo con pocillos de fondo A1, B4, C3 y D6 de la célula. La marca azul muestra la muesca, orientada a la parte inferior izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . La parte superior del cartucho de sensor que muestra los puertos A, B, C y D. Marca de la flecha muestra la muesca, orientada a la parte inferior izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . El diseño de pozos y la asignación de grupo, visualizada en el software. WT - tipo salvaje; MT - mutante mam33Δ/Δ ; COMP-mam33Δ/Δ::MAM33 complementar la cepa. Marca de flecha muestra la ficha de abrir el archivo haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . El área bajo la curva (AUC) ANOVA análisis ficha calcular la significación entre los grupos. Seleccione los grupos que deben compararse y agregar a los grupos de análisis de ANOVA y haga clic en Aceptar. Este análisis de ANOVA AUC agregará una nueva hoja para el archivo en el que las AUC es calculada para cada grupo y compara entre ellos por ANOVA. Esto le dará una tabla de valores de p para mostrar la importancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Análisis de la función mitocondrial en C. albicans. Acidificación extracelular tarifas y consumo de oxígeno fueron medidos en salvaje tipo, mam33 Δ/Δ y Δ/Δ::MAM33 mam33 cepas de C. albicans. A) un gráfico en tiempo real de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en respiración basal seguido de inyección secuencial de SHAM (2 mM), Oligomycin (10 μm), KCN (10 mM) y la antimicina (2 μm). B) comparación del área bajo la curva (AUC) OCR basal entre cepas silvestres de tipo, mam33Δ/Δ y mam33Δ/Δ::MAM33 de C. albicans no muestran diferencias significativas. Gráfico en tiempo real C) una tasa de acidificación extracelular (ECAR) en glucólisis basal seguido de inyección secuencial de SHAM (2 mM), Oligomycin (10 μm), KCN (10 mM) y la antimicina (2 μm). D) comparación del área bajo la curva (AUC) ECAR basal entre cepas silvestres de tipo, mam33Δ/Δ y mam33Δ/Δ::MAM33 de C. albicans no muestran diferencias significativas. E) comparación del área bajo curva (AUC) ECAR entre cepas silvestres de tipo, mam33Δ/Δ y mam33 Δ/Δ::MAM33 de C. albicans después de la inyección de inhibidor de C-IV KCN muestran disminución significativa en la glucolisis cambio en mam33Δ/Δ mutante en comparación con el tipo salvaje y las tensiones complementarias los valores se expresan como promedio ± error estándar medio. * p < 0.05, ** p < 0.001 es considerado como significativo por ANOVA unidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 . Ensayo de tensión glucolisis en C. albicans. Consumo de oxígeno y la acidificación extracelular se midieron en el tipo silvestre, el mutante de mam33Δ/Δ después de que estaban hambrientos de glucosa seguida de inyección aguda de la concentración de glucosa saturado. A) un gráfico en tiempo real de la tasa de consumo de oxígeno después de que las células fueron sometidas a ECAR basal seguido de inyección secuencial de glucosa (10 mM), Oligomycin (1 μm), 2-DG (40 mM) y la antimicina (2 μm). B) gráfico de barras que muestra el área bajo la curva de ECAR de glucólisis basal entre cepas silvestres de tipo, mam33Δ/Δ y mam33Δ/Δ::MAM33 de C. albicans. Gráfico en tiempo real A C) de la función glucolisis después las células fueron sometidas a ECAR basal seguido de inyección secuencial de glucosa (10 mM), Oligomycin (1 μm), 2-DG (40 mM) y la antimicina (2 μm). D) gráfico de barras que muestra el área bajo la curva de ECAR de glucólisis basal entre el tipo salvaje, mam33Δ/Δ y mam33Δ/Δ::MAM33 cepas de C. albicans los valores se expresan como promedio ± error estándar medio. * p < 0.05, *** p < 0,0005, *** p < 0.0001 es considerado como significativo por ANOVA unidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La bioenergética análisis de flujo extra sirven como una excelente herramienta para leer la función mitocondrial mediante la medición de fosforilación oxidativa (OXPHOS)-consumo de oxígeno dependiente en tiempo real. Además, una función de glucolisis que es medida como una tasa de acidificación extracelular (cambio en el pH extracelular) también se puede investigar al mismo tiempo en el análisis en tiempo real.
Exitosa siembra de C. albicans en la placa de ensayo es uno de los pasos críticos en el análisis debido a que la incubación de las células en las placas PDL recubierto permiten las células a adherirse a la placa de ensayo. Visualización de células adherentes de C. albicans se logra por microscopia ligera. Adhesión celular inadecuada puede llevar a las células flotando en los pozos, que afectarán el resultado del ensayo con lecturas inconsistentes entre repeticiones. Asimismo, es importante realizar la valoración del número de células como el primer paso en este análisis para obtener un OCR entre 100-300 pmol/min, que es un rango óptimo. También, valorar los compuestos para obtener la concentración óptima es fundamental para lograr la respuesta óptima. Esto se puede realizar siempre que haya un cambio en la composición de medio basal.
DMEM es el medio basal más utilizado en el ensayo de flujo adicional para células de mamífero. Sin embargo, en nuestras manos, el Medio RPMI 1640 dio resultados óptimos con C. albicans. Esto era principalmente debido a la eficacia de los inhibidores de complejo la cadena transporte de electrones mitocondrial que funcionaba mejor en Medio RPMI 1640 comparado con DMEM.
En este ensayo, de tipo silvestre, mam33Δ/Δ y mam33Δ/Δ::MAM33 cepas de C. albicans fueron utilizadas para determinar la respiración mitocondrial y la glucolisis eficiencia. Los resultados muestran claramente que la canceladura del gene MAM33 reduce la habilidad de C. albicans a glicólisis bajo condiciones de estrés tales como la inhibición de C-IV (figura 7C y 7E). Del mismo modo, cuando las células fueron sometidas a estrés condición como hambre de glucosa, la respiración mitocondrial y eficiencia glucolisis es significativamente comprometido en el mutante de mam33Δ/Δ pero no en el tipo salvaje y complemento cepas ( Figura 8). Por lo tanto, dependiendo de los experimentos, fuentes de carbono en el RPMI 1640 también pueden ser modificadas a glicerol o galactosa, que obliga a las células utilizar OXPHOS en lugar de glucólisis.
La importancia de utilizar el ensayo de flujo extra es que mediante el uso de varios sustratos y compuestos que perturban la función mitocondrial, se infiere la capacidad de las células para utilizar OXPHOS versus glucólisis. Esto puede utilizarse como una herramienta informativa para entender el efecto de cualquier tratamiento o gen en la función mitocondrial y la glucólisis en Candida albicans sin aislar las mitocondrias. El ensayo mide la tasa de consumo de oxígeno basal (OCR), que es una medida de la respiración mitocondrial, y la tasa de acidificación extracelular (ECAR), que es una medida de la glucolisis función en tanto la presencia de glucosa y después de hambre de glucosa. El ensayo de flujo extra celular se emplea bien en una variedad de modelos mamíferos26. A pesar de la importancia médica de C. albicans, investigación en mitocondrias fungicidas ha sido algo obstaculizada debido a la falta de procedimientos estandarizados experimentales para el estudio de la función mitocondrial y glicolisis en tiempo real.
Este método proporciona una manera fácil y conveniente de investigar la respiración mitocondrial y la glucolisis eficiencia mediante el uso de análisis en tiempo real flujo extracelular en C. albicans. En el futuro, este análisis también pueden aplicarse para estudiar la eficacia de la droga prueba usando antifúngicos comúnmente empleadas como fluconazol. Además, otra posible aplicación futura de este método está en el descubrimiento de medicamentos, especialmente para la detección de compuestos dirigidos a la función mitocondrial de C. albicans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Investigación en laboratorio de NC es apoyada por una subvención de los institutos nacionales de salud (NIH) R01AI24499 y una beca de la Fundación de salud de Nueva Jersey (NJHF), #PC40-18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
- Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
- Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
- Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
- Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
- Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
- Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
- Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
- Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
- Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
- Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
- Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
- Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
- Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
- Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
- Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
- Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
- Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555 (2017).
- Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
- Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
- Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
- Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
- de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).
