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Biochemistry

रै10 फॉस्फोरिलेशन का आकलन करके पार्किंसंस के एसोसिएटेड LRRK2 Kinase पाथवे से पूछताछ के लिए मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल अलगाव

Published: March 21, 2020 doi: 10.3791/58956
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 3, 4, 5, 1, 1,6
1MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, 2The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, 3Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 4Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Centre and the Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease, Toronto Western Hospital, University of Toronto, 5Division of Cell Signalling and Immunology, School of Life Sciences, University of Dundee, 6Division of Molecular and Clinical Medicine, School of Medicine, Ninewells Hospital and Medical School, University of Dundee
* These authors contributed equally

Summary

ल्यूसिन रिच रिपीट किनेस 2 जीन (LRRK2) में म्यूटेशन वंशानुगत पार्किंसंस रोग का कारण बनता है। हमने मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल में राब10 के LRRK2-नियंत्रित फॉस्फोरिलाइजेशन का आकलन करने के लिए एक आसान और मजबूत तरीका विकसित किया है। यह बढ़ी हुई LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि के साथ व्यक्तियों की पहचान करने में मदद कर सकता है।

Abstract

ल्यूसिन रिच रिपीट किनेज 2 (LRRK2) वंशानुगत पार्किंसंस रोग (पीडी) में सबसे अधिक बार उत्परिवर्तित जीन है और सभी रोगजनक LRRK2 म्यूटेशन के परिणामस्वरूप इसके किनेस फ़ंक्शन का हाइपरएक्टिवेशन होता है। यहां, हम अपने शारीरिक सब्सट्रेट्स में से एक, रा10 में थ्रेनोइन 73 में LRRK2 नियंत्रित फॉस्फोरिलेशन को मापने के द्वारा मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल में LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक आसान और मजबूत परख का वर्णन करते हैं। वर्णित इम्यूनोब्लास्टिंग विश्लेषण के लिए पूरी तरह से चयनात्मक और फॉस्फोस्पेस एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है जो LRRK2 द्वारा रै10 Thr73 epitope फॉस्फोरोरीटेड को पहचानता है, जैसे एमजेएफएफ-pRab10 खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी। यह मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल का उपयोग करता है, क्योंकि परिधीय रक्त आसानी से सुलभ है और न्यूट्रोफिल एक प्रचुर मात्रा में और समरूप घटक हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि न्यूट्रोफिल LRRK2 और Rab10 दोनों के अपेक्षाकृत उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं। न्यूट्रोफिल की संभावित खामी उनकी उच्च आंतरिक सेरीन प्रोटीज़ गतिविधि है, जो लिसिस बफर के हिस्से के रूप में ऑर्गेनोफॉस्फोरस न्यूरोटॉक्सिन डाइसोप्रोपिलोफ्लोरोफॉस्फेट (डीआईएफपी) जैसे बहुत शक्तिशाली प्रोटीज़ अवरोधकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। फिर भी, न्यूट्रोफिल वीवो में LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि में अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन हैं और इसे पीडी बायोरेपोसिटरी संग्रह में शामिल करने के लिए विचार किया जाना चाहिए।

Introduction

पार्किंसंस रोग (पीडी) को धीमा या रोकने के प्रयास इस प्रकार अब तक विफल रहे हैं । ल्यूसिन रिच रिपीट किनेज 2 (LRRK2) में हाइपरएक्टिवेशन म्यूटेशन की खोज, जो पीडी के लिए जोखिम का कारण बनती है और/या बढ़ जाती है, जिससे LRRK2 kinase अवरोधक1,2,3का विकास हुआ है । ये अब नैदानिक परीक्षण4में प्रवेश कर चुके हैं । LRRK2 का सटीक कार्य अस्पष्ट है, लेकिन एक प्रमुख उन्नति राब जीटीपास प्रोटीन के सबसेट की पहचान रही है, जिसमें राब10 शामिल है, LRRK2 kinase5,6,6,7के पहले सदाशयी शारीरिक सब्सट्रेट्स के रूप में। रोग को संशोधित करने वाले चिकित्सीय चिकित्सा विज्ञान के युग में प्रमुख चुनौतियां LRRK2 kinase सक्रियण स्थिति के जैव रासायनिक मार्कर और LRRK2 kinase अवरोधकों के लक्ष्य सगाई कर रहे हैं ।

अब तक, वीवो में LRRK2 अवरोधकों के लिए प्रमुख फार्माकोकिनेटिक मार्कर LRRK2 के संविलियन फॉस्फोरेटेड सेरीन अवशेषों का एक समूह रहा है, विशेष रूप से सेरीन 935 में, जो विविध LRRK2अवरोधक8,,9के जवाब में डिफोस्फोरेटेड हो जाता है। हालांकि, सेरीन 935 फॉस्फोरिलेशन आंतरिक सेलुलर LRRK2 kinase गतिविधि के साथ सहसंबंधित नहीं है क्योंकि यह सीधे LRRK2 द्वारा फॉस्फोरिक नहीं है और अभी भी किनेस-निष्क्रिय LRRK210में फॉस्फोरेटेड है। LRRK2 kinase गतिविधि सेरीन 12 9 2 के ऑटोफोस्फोरिलेशन के साथ अच्छी तरह से संबंधित है, लेकिन यह व्यावहारिक दृष्टि से इस साइट10,,11के लिए विश्वसनीय और फॉस्फोस्पेसिक एंटीबॉडी की वर्तमान कमी के कारण पूरे सेल अर्क के इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण द्वारा एंडोजेनस LRRK2 kinase गतिविधि के लिए उपयुक्त रीडआउट नहीं है।

हमने मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं में LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मजबूत और आसान परख विकसित की है जो थ्रेनोइन 7311में अपने शारीरिक लक्ष्य प्रोटीन राब10 के LRRK2-नियंत्रित फॉस्फोरिलेशन को मापता है। परिधीय रक्त वेनेसेक्शन द्वारा आसानी से सुलभ होता है, जो एक कम जोखिम और त्वरित प्रक्रिया है जो न्यूनतम असुविधा का कारण बनती है। हम मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल पर ध्यान केंद्रित करते हैं क्योंकि वे प्रचुर मात्रा में (सभी सफेद रक्त कोशिकाओं का 37-80%) और सजातीय कोशिका आबादी का गठन करते हैं जो LRRK2 और Rab1011दोनों के अपेक्षाकृत उच्च स्तर को व्यक्त करता है। इसके अलावा, पेरिफेरल रक्त न्यूट्रोफिल को इम्यूनोमैग्नेटिक नकारात्मक दृष्टिकोण को नियोजित करके जल्दी और कुशलता से अलग किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि बाद में मनाया गया रब्10 फॉस्फोरिलेशन LRRK2 द्वारा मध्यस्थता किया जाता है, न्यूट्रोफिल के प्रत्येक बैच को शक्तिशाली और चयनात्मक LRRK2 kinase अवरोधक के साथ या बिना इनक्यूबेटेड किया जाता है (हम MLi-2 का उपयोग करते हैं और अनुशंसा करते हैं)2,,12। इसके बाद एक बफर में सेल लिसिस होता है जिसमें प्रोटीज़ अवरोधक डाइसोप्रोपिल फ्लोरोफॉस्फेट (डीआईएफपी) होता है, जो आंतरिक सेरीन प्रोटीज गतिविधि को दबाने के लिए आवश्यक है जिसे न्यूट्रोफिल13में उच्च माना जाता है। मात्रात्मक इम्यूनोब्लास्टिंग द्वारा अंतिम विश्लेषण के लिए, हम एमजेएफएफ-pRab10 खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो विशेष रूप से राब10 थ्र73-फॉस्फोपिटोप का पता लगाता है और अन्य फॉस्फोरोर्टेड राब प्रोटीन14के साथ क्रॉस-रिएक्ट नहीं करता है। इस एंटीबॉडी की चयनात्मकता और विशिष्टता को विभिन्न राब प्रोटीन और A549 Rab10 नॉक-आउट सेल लाइन14के अतिअभिव्यक्ति मॉडलों में मान्य किया गया है। इस प्रकार, हम न्यूट्रोफिल लिसेट में राब10 फॉस्फोरिलेशन में अंतर को मापते हैं जिनका इलाज शक्तिशाली और चयनात्मक LRRK2 kinase अवरोधक2के बिना किया गया है। वैकल्पिक रूप से, नमूनों का विश्लेषण अन्य तरीकों से भी किया जा सकता है, जैसे मात्रात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री।

निष्कर्ष में, LRRK2-नियंत्रित Rab10 फॉस्फोरिलेशन LRRK2 kinase गतिविधि का एक बेहतर मार्कर है LRRK2 फॉस्फोरिलेशन के लिए LRRK2 फॉस्फोरिलेशन में सेरीन 935 और मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल LRRK2 में पीडी अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन हैं। हमारा प्रोटोकॉल परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल में LRRK2 मार्ग गतिविधि से पूछताछ करने के लिए एक मजबूत और आसान परख प्रदान करता है और बढ़ी हुई LRRK2 kinase गतिविधि15के साथ व्यक्तियों के जैव रासायनिक स्तरीकरण की अनुमति देता है । महत्वपूर्ण बात, ऐसे व्यक्तियों को भविष्य LRRK2 kinase अवरोधक उपचार से लाभ हो सकता है ।

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Protocol

स्थानीय ब्रिटेन के नियमन के अनुसार मानव रक्त के सभी जोड़तोड़ और पाइपिंग एक श्रेणी 2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किए जाते हैं । सभी प्रक्रियाओं को स्थानीय नैतिकता समीक्षा बोर्ड के अनुपालन में किया गया था और सभी प्रतिभागियों को सूचित सहमति प्रदान की है ।

1. तैयारी

  1. फास्फेट-बफर्ड लवलाइन (पीबीएस) में 100 मीटर ईटीए युक्त ईटीए स्टॉक सॉल्यूशन 1 का 0.1 एमएल तैयार करें।
  2. पीबीएस में 1 एमएम ईटीए युक्त ईटीए स्टॉक सॉल्यूशन 2 का 60 एमएल तैयार करें।
  3. 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच = 7.5), 1% (v/v) ट्राइटन एक्स-100, 1 एमएम ईटीए, 1 एमएम एनए3वीओ4,50 एमएम एनएफ युक्त लिसिस बफर तैयार करें, 10 एमएम-ग्लाइसेरोफॉस्फेट, 5 एमएम सोडियम पायरोफॉस्फेट, 0.27 मीटर सुक्रोज, 0.1% (v/v) ए-मर्काप्टोथेनॉल, 1x प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल, 1 μg/mL माइक्रोसिस्टिसिन-एलआर, और 0.5 m डाइसोप्रोपिल फ्लोरोफॉस्फेट (DIFP)।
    नोट: लेखक नियमित रूप से एक EDTA मुक्त उत्पाद का उपयोग करते हैं, लेकिन एक EDTA युक्त प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल भी काम करना चाहिए । लिसिस बफर को पहले से बिना ए-मर्काप्टोथेनॉल, प्रोटीज़ अवरोधक, माइक्रोसिस्टिन-एलआर और डीआईएफपी के बिना बनाया जा सकता है, और उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि उपयोग से तुरंत पहले, प्रोटीज़ अवरोधक, माइक्रोस्टिसिन-एलआर और डीआईएफपी को जोड़ा जाता है।
    सावधानी: DIFP विषाक्त है और स्थानीय स्वास्थ्य और सुरक्षा जोखिम आकलन के बाद एक धूम हुड में देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए । DIFP lysis बफर में जोड़ा जा सकता है और तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, डीआईएफपी सहित अन्य सभी घटकों वाले पूर्ण लिसिस बफर को कम से कम 4 सप्ताह के लिए बाद के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. पूरे रक्त से न्यूट्रोफिल अलगाव

  1. रक्त संग्रह ट्यूब में 10 मीटर रक्त एकत्र करें। ट्यूब 7−8x उलटा कर धीरे मिलाएं।
  2. एक 50 मीटर शंकुट्यूब में रक्त के 10 mL स्थानांतरित करें।
  3. रक्त में ईटीए स्टॉक सॉल्यूशन 1 के 100 माइक्रोन जोड़ें। धीरे-धीरे मिलाएं।
  4. पूरे रक्त नमूने में न्यूट्रोफिल आइसोलेशन किट(सामग्री की तालिका)से आइसोलेशन कॉकटेल (50 μL/mL) के 500 माइक्रोन जोड़ें।
  5. बहुत बारीक चुंबकीय मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए उपयोग से पहले 30 एस के लिए न्यूट्रोफिल आइसोलेशन किट से चुंबकीय मोती भंवर।
  6. रक्त के नमूने में चुंबकीय मोतियों के 500 माइक्रोन जोड़ें और कई बार ट्यूब को उलटकर धीरे-धीरे मिलाएं।
  7. 5 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट।
  8. ईटीए स्टॉक सॉल्यूशन 2 के साथ ट्यूब को 50 मिलील तक भरें। 2-3x के ऊपर और नीचे बहुत धीरे-धीरे पाइपिंग करके मिलाएं।
  9. ट्यूब को चुंबक में रखें और ट्यूब के बाद के आंदोलन से बचने के लिए ढक्कन हटा दें।
  10. आरटी में 10 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
  11. ध्यान से समृद्ध सेल निलंबन है कि एक नया 50 mL शंकु ट्यूब में न्यूट्रोफिल शामिल हैं।
    नोट: चुंबक के संपर्क में आने वाली ट्यूब के किनारे को न छुएं और ट्यूब के नीचे लाल रक्त कोशिकाओं के संग्रह और क्षोभ से बचें। ट्यूब के नीचे लाल रक्त कोशिका निलंबन के लगभग 10 mL छोड़ दें।
  12. उपयोग से पहले 30 एस के लिए चुंबकीय मोतियों को भंवर करें और समृद्ध न्यूट्रोफिल युक्त ट्यूब में चुंबकीय मोतियों का 0.5 मिलील जोड़ें। ट्यूब को उलटकर धीरे-धीरे मिलाएं।
  13. 5 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  14. ट्यूब को चुंबक में रखें और बाद के आंदोलन से बचने के लिए ढक्कन हटा दें।
  15. 5 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  16. ध्यान से समृद्ध सेल निलंबन है कि एक नया 50 mL शंकु ट्यूब में न्यूट्रोफिल शामिल हैं।
    नोट: चुंबक के संपर्क में आने वाली ट्यूब के किनारे को न छुएं। ट्यूब के नीचे निलंबन के लगभग 5 mL छोड़ दें।
  17. कोशिका मिश्रण से चुंबकीय मोतियों को पूरी तरह से हटाने को सुनिश्चित करने के लिए, समृद्ध कोशिकाओं वाले ट्यूब को चुंबक में रखें।
  18. आरटी में 10 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
  19. ध्यान से समृद्ध सेल निलंबन है कि अब एक नया 50 mL शंकु ट्यूब में शुद्ध न्यूट्रोफिल शामिल हैं।
    नोट: चुंबक के संपर्क में आने वाली ट्यूब के किनारे को न छुएं। ट्यूब के नीचे निलंबन के लगभग 5 mL छोड़ दें।
  20. लगभग 41 मिलील की अंतिम मात्रा में 1 mM EDTA स्टॉक समाधान 2 के साथ अलग कोशिकाओं को मिलाएं। मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  21. प्रत्येक ट्यूब में लगभग 20 मीटर के साथ समाधान को समान रूप से दो ट्यूबों में विभाजित करें।
  22. 5 मिन के लिए 335 x ग्राम पर दोनों ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें।
  23. इस दौरान सेंट्रलाइजेशन -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से एमली-2 अवरोधक स्टॉक (200 माइक्रोएम/1,000x एकाग्रता) लेते हैं और बाद के उपयोग के लिए आरटी पर छोड़ देते हैं।
  24. केंद्रीकरण कदम के तुरंत बाद और ट्यूबों के आंदोलन के बिना, न्यूट्रोफिल छर्रों को परेशान किए बिना अधिनायक को बंद कर दें। सेल संस्कृति मीडिया के 10 mL में प्रत्येक सेल गोली को फिर से निलंबित करें(सामग्री की तालिका)आरटी पर धीरे से 4x कोशिकाओं को पाइपिंग करके।

3. शुद्ध न्यूट्रोफिल का LRRK2 kinase अवरोधक उपचार

  1. एक ट्यूब "DMSO" और अन्य ट्यूब "MLi-2" लेबल।
  2. "DMSO" लेबल ट्यूब के लिए, DMSO के 10 μL जोड़ें और एक 10 mL पिपेट के साथ ऊपर और नीचे 2x पाइपिंग द्वारा धीरे मिश्रण । "MLi-2" लेबल ट्यूब के लिए, 200 माइक्रोन MLi-2 स्टॉक समाधान (अंतिम एकाग्रता 200 एनएम) के 10 μL जोड़ें और एक 10 mL पिपेट के साथ 2x ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा धीरे से मिश्रण।
  3. आरटी में 30 मिन के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें । ऊष्मायन के दौरान हर 10 मेंल के दौरान उलटा द्वारा धीरे से मिलाएं ।
  4. ऊष्मायन अवधि के दौरान, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से 0.5 एम डीआईएफ स्टॉक निकालें और बर्फ पर एक धुएं के हुड में रखें। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से 1 मिलीग्राम/एमएल माइक्रोसिस्टिन-एलआर स्टॉक सॉल्यूशन निकालें और आरटी पर गल कर छोड़ दें। लिसिस बफर का एक एलिकोट (0.25 mL) फ्रीजर से बाहर ले जाएं, इसे आरटी पर डिफ्रॉस्ट करने की अनुमति दें, और फिर इसे बाद के उपयोग के लिए बर्फ पर रखें।
  5. डीएमएसओ के 1 माइक्रोन युक्त सेल कल्चर मीडियम का 1 एल तैयार करें और इस डीएमएसओ रिस्पेंशन बफर को कॉल करें। आरपीएमआई मीडिया के 1 एमआईएल तैयार करें जिसमें 200 माइक्रोएम एमली-2 का 1 माइक्रोन हो और इस एमली-2 रिस्पेंशन बफर को कॉल करें।
  6. 30 मिन ऊष्मायन अवधि के बाद, अपकेंद्री 5 मिन के लिए 335 x ग्राम पर दोनों ट्यूबों।
  7. न्यूट्रोफिल पैलेट को परेशान किए बिना प्रत्येक ट्यूब में अधिनायक को सावधानीपूर्वक त्याग दें।
  8. DMSO लेबल नमूना के लिए धीरे DMSO पुनर्सस्पेंशन बफर के 1 mL में गोली फिर से निलंबित और MLi-2 लेबल ट्यूब के लिए, MLi-2 पुनर्निलंबन बफर के 1 mL में गोली फिर से निलंबित ।
  9. "DMSO" और "MLi-2" लेबल इसी अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए पुनर्निलंबित सेल छर्रों स्थानांतरण और 3 मिन के लिए ३३५ x ग्राम पर दोनों ट्यूबों अपकेंद्रित्र ।
  10. सेंट्रलाइज्ड स्टेप के दौरान लाइसेस बफर तैयार करें। धूम हुड में ध्यान से 0.5 एम DIFP समाधान के 0.25 μL के साथ ही 0.25 मीटर माइक्रोसिस्टिन-एलआर के 0.25 माइक्रोन 0.25 मीटर लिसिस बफर में जोड़ें। मिश्रण और उपयोग तक बर्फ पर छोड़ दें।
    नोट: सेल लिसिस के 15 मिनट के भीतर लिसिस बफर में DIFP जोड़ें, क्योंकि DIFP एक जलीय समाधान में अपेक्षाकृत अस्थिर है।
  11. केंद्रीकरण के तुरंत बाद, ध्यान से और पूरी तरह से न्यूट्रोफिल गोली को परेशान किए बिना एक पिपेट के साथ सभी अधिनायक को हटा दें और ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
  12. प्रत्येक ट्यूब में तुरंत 100 माइक्रोन डालें जिसमें डीआईएफपी और माइक्रोसिस्टिसिन-एलआर युक्त लिसिस बफर हो। 100-200 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके, सेल छर्रों को 5-10x के बारे में ऊपर और नीचे पाइपिंग करके फिर से निलंबित करें।
  13. 10 मिन के लिए बर्फ पर कोशिकाओं Lyse ।
  14. सेल मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मीटर के लिए 20,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज ट्यूब।
  15. न्यूट्रोफिल वाले "डीएमएसओ" और "एमली-2" सुपरनेटेंट को नए सेंट्रलाइज्ड ट्यूबों में स्थानांतरित करें। मलबे की गोली फेंकें।
    नोट: न्यूट्रोफिल lysates अब उपयोग के लिए तैयार हैं या तरल नाइट्रोजन में जमे हुए तस्वीर हो सकती है और भविष्य के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

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Representative Results

हमारी परख एक readout के रूप में LRRK2-निर्भर Rab10 फॉस्फोरिलेशन के साथ मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल में पीडी से जुड़े LRRK2 kinase की सक्रियता पूछताछ की अनुमति देता है । न्यूट्रोफिल एक समरूप और प्रचुर मात्रा में परिधीय सफेद रक्त कोशिका आबादी है जो LRRK2 और Rab10 प्रोटीन(चित्रा 1)दोनों के उच्च स्तर को व्यक्त करती है। शेष परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) दोनों प्रोटीन की उच्च प्रति संख्या के साथ केवल अन्य सेल आबादी मोनोसाइट्स हैं, लेकिन ये सफेद रक्त कोशिकाओं का केवल 2-12% बनाते हैं। यह इंगित करता है कि परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल LRRK2-नियंत्रित राब10 फॉस्फोरिलाइजेशन का अध्ययन करने के लिए एक अधिक उपयुक्त बायोमैट्रिक्स हैं।

जब परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल को हमारी प्रक्रिया के साथ 10 मिलीग्राम रक्त से अलग किया जाता है, तो प्रति दाता 0.5-0.75 मिलीग्राम कुल प्रोटीन लाइसेट(चित्रा 2ए)प्राप्त किया गया था, जो इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण की एक महत्वपूर्ण संख्या के लिए पर्याप्त है जिसके लिए केवल 10 μg प्रति जेल लेन की आवश्यकता होती है। जबकि कोशिकाओं की शुद्धता और व्यवहार्यता की जांच नियमित रूप से नहीं किया जाता है, हमने तीन स्वस्थ दानदाताओं के लिए प्रदर्शन किया कि अलग-थलग किए गए न्यूट्रोफिल की शुद्धता 94-98% के बीच है और कोशिकाओं की व्यवहार्यता ~ 99% के रूप में प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा निर्धारित सीडी 66b−फ्लोरेसिन आइसोथिओटिकेनेट न्यूट्रोफिल मार्कर और 4',6-डियामामिन-2'-फेनिलिंडोल डाइहाइड्रोक्लोराइड (डीपीआई)Figure 2A

जबकि इस प्रकाशन का ध्यान परिधीय रक्त से न्यूट्रोफिल का अलगाव और प्रसंस्करण है न कि मात्रात्मक पश्चिमी दाग द्वारा विश्लेषण, चित्रा 2B दर्शाता है कि MJFF-pRab10 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जो विशेष रूप से थ्रेनोइन 73 में राब10 फॉस्फोरोरीट का पता लगाता है, ने न्यूट्रोफिल नमूनों में मजबूत संकेतों का खुलासा किया, जिन्हें इस मामले में एमली-2 एक शक्तिशाली और विशिष्ट LRRK2 काइनेज अवरोधक के साथ उपचार द्वारा स्पष्ट रूप से दबाया गया था।

न्यूट्रोफिल में सेरिन प्रोटीज़ के उच्च स्तर होते हैं जो बाद के पश्चिमी दाग विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं। जबकि DIFP प्रभावी रूप से न्यूट्रोफिल में उच्च प्रोटीज़ गतिविधि को दबा देता है, यह एक शक्तिशाली ऑर्गेनोफॉस्फोरस न्यूरोटॉक्सिन है और इसे समान रूप से प्रभावी लेकिन कम विषाक्त प्रोटीज अवरोधक के साथ बदलना वांछनीय होगा, जैसे फिनाइलमेथिलसुल्फोनाइल फ्लोराइड (पीएमएसएफ)। हमने पाया कि Rab10 फॉस्फोरिलेशन समान रूप से अच्छी तरह से संरक्षित किया गया था जब DIFP को पीएमएसएफ द्वारा 2.5 एमएम(चित्रा 2 C)की एकाग्रता पर प्रतिस्थापित किया गया था। हालांकि, DIFP की तुलना में पीएमएसएफ का उपयोग करते समय LRRK2 प्रोटीन की अखंडता से समझौता किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि बड़ा LRRK2 प्रोटीन गिरावट(चित्रा 2C)के लिए अतिसंवेदनशील है।

हमने पहले दिखाया है कि एक और पीडी पैदा करने वाले जीन उत्परिवर्तन VPS35 D620N के परिणामस्वरूप एक अज्ञात तंत्र15द्वारा LRRK2 kinase के अतिसक्रियण में परिणाम है । पीडी के साथ तीन लोगों से Neutrophils एक बीमारी के कारण विषमता एंवी35 D620N उत्परिवर्तन इस लेख में वर्णित विधि का उपयोग कर अलग थे(चित्रा 3)। नौ स्वस्थ दानदाताओं के न्यूट्रोफिल नमूनों कोनियंत्रण 15के रूप में अलग किया गया । एमजेएफएफ-pRab10 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोलॉट विश्लेषण नियंत्रण की तुलना में एक VPS35 D620N उत्परिवर्तन के साथ पार्किंसंस रोगियों से न्यूट्रोफिल में Thr 73 में राब10 फॉस्फोरिलेशन में एक महत्वपूर्ण, ~ 3x वृद्धि को दर्शाता है। कुल राब10 प्रोटीन एक्सप्रेशन सभी 12 न्यूट्रोफिल नमूनों में समान है ।

Figure 1
चित्रा 1: इम्यून कोशिकाओं में LRRK2 और Rab10 प्रोटीन की बहुतायत डेटा है कि सार्वजनिक रूप से इम्प्रोट डेटाबेस (http://www.immprot.org)16पर उपलब्ध है का उपयोग कर मानव रक्त से अलग । ग्राफ में टी कोशिकाओं के सबसेट, बी कोशिकाओं, मोनोसाइट्स, एनके कोशिकाओं, डेंड्रिटिक कोशिकाओं, और ग्रैनुलोसाइट्स न्यूट्रोफिल, बासोफिल और eosinophils सहित परिधीय रक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए प्रति कोशिका प्रोटीन प्रति की संख्या से पता चलता है । इस आंकड़े को फैन एट अल11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: न्यूट्रोफिल में प्रोटेलिटिक क्षरण की रोकथाम के लिए मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल और डिफर्प के महत्व का लक्षण वर्णन और विश्लेषण।(A)न्यूट्रोफिल तीन स्वस्थ दानदाताओं (ए, बी और सी) के पूरे रक्त से अलग-थलग थे, जिसमें कोशिका ओंटिस के बाद शुद्धता, व्यवहार्यता और कुल प्रोटीन उपज दिखाई गई थी। (ख)न्यूट्रोफिल के साथ या LRRK2 kinase अवरोधक (MLi-2) के बिना इलाज किया गया, तो lysed और निकट अवरक्त (एनआईआर) फ्लोरेसेंस इमेजिंग के माध्यम से संकेत एंटीबॉडी के साथ मात्रात्मक इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के अधीन । (ग)न्यूट्रोफिल को दो स्वस्थ दानदाताओं से अलग-थलग कर दिया गया और 30 मिन के लिए 100 एनएम एमली-2 के साथ इलाज किया गया। ए और बी मीर एट अल15से संशोधित किया गया है, जबकि सी प्रशंसक एट अल11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पार्किंसंस रोग के रोगियों में LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि में वृद्धि एक विषमता VPS35 D620N उत्परिवर्तन शरण । न्यूट्रोफिल नौ गैर आयु मिलान स्वस्थ नियंत्रण और एक बीमारी के कारण विषमता एंवी35 D620N उत्परिवर्तन के साथ तीन पीडी रोगियों से अलग थे । कोशिकाओं के साथ या 200 एनएम MLi-2 के बिना 30 00 के लिए सेल lysis से पहले इलाज किया गया। (क)कुल 10 माइक्रोन ऑफ पूरे सेल निकालने के पास अवरक्त (एनआईआर) फ्लोरेसेंस इमेजिंग के माध्यम से संकेतित एंटीबॉडी के साथ मात्रात्मक इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के अधीन । इम्यूनोलॉट्स को फॉस्फो-थ्र73 राब10:कुल राब10 अनुपात(बी)के लिए निर्धारित किया गया था । ट्यूबी के कई तुलना परीक्षण के साथ डेटा का विश्लेषण एक तरह से ANOVA द्वारा किया गया था । साधन ± एसडी के रूप में प्रस्तुत डेटा; पी एंड एलटी; 0.0001। इस आंकड़े को मीर एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सम्मोहक नैदानिक, आनुवंशिक, और जैव रासायनिक सबूत LRRK2 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका की ओर इशारा करते है और विशेष रूप से पार्किंसंस रोग7में अपने kinase समारोह । LRRK2 kinase अवरोधक विकसित किया गया है और2,4,12नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश कर रहे हैं . इस प्रकार लक्ष्य सगाई के साथ-साथ रोगी स्तरीकरण के लिए बायोमार्कर के रूप में LRRK2 का शोषण करने की आवश्यकता है । हमारा प्रोटोकॉल मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल11,14के समरूप पूल में अपने शारीरिक सब्सट्रेट राब10 के फॉस्फोरिलाइजेशन से परिलक्षित होने के अनुसार LRRK2 kinase मार्ग सक्रियण का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत और आसान परख का वर्णन करता है । मात्रात्मक इम्यूनोब्लास्टिंग द्वारा विश्लेषण के लिए, हम एक अत्यधिक चयनात्मक फॉस्फोस्पेसर रा10 एंटीबॉडी (एमजेएफएफ-pRab10 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी)14,,17के उपयोग की दृढ़ता से सलाह देते हैं।

हम मानव न्यूट्रोफिल का उपयोग करते हैं क्योंकि वे परिधीय रक्त कोशिकाओं का एक समरूप सबसेट बनते हैं जो प्रमुख ल्यूकोसाइट आबादी17,18बनाते हैं । इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि न्यूट्रोफिल में LRRK2 और इसके सबस्टेट राब10(चित्रा 1)16का उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर भी होता है। इसके विपरीत, पीबीएमसी के पूल को बनाने वाले ल्यूकोसाइट्स के शेष सबसेट लर्र्क 2 और राब10 की चर और मुख्य रूप से कम अभिव्यक्ति के साथ विषम हैं। मोनोसाइट्स और डेंड्रिटिक कोशिकाओं में उच्च अभिव्यक्ति का स्तर होता है, लेकिन कुल मिलाकरबहुतायत 16में कम होते हैं।

जबकि हम EDTA vacutainer रक्त संग्रह ट्यूबों के उपयोग की सलाह देते हैं, EDTA के अलावा एक एंटीकोगुलेंट का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, न्यूट्रोफिल आइसोलेशन किट के प्रदर्शन के लिए ईटीए की उपस्थिति महत्वपूर्ण है। इसलिए हम पूरे रक्त नमूने में EDTA जोड़ने की सलाह देते हैं ताकि वैकल्पिक एंटीकोगुलेंट का उपयोग किए जाने पर भी 1 एमएम ईटीए की अंतिम एकाग्रता तक पहुंच सके। न्यूट्रोफिल आइसोलेशन किट का उपयोग अपेक्षाकृत तेज और आसान तरीके से इम्यूनोमैग्नेटिक नकारात्मक चयन द्वारा मानव पूरे रक्त से सीधे न्यूट्रोफिल को शुद्ध करने की अनुमति देता है। उपलब्ध मैग्नेट की संख्या निर्धारित करता है कि कितने रक्त नमूनों को समानांतर रूप से संसाधित किया जा सकता है। छह मैग्नेट का उपयोग करके समानांतर में छह रक्त नमूनों से न्यूट्रोफिल को अलग करना आसानी से संभव है। एक संभावित खामी वाणिज्यिक न्यूट्रोफिल आइसोलेशन किट और आवश्यक चुंबक के लिए संबद्ध लागत है। पूरे रक्त से न्यूट्रोफिल अलगाव के लिए वैकल्पिक तरीकों का वर्णन किया गया है और घनत्व ढाल जुदाई या फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS), जो महत्वपूर्ण कमियां है पर भरोसा करते हैं । पूर्व काफी अधिक समय और श्रम गहन है और कम से कम हमारे हाथों में विश्वसनीय और कुशल के रूप में नहीं है । बाद में एक FACS मशीन की आवश्यकता है और अतिरिक्त हैंडलिंग कदम लाल रक्त कोशिकाओं और सेल धुंधला की कमी सहित शुरू करने की आवश्यकता होगी, सेल अलगाव की प्रक्रिया के लिए समय जोड़ने । कुल मिलाकर, इम्यूनोमैग्नेटिक अलगाव तेज है, एक अत्यधिक शुद्ध नमूना उत्पन्न करता है, और कोशिकाओं की अत्यधिक हैंडलिंग से बचा जाता है। नमूना प्रसंस्करण के संबंध में, हमने पहले दिखाया है कि रक्त संग्रह और न्यूट्रोफिल अलगाव के बीच कम से कम 24 घंटे तक की देरी के परिणामस्वरूप हमारी परख के परिणाम में महत्वपूर्ण परिवर्तन या भिन्नता नहीं होती है, जो भविष्य के नैदानिक शोषण11के लिए लचीलापन प्रदान करता है।

न्यूट्रोफिल आइसोलेशन प्रक्रिया ही बहुत आसान है। हम प्रत्येक उपयोग से पहले चुंबकीय मोतियों को भंवर करने की सलाह देते हैं। चुंबकीय मोतियों की अशांति और विरूपण से बचने के लिए चुंबक के अंदर होने के बाद चुंबक को परेशान न करना भी महत्वपूर्ण है। सभी अवांछित कोशिकाओं को इम्यूनोमैग्नेटिक हटाने के कई दौर ों से न्यूट्रीफिल को निलंबन में समृद्ध किया जा रहा है । ध्यान रखा जाना चाहिए कि ट्यूब के किनारे है कि चुंबक के साथ संपर्क में है और अलगाव के पहले दौर के दौरान छूने के लिए नहीं (कदम २.११) ताकि ट्यूब के तल पर लाल रक्त कोशिकाओं को बेफिक्र नहीं है । समृद्ध सेल निलंबन को एक नई शंकुई ट्यूब (चरण 2.24) में पाइपिंग करने के अंतिम दौर के बाद, न्यूट्रोफिल आगे की प्रसंस्करण के लिए तुरंत उपलब्ध हैं। यदि कोशिकाओं में LRRK2 गतिविधि का आकलन करने के लिए न्यूट्रोफिल का उपयोग किया जाता है, तो न्यूट्रोफिल को दो बैचों में विभाजित किया जाता है और अपकेंद्री द्वारा पेलेटिंग के बाद, या तो एक LRRK2 kinase अवरोधक (यहां, MLi-2) या सेल संस्कृति माध्यम युक्त DMSO में फिर से निलंबित कर दिया जाता है । चूंकि LRRK2 kinase अवरोध की अनुपस्थिति में उपस्थिति और rephosphorylation में dephosphorylation अपेक्षाकृत तेजी से घटनाओं रहे हैं, देखभाल के लिए सुनिश्चित करें कि MLi-2 इलाज न्यूट्रोफिल अंश एक LRRK2 kinase अवरोधक (जैसे, MLi-2) के संपर्क में रहता है की जरूरत है सेल लिसिस तक (चरण 3.8-3.10)।

15 और 50 एमएल शंकुट्यूब का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल में कई केंद्रीकरण चरण हैं। जबकि हम नियमित रूप से प्रोटोकॉल में संकेतित केंद्रीकरण गति का उपयोग करते हैं, कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित किए बिना केंद्रीकरण की गति को 400 x ग्राम तक बढ़ाना संभव है। इसके परिणामस्वरूप थोड़ा मजबूत न्यूट्रोफिल सेल पैलेट होता है जो इस प्रोटोकॉल के दौरान अलौकिक चरणों को डिकेंट करने और पाइपकरने के दौरान न्यूट्रोफिल सामग्री के किसी भी संभावित नुकसान को कम करने में मदद कर सकता है। इससे प्राप्त कुल प्रोटीन के मामले में उपज में वृद्धि होने की संभावना होगी। एक संभावित चिंता यह है कि एक उच्च केंद्रीकरण बल न्यूट्रोफिल को सक्रिय कर सकता है और संभावित रूप से बाद के विश्लेषण को प्रभावित करता है। हमारी सामान्य सिफारिश प्रोटोकॉल के हर कदम के दौरान न्यूट्रोफिल को धीरे से संभालना है।

हमारा प्रोटोकॉल न्यूट्रोफिल लिसिस बफर के हिस्से के रूप में अत्यधिक शक्तिशाली सेरीन प्रोटीज़ अवरोधक डीआईएफपी (0.5 mM) का उपयोग करता है। DIFP एक शक्तिशाली ऑर्गेनोफॉस्फोरस न्यूरोटॉक्सिन है, और जब हमने वैकल्पिक यौगिकों की जांच की है, तो इम्यूनोलोटिंग द्वारा मानव न्यूट्रोफिल में LRRK2-नियंत्रित राब10 फास्फोरिलाइजेशन के विश्लेषण के लिए लिसिस बफर के अलावा आवश्यक था। उदाहरण के लिए, DIFP की जगह 1% (w/v) एसडीएस का उपयोग अन्य अध्ययनों19 में न्यूट्रोफिल को लाइज़ करने के लिए किया गया है और इस हद तक महत्वपूर्ण प्रोटीन क्षरण का कारण बना है कि LRRK2, Rab10 के लिए इम्यूनोब्लास्टिंग, और यहां तक कि GAPDH लोडिंग नियंत्रण एक संकेत पैदा नहीं हुआ, इस प्रकार lysis बफर(FigureC 2C)में एक अत्यधिक शक्तिशाली प्रोटीज़ अवरोधक सहित के महत्व पर प्रकाश डाला । जब कम शक्तिशाली के साथ DIFP की जगह है, लेकिन यह भी कम विषाक्त सेरीन प्रोटीज़ अवरोधक PMSF २.५ m पर, Rab10 फॉस्पोरिलेशन अच्छी तरह से संरक्षित किया गया था, लेकिन बड़ा LRRK2 प्रोटीन महत्वपूर्ण गिरावट से गुजरना(चित्रा 2 C)। डीआईएफपी स्टॉक सॉल्यूशन की हैंडलिंग को कम करने के लिए, लिसिस बफर युक्त डीआईएफपी को बैचों में तैयार किया जा सकता है, जिसे 20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस11पर संग्रहीत किया जा सकता है। मात्रात्मक इम्यूनोब्लास्टिंग द्वारा विश्लेषण के संबंध में, फॉस्फोस्पेस एंटीबॉडी का उपयोग करना सर्वोपरि है जिसे केवल एक LRRK2 फॉस्फोरोरीटेड राब प्रोटीन के लिए चयनात्मक होने का प्रदर्शन किया गया है, जैसे कि एमजेएफएफ-pRab10 एंटीबॉडी जिसका उपयोग हमारे अध्ययन14के लिए किया जाता है।

प्रोटोकॉल को 25 मिलील तक के पूरे रक्त की अधिकतम मात्रा का उपयोग करके भी बढ़ाया जा सकता है, जो एक चुंबक का उपयोग करके एक अलगाव प्रक्रिया में संसाधित की जा सकती है, जो 50 मिलील शंकुधारी ट्यूबों को पकड़ने में सक्षम है। केवल कदम है कि समायोजन की आवश्यकता होगी कदम २.४ (रक्त के प्रति mL प्रति अलगाव कॉकटेल के ५० μL जोड़ने), कदम २.६ और २.१२ (रक्त के प्रति मिलीचुंबकीय मोतियों के ५० μL जोड़ने), और चरण ३.१२ में न्यूट्रोफिल lysis के लिए lysis बफर की मात्रा में आनुपातिक वृद्धि कर रहे हैं । अन्य सभी चरणों को समान रखा जा सकता है।

संक्षेप में, हमारा प्रोटोकॉल पेरिफेरल रक्त से मानव न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए एक आसान और मजबूत विधि का वर्णन करता है। इसके बाद न्यूट्रोफिल ्स को एक शक्तिशाली और विशिष्ट LRRK2 kinase अवरोधक के साथ और बिना इलाज किया जा सकता है ताकि वीवो में राब10 के LRRK2-नियंत्रित फॉस्फोरिलाइजेशन की मात्रा को सक्षम किया जा सके। यह LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि के अनुसार व्यक्तियों को स्तरित करने और मार्ग हाइपरएक्टिवेशन के साथ उन लोगों की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है जो भविष्य LRRK2 kinase अवरोधक उपचार से लाभ ान्वित हो सकते हैं। हालांकि यह पीडी, विशेष रूप से ईडिओथिक पीडी के साथ लोगों के बहुमत के लिए मामला की संभावना नहीं होगी, हमारी परख पहले से ही सफलतापूर्वक एक और पीडी से जुड़े जीन, VPS35 D620N, जहां LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि में एक अभी तक अज्ञात तंत्र15द्वारा वृद्धि हुई है में एक दुर्लभ, विषमता रूपांतरण ले जाने व्यक्तियों में तैनात किया गया है । हमने पहले LRRK2-नियंत्रित रब 10 फॉस्फोरिलेशन स्तरों की जांच की थी, जो अधिक आम LRRK2 G2019S उत्परिवर्तन को ले जाने वाले व्यक्तियों की एक छोटी संख्या में है जो LRRK2 kinase गतिविधि को सक्रिय करने के लिए जाना जाता है, जो हमारे परख11,,14के साथ इडिओपैथिक पीडी के नियंत्रण और रोगियों की तुलना में एक महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाए बिना लगभग दो के कारक द्वारा केवल विनय से जाना जाता है। यह और आगे अप्रकाशित डेटा से पता चलता है कि LRRK2 kinase गतिविधि शायद मात्रात्मक इम्यूनोलॉटिंग का उपयोग करके एक महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए >3x की वृद्धि की आवश्यकता होती है। हालांकि, LRRK2 kinase मार्ग सक्रियण का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता की संभावना बढ़ सकती है अगर राज्य के अत्याधुनिक जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रौद्योगिकी की तैनाती ।

हमारा सुझाव है कि न्यूट्रोफिल LRRK2 kinase मार्ग गतिविधि में पार्किंसंस रोग अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन है और उन व्यक्तियों की पहचान करने में मदद कर सकता है जो भविष्य LRRK2 kinase अवरोधक उपचार से लाभान्वित हो सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उन स्वस्थ स्वयंसेवकों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने वर्तमान अध्ययन के लिए कृपया रक्तदान किया । हम माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन के लिए पार्किंसंस रिसर्च (MJFF) और फॉक्स बायोनेट स्टडी लीडरशिप (FBN) को लिखित प्रोटोकॉल और वीडियो के प्रति उनके समर्थन और इनपुट के लिए धन्यवाद देते हैं । हम अपने प्रोटोकॉल और सहयोग का परीक्षण करने के लिए ऑस्ट्रिया में वियना विश्वविद्यालय से प्रोफेसर अलेक्जेंडर Zimprich शुक्रिया अदा करते हैं । हम परियोजना (एमआरसी पीपीयू के महाप्रबंधक) के लिए पॉल डेविस के योगदान को महत्व देते हैं। हम एमआरसी प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन एंड यूबीक्विटिलेशन यूनिट (पीपीयू) नामत केमिकल संश्लेषण (MLi-2 के संश्लेषण के लिए नतालिया शापिरो), एमआरसी पीपीयू रिएजेंट्स एंड सर्विसेज एंटीबॉडी शुद्धिकरण टीमों (द्वारा समन्वित) के उत्कृष्ट तकनीकी सहायता को भी पहचानते हैं हिलेरी मैकलौचलन और जेम्स हैटाई) । हम वीडियो और एनिमेशन बनाने के साथ उनकी मदद के लिए विवोमोशन से म्हैरी टोलर और फ्रेजर मर्डोक का शुक्रिया अदा करते हैं । हम अंतिम संपादन के साथ सहायता के लिए ८१ फिल्मों से स्टीव Soave शुक्रिया अदा करते हैं । एस्तेर Sammler एक स्कॉटिश वरिष्ठ नैदानिक अकादमिक फैलोशिप द्वारा समर्थित है और पार्किंसंस ब्रिटेन (कश्मीर-१७०६) से धन प्राप्त हुआ है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Pipette tips Sarstedt 70.762 or equivalent
1.5 mL Micro tubes Sarstedt 72.690.001 or equivalent
10 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1254.025  or equivalent
10 μL Pipette tips Sarstedt 70.113 or equivalent
15 mL falcon tube  Cellstar 188 271 or equivalent
200 μL Pipette tips Sarstedt 70.760.002 or equivalent
25 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1685.001 or equivalent
50 mL falcon tube  Cellstar 227 261 or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube BD  BD 367525 or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge Beckman or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)  Sigma D0879 Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions 
Dimethyl sulfoxide  Sigma 6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline  ThermoFisher 14190094 or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet  Stemcell 18002 for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit  Stemcell 19666 This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA Sigma E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)  Sigma 278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).  alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) Merck 438194-10MG or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR Enzo Life Sciences ALX-350-012-M001 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. 
Na3VO4 Aldrich 450243
NaF Sigma S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium  ThermoFisher 21875034 or equivalent
sodium pyrophosphate Sigma S22
sucrose Sigma S0389
β-glycerophosphate Sigma 50020
β-mercaptoethanol Sigma M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] abcam ab230261
Anti-α-tubulin Cell Signaling Technologies 5174 used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT LI-COR 926-68020 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW LI-COR 926-32210 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW LI-COR 926-32211 used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody generated by nanoTools (nanotools.de) not applicable* used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody Antibodies Incorporated  75-253 used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2 MRC PPU Reagents and Services UDD2 used at 1 μg/ml final concentration

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References

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रै10 फॉस्फोरिलेशन का आकलन करके पार्किंसंस के एसोसिएटेड LRRK2 Kinase पाथवे से पूछताछ के लिए मानव परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल अलगाव
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Fan, Y., Tonelli, F., Padmanabhan,… More

Fan, Y., Tonelli, F., Padmanabhan, S., Baptista, M. A. S., Riley, L., Smith, D., Marras, C., Howden, A., Alessi, D. R., Sammler, E. Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation. J. Vis. Exp. (157), e58956, doi:10.3791/58956 (2020).

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