Summary
Mutationer i leucin rika upprepa kinas 2 genen (LRRK2) orsaka ärftliga Parkinsons sjukdom. Vi har utvecklat en enkel och robust metod för bedömning av LRRK2-kontrollerad fosforylering av Rab10 i humana perifera blodnetrofiler. Detta kan hjälpa till att identifiera individer med ökad LRRK2 kinas utbildningsavsnitt aktivitet.
Abstract
Leucin rika upprepa kinas 2 (LRRK2) är den vanligaste muterade genen i ärftliga Parkinsons sjukdom (PD) och alla patogena LRRK2 mutationer resultera i hyperaktivering av dess kinas funktion. Här beskriver vi en enkel och robust analys för att kvantifiera LRRK2 kinas utbildningsavsnitt verksamhet i humant perifert blod neutrofiler genom att mäta LRRK2-kontrollerade fosforylering av en av dess fysiologiska substrat, Rab10 vid treonin 73. Den immunoblotting analys som beskrivs kräver en helt selektiv och fosphospecific antikroppar som känner igen Rab10 Thr73 epitop fosforylerad av LRRK2, såsom MJFF-pRab10 kanin monoklonala antikroppar. Den använder humant perifert blod neutrofiler, eftersom perifert blod är lättillgängligt och neutrofiler är en riklig och homogen beståndsdel. Viktigt, neutrofiler uttrycka relativt höga nivåer av både LRRK2 och Rab10. En potentiell nackdel med neutrofiler är deras höga inneboende serinproteas aktivitet, som kräver användning av mycket potenta proteashämmare såsom organofosfor neurotoxin diisopropylfluorofosfat (DIFP) som en del av lysis bufferten. Icke desto mindre, neutrophils är en värdefull resurs för forskning om LRRK2 kinas utbildningsavsnitt verksamhet in vivo och bör övervägas för införande i PD biorepository samlingar.
Introduction
Försök att bromsa eller stoppa Parkinsons sjukdom (PD) har hittills misslyckats. Upptäckten av hyperaktiverande mutationer i leucin rika upprepa kinas 2 (LRRK2) som orsakar och / eller öka risken för PD har lett till utvecklingen av LRRK2 kinashämmare1,2,3. Dessa har nu gått in i kliniska prövningar4. Den exakta funktionen av LRRK2 är oklart, men ett stort framsteg har varit identifiering av en delmängd av Rab GTPase proteiner, inklusive Rab10, som den första äkta fysiologiska substrat av LRRK2 kinas5,6,7. Viktiga utmaningar i en tid präglad av sjukdomsmodifierande therapeutics är biokemiska markörer för LRRK2 kinasaktiveringsstatus och målengagemang av LRRK2-kinashämmare.
Hittills har den huvudsakliga farmakokinetiska markören för LRRK2-hämmare in vivo varit ett kluster av konstituerande fosforylerade serinrester av LRRK2, särskilt serin 935, som blir defosforylerade som svar på olika LRRK2-hämmare8,9. Serin 935 fosforylering korrelerar dock inte med inneboende cellulärA LRRK2 kinas aktivitet eftersom det inte är direkt fosforyleras av LRRK2 och är fortfarande fosforylerade i kinas-inaktiva LRRK210. LRRK2 kinas aktivitet korrelerar väl med autofosforylering av serin 1292, men det är i praktiken inte en lämplig avläsning för endogenA LRRK2 kinas aktivitet genom immunblot analys av hela cellextrakt på grund av den nuvarande bristen på tillförlitliga och fosphospecific antikroppar för denna webbplats10,11.
Vi har utvecklat en robust och enkel analys för att kvantifiera LRRK2 kinas utbildningsavsnitt aktivitet i mänskliga perifera blodkroppar som mäter LRRK2-kontrollerad fosforylering av dess fysiologiska målprotein Rab10 vid treonin 7311. Perifert blod är lätt att nå genom venesection, vilket är en låg risk och snabb procedur som orsakar minimalt obehag. Vi fokuserar på humant perifert blod neutrofiler eftersom de utgör en riklig (37-80% av alla vita blodkroppar) och homogena cellpopulationer som uttrycker relativt höga nivåer av både LRRK2 och Rab1011. Dessutom kan perifert blod neutrofiler isoleras snabbt och effektivt genom att använda en immunomagnetisk negativ strategi. För att säkerställa att den efterföljande observerade Rab10-fosforyleringen medieras av LRRK2 inkuberas varje parti neutrofiler med eller utan en potent och selektiv LRRK2-kinashämmare (vi använder och rekommenderar MLi-2)2,12. Detta följs sedan av celllys i en buffert som innehåller proteashämmaren diisopropylfluofosfat (DIFP), vilket är nödvändigt för att undertrycka den inneboende serinproteasaktiviteten som är känd för att vara hög i neutrofiler13. För den slutliga analysen av kvantitativ immunblottning rekommenderar vi att du använder MJFF-pRab10 kanin monoklonala antikroppar som specifikt detekterar Rab10 Thr73-fosfoepitope och inte korsreagerar med andra fosforylerade Rab-proteiner14. Selektivitet och specificitet av denna antikropp har validerats i överuttryck modeller av olika Rab proteiner och en A549 Rab10 knock-out cellinje14. Således mäter vi skillnaden i Rab10 fosforylering i neutrofil lysates som har behandlats med och utan en potent och selektiv LRRK2 kinashämmare2. Alternativt kan prover också analyseras med andra metoder, till exempel kvantitativ masspektrometri.
Sammanfattningsvis är LRRK2-kontrollerade Rab10 fosforylering en överlägsen markör för LRRK2 kinas verksamhet till LRRK2 fosforylering vid serin 935 och humant perifert blod neutrofiler är en värdefull resurs för PD forskning i LRRK2. Vårt protokoll ger en robust och enkel analys för att förhöra LRRK2 utbildningsvägsaktivitet i perifera blodnetrofiler och möjliggör biokemisk stratifiering av individer med ökad LRRK2 kinasaktivitet15. Viktigt, sådana individer kan dra nytta av framtida LRRK2 kinas hämmare behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Enligt lokala brittiska förordningen alla manipulationer och pipettering av humant blod sker i en kategori 2 biologiska säkerhetsskåp. Alla förfaranden har utförts i enlighet med lokala etikprövningsnämnden och alla deltagare har gett informerat samtycke.
1. Förberedelser
- Förbered 0,1 ml EDTA-lagerlösning 1 som innehåller 100 mM EDTA i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Förbered 60 ml EDTA-lagerlösning 2 innehållande 1 mM EDTA i PBS.
- Förbered lysbuffert som innehåller 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4,50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosfat, 5 mM natriumpyrofosfat, 0,27 M sackaros, 0,1% (v/v) β-mercaptoetanol, 1x proteashämmarecocktail, 1 μg/mL microcystin-LR och 0,5 mM diisopropylfluofosfat (DIFP).
OBS: Författarna använder rutinmässigt en EDTA-fri produkt, men en EDTA-innehållande proteashämmare cocktail bör också fungera. Lysbufferten kan tillverkas i förväg utan β-merkaptoetanol, proteashämmare, mikrocystin-LR och DIFP och lagras vid 4 °C fram till användning. Se till att β-merkaptoetanol, proteashämmare, mikrocystin-LR och DIFP tillsätts endast omedelbart före användning.
VARNING: DIFP är giftigt och bör hanteras med försiktighet i en rökhuv efter lokal hälso- och säkerhetsriskbedömning. DIFP kan läggas till lysbufferten och användas omedelbart. Alternativt kan den kompletta lysbufferten som innehåller alla andra komponenter, inklusive DIFP, alicieras och lagras vid -80 °C för efterföljande användning i minst 4 veckor.
2. Neutrofil isolering från helblod
- Samla 10 ml blod i ett blodinsamlingsrör. Blanda försiktigt med inverteringsrör 7−8x.
- Överför 10 ml blod till ett koniskt rör på 50 ml.
- Tillsätt 100 μl EDTA-lagerlösning 1 till blodet. Blanda försiktigt.
- Tillsätt 500 μl isoleringscocktail (50 μL/ml) från neutrofiloleringssatsen(Tabell över material)till hela blodprovet.
- Vortex de magnetiska pärlorna från neutrofiloleringssatsen för 30 s före användning för att återuppspädra de mycket fina magnetiska pärlorna.
- Tillsätt 500 μL av de magnetiska pärlorna till blodprovet och blanda försiktigt genom att vända röret flera gånger.
- Inkubera i rumstemperatur (RT) i 5 min.
- Fyll röret till 50 ml med EDTA Stock Solution 2. Blanda genom att mycket försiktigt pipettera upp och ner 2–3x.
- Placera röret i magneten och ta bort locket för att undvika efterföljande omrörning av röret.
- Inkubera i 10 min på RT.
- Pipettera försiktigt den berikade cellfjädringen som innehåller neutrofilerna i ett nytt koniskt rör på 50 ml.
OBS: Rör inte vid den sida av röret som kommer i kontakt med magneten och undvik uppsamling och störning av de röda blodkropparna längst ner i röret. Lämna cirka 10 ml av den röda blodkroppar suspensionen bakom botten av röret. - Vortex de magnetiska pärlorna för 30 s före användning och tillsätt 0,5 ml av de magnetiska pärlorna till röret som innehåller de berikade neutrofilerna. Blanda försiktigt genom att vända röret.
- Inkubera på RT i 5 min.
- Placera röret i magneten och ta bort locket för att undvika efterföljande omrörning.
- Inkubera på RT i 5 min.
- Pipettera försiktigt den berikade cellfjädringen som innehåller neutrofilerna i ett nytt koniskt rör på 50 ml.
OBS: Rör inte vid den sida av röret som kommer i kontakt med magneten. Lämna ca 5 ml av suspensionen längst ner i röret. - För att säkerställa ett fullständigt avlägsnande av magnetiska pärlor från cellblandningen, placera röret som innehåller de berikade cellerna i magneten.
- Inkubera i 10 min på RT.
- Pipettera försiktigt den berikade cellfjädringen som nu innehåller rena neutrofiler i ett nytt koniskt rör på 50 ml.
OBS: Rör inte vid den sida av röret som kommer i kontakt med magneten. Lämna ca 5 ml av suspensionen längst ner i röret. - Blanda de isolerade cellerna med 1 mM EDTA Stock Solution 2 till en slutlig volym på cirka 41 ml. Pipett upp och ner för att blanda.
- Dela upp lösningen lika i två rör med ca 20 ml i varje rör.
- Centrifugera båda rören vid 335 x g i 5 min.
- Under denna centrifugering ta MLi-2-hämmare lager (200 μM/1,000x koncentration) ur -80 °C frysen och låt stå vid RT för efterföljande användning.
- Omedelbart efter centrifugeringssteget och utan omrörning av rören, häll av supernatanten utan att störa neutrofilpelletsen. Resuspend varje cell pellet i 10 ml cellodlingsmedia (Tabell över material) vid RT genom att försiktigt pipettera celler upp och ner 4x.
3. LRRK2 kinashämmare behandling av rena neutrofiler
- Etikett ett rör "DMSO" och det andra röret "MLi-2".
- Tillsätt 10 μl DMSO till det "DMSO"-märkta röret och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner 2x med en 10 ml pipett. Till det "MLi-2"-märkta röret tillsätt 10 μL av 200 μM MLi-2-stamlösning (slutlig koncentration 200 nM) och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner 2x med en 10 ml pipett.
- Inkubera proverna i 30 min vid RT. Blanda försiktigt genom invertering var 10:e minut under inkubationen.
- Under inkubationstiden, ta bort 0,5 M DIFP-lagret från frysen -80 °C och placera i en rökhuva på is. Ta bort 1 mg/ml microcystin-LR-stamlösning från frysen -80 °C och låt RT tina. Ta ut en alikvot (0,25 ml) av lysbufferten ur frysen, låt den tina vid RT och placera den sedan på is för efterföljande användning.
- Förbered 1 ml cellodlingsmedium som innehåller 1 μl DMSO och anropa denna DMSO-resuspensionsbuffert. Förbered 1 ml RPMI-medium som innehåller 1 μL av 200 μM MLi-2 och anropa denna MLi-2 resuspensionsbuffert.
- Efter inkubationstiden på 30 minuter centrifugerar båda rören vid 335 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten försiktigt i varje rör utan att störa neutrofilpelleten.
- För DMSO-märkta provet återanvändas pelleten försiktigt i 1 ml av DMSO-resuspensionsbufferten och för det MLi-2-märkta röret, återutnyttja pelleten i 1 ml av MLi-2-resuspensionsbufferten.
- Överför de resuspended cellpelletsen till motsvarande centrifugeringsrör märkta "DMSO" och "MLi-2" och centrifugera båda rören vid 335 x g i 3 min.
- Under centrifugeringssteget, förbered lysbufferten. Tillsätt försiktigt 0,25 μL 0,5 M DIFP-lösning i rökhuven samt 0,25 μL 1 mg/ml mikrocystin-LR till 0,25 ml lysbufferten. Blanda och låt stå på is tills användning.
OBS: Tillsätt DIFP till lysbufferten inom 15 minuter efter celllys, eftersom DIFP är relativt instabilt i en vattenlösning. - Omedelbart efter centrifugering, försiktigt och helt ta bort alla supernatant med en pipett utan att störa neutrofil pelleten och placera rören på is.
- Tillsätt omedelbart 100 μl lysbuffert som innehåller DIFP och microcystine-LR till varje rör. Med hjälp av en 100–200 μl pipett återanvändas cellpelletsen genom att pipettera upp och ner ca 5–10x.
- Lyse cellerna på is i 10 min.
- Centrifugrör vid 20 000 x g i 15 min vid 4 °C för att avlägsna cellskräp.
- Överför supernatanterna "DMSO" och "MLi-2" som innehåller neutrofilterna till nya centrifugeringsrör. Kasta skräppelleten.
OBS: Neutrofilterna är nu klara för användning eller kan snäppas i flytande kväve och lagras vid -80 °C för framtida analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår analys gör det möjligt att förhöra aktiveringen av PD-associerade LRRK2 kinas i mänskliga perifera blod neutrofiler med LRRK2-beroende Rab10 fosforylering som en avläsning. Neutrofiler är en homogen och riklig perifer vita blodkroppar som uttrycker höga nivåer av både LRRK2 och Rab10 proteiner (figur 1). Den enda andra cellpopulationen bland de återstående mononukleära perifera blodcellerna (PBMCs) med högt kopieringsantal av båda proteinerna är monocyter, men dessa utgör endast 2–12% av de vita blodkropparna. Detta indikerar att perifert blod neutrofiler är en mer lämplig biomatrix för att studera LRRK2-kontrollerade Rab10 fosforylering.
Vid isolering av perifert blod neutrofiler från 10 ml blod med vårt förfarande, mellan 0,5-0,75 mg totalt protein lysate per givare erhölls (figur 2A), vilket är tillräckligt för ett betydande antal immunoblot analys för vilka endast 10 μg per gel körfält krävs. Vid kontroll av cellernas renhet och livskraft utförs inte rutinmässigt, vi visat för tre friska givare att renhet isolerade neutrofiler är mellan 94-98% och livskraften hos celler ~ 99% som bestäms av flöde cytometri analys med CD66b−Fluorercein isothiocyanat neutrophil markör och 4',6-Diamidine-2'-fenylindole dihydroklorid (DAPI) färgning för lönsamhet (figur 2A).
Medan fokus för denna publikation är isolering och bearbetning av neutrofiler från perifert blod och inte analys av kvantitativa västerländska blotting, Figur 2B visar att MJFF-pRab10 monoklonala antikroppar som specifikt upptäcker Rab10 fosforylerade vid treonin 73 visade robusta signaler i neutrophil prover, som var markant undertryckta av behandling med en potent och specifik LRRK2 kinashämmare, i detta fall MLi-2.
Neutrofiler innehåller höga halter av serinproteaser som kan påverka efterföljande western blot-analys. Medan DIFP effektivt undertrycker den höga proteasaktiviteten hos neutrofiler, är det en potent organofosforneurotoin och det skulle vara önskvärt att ersätta den med en lika effektiv men mindre toxisk proteashämmare, såsom fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). Vi fann att Rab10 fosforylering var lika välbevarad när DIFP ersattes av PMSF vid en koncentration av 2,5 mM (figur 2C). LRRK2-proteinets integritet äventyrades dock vid användning av PMSF jämfört med DIFP, vilket tyder på att det större LRRK2-proteinet är mer mottagligt för nedbrytning (figur 2C).
Vi har tidigare visat att en annan PD-orsakar genmutation VPS35 D620N resulterar i hyperaktivering av LRRK2 kinas med en ännu okänd mekanism15. Neutrofiler från tre personer med PD som hyser en sjukdomsframkallande heterozygous VPS35 D620N mutation isolerades med den metod som beskrivs i denna artikel (Figur 3). Neutrofila prover från nio friska givare isolerades som kontroller15. Immunoblot analys med hjälp av MJFF-pRab10 monoklonala antikroppar visar en betydande, ~ 3x ökning av Rab10 fosforylering vid Thr 73 i neutrofiler från Parkinsons patienter med en VPS35 D620N mutation jämfört med kontrollerna. Det totala Rab10-proteinuttrycket är liknande i alla 12 neutrofila prover.
Figur 1: Överflöd av LRRK2- och Rab10-proteiner i immunceller som isolerats från humant blod med hjälp av data som är allmänt tillgängliga i immprot-databasen (http://www.immprot.org)16. Diagrammet visar antalet proteinkopior per cell för LRRK2 och Rab10 i en rad perifera blod immunceller, inklusive delmängder av T-celler, B-celler, monocyter, NK celler, dendritiska celler, och granulocyter neutrofiler, basofiler och eosinofiler. Denna siffra har ändrats från et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Karakterisering och analys av humant perifert blod neutrofiler och betydelsen av DIFP för att förebygga proteolytisk nedbrytning i neutrofiler. (A) Neutrophils isolerades från hela blodet av tre friska givare (A, B och C) som visar renhet, livskraft och total proteinavkastning efter celllys. (B)Neutrofiler behandlades med eller utan LRRK2-kinashämmare (MLi-2), sedan lyst och genomgå kvantitativ immunoblotanalys med de angivna antikropparna via fluorescensavbildning i närheten (NIR). (C)Neutrofiler isolerades från två friska givare och behandlades med 100 nM MLi-2 i 30 min. Celler var lyserade i närvaro av antingen 0,5 mM DIFP eller 2,5 mM PMSF för att blockera serinproteasaktivitet i neutrofiler. A och B har modifierats från Mir et al.15, medan C har modifierats från et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ökad LRRK2 kinas utbildningsavsnitt verksamhet i Parkinsons sjukdom patienter hysa en heterozygeous VPS35 D620N mutation. Neutrophils isolerades från nio icke-ålder-matchade friska kontroller och tre PD patienter med en sjukdom-orsakar heterozygous VPS35 D620N mutation. Cellerna behandlades med eller utan 200 nM MLi-2 i 30 min före celllys. (A)Totalt 10 μg helcellextrakt som genomgått kvantitativ immunoblotanalys med de angivna antikropparna via fluorescensavbildning i nära infrarött (NIR). Immunoblots kvantifierades för fosfo-Thr73 Rab10:totalt Rab10-förhållande (B). Data analyserades av enkelriktade ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest. Uppgifter som presenteras som medel ± SD. p < 0,0001. Denna siffra har ändrats från Mir et al.15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Övertygande kliniska, genetiska och biokemiska bevis pekar mot en viktig roll för LRRK2 och i synnerhet dess kinas funktion vid Parkinsons sjukdom7. LRRK2 kinashämmare har utvecklats och går in i kliniska prövningar2,,4,,12. Som sådan finns det ett behov av att utnyttja LRRK2 som biomarkör för målengagemang samt patientstratifiering. Vårt protokoll beskriver en robust och enkel analys för att analysera LRRK2 kinas väg aktivering som återspeglas av fosforylering av dess fysiologiska substrat Rab10 i homogena pool av humant perifert blod neutrofiler11,14. För analys av kvantitativ immunblottning rekommenderar vi starkt användning av en mycket selektiv fosfospecific Rab10-antikropp (MJFF-pRab10 monoklonal antikropp)14,17.
Vi använder mänskliga neutrofiler eftersom de utgör en homogen delmängd av perifera blodkroppar som utgör den dominerande leukocytpopulationen17,,18. Ännu viktigare är att neutrofiler också har höga proteinuttrycksnivåer av LRRK2 och dess delstat Rab10 (figur 1)16. Däremot är de återstående delmängderna av leukocyter som utgör poolen av PBMCs heterogena med varierande och övervägande lågt uttryck för LRRK2 och Rab10. Monocyter och dendritiska celler har höga uttrycksnivåer, men är låga i totalt överflöd16.
Medan vi rekommenderar användning av EDTA vacutainer blodinsamlingsrör, kan ett andra antikoagulantia än EDTA användas. Förekomsten av EDTA är dock viktig för neutrofilisoleringssatsens prestanda. Vi rekommenderar därför att man lägger till EDTA i hela blodprovet så att en slutlig koncentration på 1 mM EDTA uppnås även om ett alternativt blodförtunnande medel används. Användningen av neutrofiloleringssatsen möjliggör rening av neutrofiler direkt från humant helblod genom immunomagnetiskt negativt urval på ett relativt snabbt och enkelt sätt. Antalet tillgängliga magneter avgör hur många blodprover som kan bearbetas parallellt. Det är lätt möjligt att isolera neutrofiler från upp till sex blodprover parallellt med hjälp av sex magneter. En potentiell nackdel är den tillhörande kostnaden för kommersiella neutrofil isolation kit och den nödvändiga magneten. Alternativa metoder för neutrofilolering från helblod har beskrivits och förlitat sig på densitetsgradientseparation eller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), som har betydande nackdelar. Den förra är betydligt mer tid och arbetsintensiva och åtminstone i våra händer inte lika tillförlitliga och effektiva. Den senare kräver en FACS maskin och ytterligare åtgärder för hantering skulle behöva införas, inklusive utarmning av röda blodkroppar och cellfärgning, lägga tid till cellisoleringsprocessen. Sammantaget är immunmagnetisk isolering snabb, genererar ett mycket rent prov och undviker överdriven hantering av cellerna. När det gäller provbearbetning har vi tidigare visat att en fördröjning mellan blodinsamling och neutrofilolering på minst upp till 24 h inte leder till någon betydande förändring eller variation i resultatet av vår analys, vilket ger flexibilitet för framtida klinisk exploatering11.
Själva neutrofil isoleringsproceduren är mycket lätt. Vi rekommenderar att du virvlar de magnetiska pärlorna före varje användning. Det är också viktigt att inte störa magneten när röret är inne i magneten för att undvika turbulens och rubbament av de magnetiska pärlorna. Neutrofiler berikas i suspension av flera omgångar av immunomagnetiska avlägsnande av alla oönskade celler. Var noga med att inte vidröra den sida av röret som är i kontakt med magneten och under den första isoleringsrundan (steg 2.11) för att inte störa de röda blodkropparna längst ner i röret. Efter den sista omgången pipettering av den berikade cellfjädringen i ett nytt koniskt rör (steg 2.24) är neutrofiler omedelbart tillgängliga för vidare bearbetning. Om neutrofiler används för att bedöma LRRK2-aktivitet i celler delas neutrofiler sedan upp i två partier och efter pelletering genom centrifugering, återutnyttjas i antingen en LRRK2-kinashämmare (här, MLi-2) eller DMSO som innehåller cellodlingsmedium. Eftersom defosforylering i närvaro och fosforylering i avsaknad av LRRK2-väsenshämning är relativt snabba händelser, måste man se till att den MLi-2-behandlade neutrofilfraktionen förblir exponerad för en LRRK2-kinashämmare (t.ex. fram till celllys (steg 3.8–3.10).
Det finns flera centrifugeringssteg i detta protokoll med 15 och 50 ml koniska rör. Medan vi rutinmässigt använder de angivna centrifugeringshastigheterna i protokollet, är det möjligt att öka centrifugeringshastigheten upp till 400 x g utan att negativt påverka cellernas livskraft. Detta resulterar i en något fastare neutrofil cell pellet som kan bidra till att minska eventuella förluster av neutrofilt material under dekantering och pipettering av supernatant steg under detta protokoll. Detta kommer sannolikt att öka avkastningen i form av totala protein lysate erhålls. Ett potentiellt problem är att en högre centrifugeringskraft kan aktivera neutrofiler och potentiellt påverka efterföljande analys. Vår allmänna rekommendation är att hantera neutrofiler under varje steg i protokollet så försiktigt som möjligt.
Vårt protokoll använder den mycket potenta serin proteashämmaren DIFP (0,5 mM) som en del av neutrophil lysis buffert. DIFP är en potent organophosphorus neurotoxin, och medan vi har undersökt alternativa föreningar, dess tillägg till lysis bufferten var viktigt för analys av LRRK2-kontrollerade Rab10 fosforylering hos mänskliga neutrofiler genom immunoblotting. Till exempel har ersätta DIFP med 1% (w / v) SDS har använts för att lyse neutrofiler i andra studier19 och ledde till betydande protein nedbrytning i den utsträckning som immunblottning för LRRK2, Rab10, och även GAPDH lastning kontroll gav inte en signal, vilket belyser vikten av att inkludera en mycket potent proteashämmare i lysbufferten (figur 2C). Vid byte av DIFP med den mindre potenta, men också mindre giftiga serinproteashämmaren PMSF vid 2,5 mM, var Rab10 fosporylering väl bevarad, men det större LRRK2-proteinet genomgick betydande nedbrytning (figur 2C). För att minimera hanteringen av DIFP-stamlösningen kan lysbuffert som innehåller DIFP beredas i omgångar, aliciteras och lagras vid -20 °C eller -80 °C11. När det gäller analysen av kvantitativ immunblottning är det av största vikt att använda en fosfospecific antikropp som har visat sig vara selektiv för endast ett enda LRRK2 fosforylerat Rab-protein, såsom MJFF-pRab10-antikroppen som används för våra studier14.
Protokollet kan också skalas upp med hjälp av en maximal volym helblod på upp till 25 ml, vilket är den gräns som kan bearbetas i ett isoleringsförfarande med hjälp av en magnet, som kan rymma 50 ml koniska rör. De enda steg som skulle behöva justeras är steg 2.4 (tillsats av 50 μl isoleringscocktail per ml blod), steg 2.6 och 2.12 (tillsats av 50 μl magnetiska pärlor per ml blod) och en proportionell ökning av volymen av lysbuffert för neutrofillys i steg 3.12. Alla andra steg kan hållas identiska.
Sammanfattningsvis beskriver vårt protokoll en enkel och robust metod för att isolera mänskliga neutrofiler från perifert blod. Neutrofiler kan sedan behandlas med och utan en potent och specifik LRRK2 kinashämmare för att möjliggöra kvantifiering av LRRK2-kontrollerad fosforylering av Rab10 in vivo. Detta kan vara användbart för stratifiering individer enligt LRRK2 kinas utbildningsavsnitt verksamhet och för att identifiera dem med väg hyperaktivering som kan dra nytta av framtida LRRK2 kinas hämmare behandling. Även om detta kommer att vara osannolikt fallet för de flesta människor med PD, särskilt idiopatisk PD, vår analys har redan framgångsrikt använts i individer som bär en sällsynt, heterozygous mutation i en annan PD-associerade gen, VPS35 D620N, där LRRK2 kinas utbildningsavsnitt verksamhet ökar avsevärt genom en ännu okänd mekanism15. Vi hade tidigare undersökt LRRK2-kontrollerade Rab 10 fosforylering nivåer i ett litet antal individer som bär de vanligaste LRRK2 G2019S mutation som är känd för att aktivera LRRK2 kinas aktivitet endast blygsamt med en faktor på cirka två utan att upptäcka en betydande skillnad jämfört med kontroller och patienter med idiopatisk PD med vår analys11,14. Detta och ytterligare opublicerade data tyder på att LRRK2 kinas aktivitet förmodligen kräver en ökning med >3x för att ge ett betydande resultat med kvantitativa immunblotting. Känsligheten för att upptäcka aktivering av LRRK2-kinasavsnitt kan dock sannolikt ökas om den senaste masspektrometritekniken distribueras.
Vi föreslår att neutrofiler är en värdefull resurs för Parkinsons sjukdom forskning om LRRK2 kinas utbildningsavsnitt verksamhet och kan hjälpa till att identifiera individer som skulle kunna dra nytta av framtida LRRK2 kinas hämmare behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar de friska frivilliga som vänligt donerat blod för den aktuella studien. Vi tackar Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research (MJFF) och Fox BioNet study leadership (FBN) för deras stöd och input till det skriftliga protokollet och videon. Vi tackar professor Alexander Zimprich från Wiens universitet i Österrike för att ha testat vårt protokoll och samarbete. Vi värdesätter Paul Davies bidrag till projektet (general manager för MRC PPU). Vi känner också igen det utmärkta tekniska stödet för MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit (PPU) nämligen kemisk syntes (Natalia Shpiro för syntes MLi-2), MRC PPU Reagenser och tjänster antikroppsrening team (samordnas av Hilary McLauchlan och James Hastie). Vi tackar Mhairi Towler och Fraser Murdoch från Vivomotion för deras hjälp med att göra videor och animationer. Vi tackar Steve Soave från 81 filmer för hjälp med de slutliga redigeringarna. Esther Sammler stöds av en skotsk Senior Clinical Academic Fellowship och har fått finansiering från Parkinsons Storbritannien (K-1706).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
