Summary
Mutaties in het leucine rijke reinase 2 gen (LRRK2) veroorzaken erfelijke de ziekte van Parkinson. We hebben een eenvoudige en robuuste methode ontwikkeld voor het beoordelen van LRRK2-gecontroleerde fosforylatie van Rab10 bij menselijke perifere bloedneutrofielen. Dit kan helpen bij het identificeren van personen met een verhoogde LRRK2 kinase traject activiteit.
Abstract
De leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is het meest gemuteerde gen bij erfelijke Parkinson' ziekte (PD) en alle pathogene LRRK2 mutaties resulteren in hyperactivatie van de kinase functie. Hier beschrijven we een eenvoudige en robuuste test om LRRK2 kinase route activiteit in menselijke perifere bloed neutrofielen kwantificeren door het meten van LRRK2-gecontroleerde fosforylatie van een van de fysiologische substraten, Rab10 op threonine 73. De beschreven immunoblotting analyse vereist een volledig selectief en fosfospecifiek antilichaam dat de Rab10 Thr73 epitoop fosforylaat door LRRK2 herkent, zoals de MJFF-pRab10 konijn monoklonale antilichaam. Het maakt gebruik van menselijke perifere bloed neutrofielen, omdat perifere bloed is gemakkelijk toegankelijk en neutrofielen zijn een overvloedige en homogene bestanddeel. Belangrijk is dat neutrofielen relatief hoge niveaus van zowel LRRK2 als Rab10 uitdrukken. Een potentieel nadeel van neutrofielen is hun hoge intrinsieke serine protease activiteit, die het gebruik van zeer krachtige proteaseremmers zoals de organofosfor neurotoxine diisopropylfluorosafosfaat (DIFP) als onderdeel van de lysisbuffer vereist. Niettemin zijn neutrofielen een waardevolle bron voor onderzoek naar lrrk2 kinase-padactiviteit in vivo en moeten ze in aanmerking komen voor opname in PD-biorepository-collecties.
Introduction
Pogingen om de ziekte van Parkinson (PD) te vertragen of te stoppen zijn tot nu toe mislukt. De ontdekking van hyperactiverende mutaties in de leucine rijke reinase 2 (LRRK2) die het risico voor PD veroorzaken en/of verhogen heeft geleid tot de ontwikkeling van LRRK2 kinase remmers1,2,3. Deze zijn nu opgenomen in klinische proeven4. De exacte functie van LRRK2 is onduidelijk, maar een belangrijke vooruitgang is de identificatie van een subset van Rab GTPase eiwitten, waaronder Rab10, als de eerste bonafide fysiologische substraten van de LRRK2 kinase5,6,7. Belangrijke uitdagingen in het tijdperk van ziekte-modificerende therapieën zijn biochemische markers van LRRK2 kinase activeringsstatus en doelbetrokkenheid van LRRK2 kinase remmers.
Tot nu toe was de belangrijkste farmacokinetische marker voor LRRK2-remmers in vivo een cluster van constitutieve fosforyllated serineresiduen van LRRK2, met name serine 935, die ontsmet raken in reactie op diverse LRRK2-remmers8,9. Serine 935 fosforylatie correleert echter niet met intrinsieke cellulaire LRRK2 kinaseactiviteit omdat het niet direct fosforylaat is door LRRK2 en nog steeds fosforylaat is in kinase-inactieve LRRK210. LRRK2 kinase activiteit correleert goed met autofoostie van serine 1292, maar het is in de praktijk geen geschikte uitlezing voor endogene LRRK2 kinase activiteit door immunoblot analyse van hele cel extracten als gevolg van het huidige gebrek aan betrouwbare en fosforspecifieke antilichamen voor deze site10,11.
We hebben een robuuste en eenvoudige test ontwikkeld om lrrk2 kinase-padactiviteit te kwantificeren in menselijke perifere bloedcellen die lrrk2-gecontroleerde fosforylatie van zijn fysiologische doeleiwit Rab10 bij threonine 7311meet. Perifeer bloed is gemakkelijk toegankelijk door geslachtsdeel, dat is een laag risico en snelle procedure die minimaal ongemak veroorzaakt. We richten ons op menselijke perifere bloedneutrofielen omdat ze een overvloedige (37-80% van alle witte bloedcellen) en homogene celpopulatie die relatief hoge niveaus van zowel LRRK2 en Rab1011uitdrukt . Bovendien kunnen perifere bloedneutrofielen snel en efficiënt worden geïsoleerd door gebruik te maken van een immunomagnetische negatieve benadering. Om ervoor te zorgen dat de daaropvolgende waargenomen Rab10-fosforylatie wordt bemiddeld door LRRK2, wordt elke partij neutrofielen geïncubeerd met of zonder een krachtige en selectieve LRRK2 kinase-remmer (we gebruiken en aanbevelen MLi-2)2,12. Dit wordt gevolgd door cellyse in een buffer met de proteaseremmer diisopropylfluorosafosfaat (DIFP), wat nodig is voor het onderdrukken van de intrinsieke serine protease activiteit waarvan bekend is dat hoog bij neutrofielen13. Voor de uiteindelijke analyse door kwantitatieve immunoblotting raden we aan om het MJFF-pRab10 konijn monoklonale antilichaam te gebruiken dat specifiek de Rab10 Thr73-phosphoepitope detecteert en niet cross-react met andere fosforylated Rab eiwitten14. Selectiviteit en specificiteit van dit antilichaam is gevalideerd in overexpressiemodellen van verschillende Rab-eiwitten en een A549 Rab10 knock-out cellijn14. Zo meten we het verschil in Rab10 fosforylatie in neutrofiele lysaten die zijn behandeld met en zonder een krachtige en selectieve LRRK2 kinase remmer2. Als alternatief kunnen monsters ook worden geanalyseerd met andere methoden, zoals kwantitatieve massaspectrometrie.
Tot slot, LRRK2-gecontroleerde Rab10 fosforylatie is een superieure marker van LRRK2 kinase activiteit op LRRK2 fosforylatie op serine 935 en menselijke perifere bloed neutrofielen zijn een waardevolle bron voor PD onderzoek naar LRRK2. Ons protocol biedt een robuuste en eenvoudige test om LRRK2 trajectactiviteit te ondervragen in perifere bloedneutrofielen en maakt biochemische gelaagdheid mogelijk van personen met verhoogde LRRK2 kinase activiteit15. Belangrijk is dat dergelijke personen kunnen profiteren van toekomstige LRRK2 kinase remmer behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volgens de lokale Britse regelgeving worden alle manipulaties en pipettering van menselijk bloed uitgevoerd in een biologische veiligheidskast van categorie 2. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale ethische beoordelingscommissie en alle deelnemers hebben geïnformeerde toestemming gegeven.
1. Voorbereiding
- Bereid 0,1 mL EDTA Stock Solution 1 voor met 100 mM EDTA in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Bereid 60 mL EDTA Stock Solution 2 voor met 1 mM EDTA in PBS.
- Bereid een lysisbuffer voor met 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerofosfaat, 5 mM natriumpyrofosfaat, 0,27 M sacharose, 0,1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x proteaserremmende cocktail, 1 μg/mL microcystin-LR en 0,5 mM diisopropylfluorfosfaat (DIFP).
OPMERKING: De auteurs gebruiken routinematig een EDTA-vrij product, maar een EDTA-bevattende proteaseremmercocktail zou ook moeten werken. De lysisbuffer kan vooraf worden gemaakt zonder de β-mercapto-ethanol, proteaseremmers, microcystin-LR en DIFP, en opgeslagen bij 4 °C tot gebruik. Zorg ervoor dat de β-mercapto-ethanol, proteaseremmers, microcystin-LR en DIFP pas vlak voor gebruik worden toegevoegd.
LET: DIFP is giftig en moet met zorg worden behandeld in een rookkap na lokale beoordeling van het risico op gezondheids- en veiligheid. DIFP kan worden toegevoegd aan de lysisbuffer en onmiddellijk worden gebruikt. Als alternatief kan de volledige lysisbuffer met alle andere componenten, waaronder DIFP, worden bij -80 °C worden opgeslagen en gedurende ten minste 4 weken worden opgeslagen.
2. Neutrofiele isolatie van volbloed
- Verzamel 10 mL bloed in een bloedafnamebuis. Meng voorzichtig door het omkeren van buizen 7−8x.
- Breng 10 mL bloed over in een conische buis van 50 mL.
- Voeg 100 μL EDTA Stock Solution 1 toe aan het bloed. Meng voorzichtig.
- Voeg 500 μL van de isolatiecocktail (50 μL/mL) van de neutrofiele isolatiekit(Table of Materials)toe aan het bloedbloedmonster.
- Vortex de magnetische kralen uit de neutrofiele isolatie kit voor 30 s voor gebruik om de zeer fijne magnetische kralen opnieuw op te schorten.
- Voeg 500 μL van de magnetische kralen toe aan het bloedmonster en meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren.
- Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min.
- Vul de buis tot 50 mL met EDTA Stock Solution 2. Meng door heel voorzichtig op en neer te ponsen 2-3x.
- Plaats de buis in de magneet en verwijder het deksel om latere agitatie van de buis te voorkomen.
- Incubatie voor 10 min bij RT.
- Pipetteer de verrijkte celsuspensie die de neutrofielen bevat zorgvuldig in een nieuwe conische buis van 50 mL.
LET OP: Raak de zijkant van de buis die in contact komt met de magneet niet aan en vermijd het verzamelen en verstoren van de rode bloedcellen aan de onderkant van de buis. Laat ongeveer 10 mL van de rode bloedcelsussie achter aan de onderkant van de buis. - Draai de magnetische kralen voor 30 s voor gebruik en voeg 0,5 mL van de magnetische kralen toe aan de buis met de verrijkte neutrofielen. Meng voorzichtig door de buis om te keren.
- Incubeer bij RT voor 5 min.
- Plaats de buis in de magneet en verwijder het deksel om latere agitatie te voorkomen.
- Incubeer bij RT voor 5 min.
- Pipetteer de verrijkte celsuspensie die de neutrofielen bevat zorgvuldig in een nieuwe conische buis van 50 mL.
LET OP: Raak de zijkant van de buis die in contact staat met de magneet niet aan. Laat ongeveer 5 mL van de suspensie aan de onderkant van de buis. - Om ervoor te zorgen dat magnetische kralen volledig uit het celmengsel worden verwijderd, plaatst u de buis met de verrijkte cellen in de magneet.
- Incubatie voor 10 min bij RT.
- Pipetteer de verrijkte celsuspensie die nu pure neutrofielen bevat zorgvuldig in een nieuwe conische buis van 50 mL.
LET OP: Raak de zijkant van de buis die in contact staat met de magneet niet aan. Laat ongeveer 5 mL van de suspensie aan de onderkant van de buis. - Meng de geïsoleerde cellen met 1 mM EDTA Stock Solution 2 tot een eindvolume van ongeveer 41 mL. Pipetteer op en neer om te mengen.
- Verdeel de oplossing gelijkmatig in twee buizen met ongeveer 20 mL in elke buis.
- Centrifugeer beide buizen op 335 x g gedurende 5 min.
- Neem tijdens deze centrifugatie MLi-2-remmervoorraad (200 μM/1.000x concentratie) uit de -80 °C-vriezer en laat bij RT achter voor later gebruik.
- Onmiddellijk na de centrifugatie stap en zonder agitatie van de buizen, giet de supernatant zonder verstoring van de neutrofiele pellets. Resuspend elke cel pellet in 10 mL van celcultuur media (Tabel van materialen)bij RT door voorzichtig pipetteren cellen op en neer 4x.
3. LRRK2 kinase-remmerbehandeling van zuivere neutrofielen
- Label een buis "DMSO" en de andere buis "MLi-2".
- Voeg 10 μL DMSO toe aan de "DMSO" gelabelde buis en meng voorzichtig door 2x op en neer te paien met een pipet van 10 mL. Voeg aan de "MLi-2" gelabelde buis 10 μL van 200 μM MLi-2 voorraadoplossing (eindconcentratie 200 nM) toe en meng voorzichtig door 2x op en neer te paien met een 10 mL pipet.
- Incubeer de monsters gedurende 30 min bij RT. Meng voorzichtig door inversie om de 10 min tijdens de incubatie.
- Verwijder tijdens de incubatietijd 0,5 M DIFP-voorraad uit de vrieskist van -80 °C en plaats in een rookkap op ijs. Verwijder 1 mg/mL microcystin-LR voorraadoplossing uit de -80 °C vriezer en laat bij RT ontdooien. Neem een aliquot (0,25 mL) van de lysisbuffer uit de vriezer, laat het ontdooien bij RT en plaats deze vervolgens op ijs voor later gebruik.
- Bereid 1 mL celkweekmedium voor dat 1 μL DMSO bevat en noem deze DMSO resuspension buffer. Bereid 1 mL RPMI-media voor die 1 μL van 200 μM MLi-2 bevatten en bel deze MLi-2 resuspension buffer.
- Centrifugeer beide buizen na de incubatietijd van 30 min op 335 x g gedurende 5 min.
- Gooi de supernatant in elke buis voorzichtig weg zonder de neutrofiele pellet te verstoren.
- Voor het dmso-gelabelde monster schort de pellet voorzichtig op in 1 mL van de DMSO-hersuspensiebuffer en voor de MLi-2 gelabelde buis, de pellet opnieuw in 1 mL van de MLi-2 resuspension buffer.
- Breng de geresuspendeerde celpellets over op overeenkomstige centrifugerende centrifugatiebuizen met het label "DMSO" en "MLi-2" en centrifugeer beide buizen op 335 x g gedurende 3 min.
- Bereid tijdens de centrifugatiestap de lysebuffer voor. Voeg in de rookkap voorzichtig 0,25 μL van 0,5 M DIFP-oplossing en 0,25 μL van 1 mg/mL microcystin-LR toe aan de 0,25 mL lysisbuffer. Meng en laat op ijs tot het gebruik.
OPMERKING: Voeg DIFP toe aan de lysisbuffer binnen 15 min cellyse, omdat DIFP relatief instabiel is in een waterige oplossing. - Onmiddellijk na de centrifugatie, zorgvuldig en volledig verwijderen van alle supernatant met een pipet zonder verstoring van de neutrofiele pellet en plaats de buizen op ijs.
- Voeg onmiddellijk 100 μL lysisbuffer met DIFP en microcystine-LR toe aan elke buis. Met behulp van een 100-200 μL pipet, resuspend de cel pellets door pipetteren op en neer ongeveer 5-10x.
- Lyse de cellen op ijs voor 10 min.
- Centrifugeer buizen op 20.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C om celafval te verwijderen.
- Breng de "DMSO" en "MLi-2" supernatants met de neutrofiele lysaten over in nieuwe centrifugatiebuizen. Gooi de puinpellet weg.
LET OP: De neutrofiele lysaten zijn nu klaar voor gebruik of kunnen worden vastgemaakt bevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij -80 °C voor toekomstige analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze test maakt het mogelijk het ondervragen van de activering van de PD-geassocieerde LRRK2 kinase in menselijke perifere bloed neutrofielen met LRRK2-afhankelijke Rab10 fosforylatie als een uitlezing. Neutrofielen zijn een homogene en overvloedige perifere witte bloedcellen populatie die hoge niveaus van zowel de LRRK2 en Rab10 eiwitten (Figuur 1) uitdrukt. De enige andere celpopulatie onder de resterende perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) met hoge kopieaantallen van beide eiwitten zijn monocyten, maar deze vormen slechts 2-12% van de witte bloedcellen. Dit geeft aan dat perifere bloedneutrofielen zijn een meer geschikte biomatrix voor het bestuderen van LRRK2-gecontroleerde Rab10 fosforylatie.
Bij het isoleren van perifere bloedneutrofielen vanaf 10 mL bloed met onze procedure werd tussen 0,5-0,75 mg totaal eiwitlysaat per donor verkregen (figuur 2A), wat voldoende is voor een aanzienlijk aantal immunoblotanalyse waarvoor slechts 10 μg per gellane vereist is. Terwijl de controle van de zuiverheid en levensvatbaarheid van cellen niet routinematig wordt uitgevoerd, we hebben voor drie gezonde donoren aangetoond dat de zuiverheid van geïsoleerde neutrofielen tussen 94-98% ligt en de levensvatbaarheid van cellen ~99% zoals bepaald door flow cytometrieanalyse met behulp van de CD66b−Fluorescein isothiocyanaat neutrofielmarker en 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI) vlekvoor levensvatbaarheid (Figuur 2A).
Terwijl de focus van deze publicatie is de isolatie en verwerking van neutrofielen uit perifere bloed en niet de analyse door kwantitatieve westerse blotting, Figuur 2B toont aan dat de MJFF-pRab10 monoklonale antilichaam dat specifiek Detecteert Rab10 fosforylated bij threonine 73 bleek robuuste signalen in de neutrofiele monsters, die duidelijk werden onderdrukt door behandeling met een krachtige en specifieke LRRK2 kinase remmer, in dit geval MLi-2.
Neutrofielen bevatten hoge niveaus van serine proteasen die de daaropvolgende westerse vlekanalyse kunnen beïnvloeden. Terwijl DIFP effectief onderdrukt de hoge protease activiteit bij neutrofielen, het is een krachtige organofosofostische neurotoxine en het zou wenselijk zijn om het te vervangen door een even effectieve, maar minder giftige proteaseremmer remmer, zoals fenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). We ontdekten dat Rab10 fosforylatie even goed bewaard bleef toen DIFP werd vervangen door PMSF bij een concentratie van 2,5 mM (Figuur 2C). De integriteit van het LRRK2-eiwit kwam echter in het gedrang bij het gebruik van PMSF in vergelijking met DIFP, wat suggereert dat het grotere LRRK2-eiwit gevoeliger is voor afbraak (figuur 2C).
We hebben eerder aangetoond dat een andere PD-veroorzakende genmutatie VPS35 D620N resulteert in hyperactivatie van de LRRK2 kinase door een nog onbekend mechanisme15. Neutrofielen van drie mensen met PD die een ziekteveroorzakende heterozygoot VPS35 D620N-mutatie herbergen, werden geïsoleerd met behulp van de in dit artikel beschreven methode (Figuur 3). Neutrophil monsters van negen gezonde donoren werden geïsoleerd als controles15. Immunoblot analyse met behulp van de MJFF-pRab10 monoklonale antilichaam toont een significante, ~ 3x toename van Rab10 fosforylatie op Thr 73 bij neutrofielen van Parkinson patiënten met een VPS35 D620N mutatie in vergelijking met de controles. De totale Rab10 eiwitexpressie is vergelijkbaar in alle 12 neutrofiele monsters.
Figuur 1: Overvloed aan LRRK2- en Rab10-eiwitten in immuuncellen geïsoleerd uit menselijk bloed met behulp van gegevens die openbaar beschikbaar zijn in de immprot-database (http://www.immprot.org)16. De grafiek toont het aantal eiwitkopieën per cel voor LRRK2 en Rab10 in een reeks perifere bloedcellen, waaronder subgroepen van T-cellen, B-cellen, monocyten, NK-cellen, dendritische cellen en de granulocyten neutrofielen, basofielen en eosinofielen. Dit cijfer is gewijzigd van Fan et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering en analyse van menselijke perifere bloedneutrofielen en het belang van DIFP voor de preventie van proteolytische afbraak bij neutrofielen. (A) Neutrofielen werden geïsoleerd uit het hele bloed van drie gezonde donoren (A, B en C) met zuiverheid, levensvatbaarheid en totale eiwitopbrengst na cellyse. (B) Neutrofielen werden behandeld met of zonder LRRK2 kinaserende remmer (MLi-2), vervolgens lysed en onderworpen aan kwantitatieve immunoblot analyse met de aangegeven antilichamen via nabij-infrarood (NIR) fluorescentie beeldvorming. (C) Neutrofielen werden geïsoleerd van twee gezonde donoren en behandeld met 100 nM MLi-2 voor 30 min. Cellen werden lysed in aanwezigheid van 0,5 mM DIFP of 2,5 mM PMSF om serine protease activiteit bij neutrofielen te blokkeren. A en B zijn gewijzigd van Mir et al.15, terwijl C is gewijzigd van Fan et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Verhoogde LRRK2 kinase pathway activiteit bij de ziekte van Parkinson patiënten herbergen een heterozygeous VPS35 D620N mutatie. Neutrofielen werden geïsoleerd van negen niet-leeftijdsgematched gezonde controles en drie PD-patiënten met een ziekteverwekkende heterozygoot VPS35 D620N mutatie. De cellen werden behandeld met of zonder 200 nM MLi-2 gedurende 30 min voor cellyse. (A) Een totaal van 10 μg van hele cel extract onderworpen aan kwantitatieve immunoblot analyse met de aangegeven antilichamen via nabij-infrarood (NIR) fluorescentie beeldvorming. Immunoblots werden gekwantificeerd voor fosfo-Thr73 Rab10:total Rab10 ratio(B). Gegevens werden geanalyseerd door een-weg ANOVA met tukey's meervoudige vergelijkingstest. Gegevens gepresenteerd als middel ± SD; p < 0,0001. Dit cijfer is gewijzigd van Mir et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dwingend klinisch, genetisch en biochemisch bewijs wijst op een belangrijke rol voor LRRK2 en in het bijzonder de kinasefunctie bij de ziekte van Parkinson7. LRRK2 kinase remmers zijn ontwikkeld en zijn het invoeren van klinische proeven2,4,12. Als zodanig is er behoefte aan het exploiteren van LRRK2 als biomarker voor doelbetrokkenheid en patiëntgelaagdheid. Ons protocol beschrijft een robuuste en gemakkelijke test voor het analyseren van LRRK2 kinase pad activering zoals weerspiegeld door de fosforylatie van zijn fysiologische substraat Rab10 in de homogene pool van menselijke perifere bloed neutrofielen11,14. Voor analyse door kwantitatieve immunoblotting raden we ten zeerste het gebruik aan van een zeer selectief fosforspecifiek Rab10-antilichaam (MJFF-pRab10 monoklonale antilichaam)14,17.
We gebruiken menselijke neutrofielen omdat ze een homogene subset van perifere bloedcellen vormen die deel uitmaken van de dominante leukocytepopulatie17,18. Wat nog belangrijker is, neutrofielen hebben ook een hoog eiwit expressie niveaus van LRRK2 en de substaat Rab10 (Figuur 1)16. De resterende deelverzamelingen van leukocyten die deel uitmaken van de pool van PBMC's zijn daarentegen heterogeen met variabele en overwegend lage expressie van LRRK2 en Rab10. Monocyten en dendritische cellen hebben een hoog expressieniveau, maar zijn laag in de totale overvloed16.
Hoewel we het gebruik van EDTA vacutainer bloedafnamebuizen aanbevelen, kan een ander antistollingsmiddel dan EDTA worden gebruikt. De aanwezigheid van EDTA is echter belangrijk voor de prestaties van de neutrofiele isolatiekit. We raden daarom aan edta aan het volledige bloedmonster toe te voegen, zodat een eindconcentratie van 1 mM EDTA wordt bereikt, zelfs als een alternatief antistollingsmiddel wordt gebruikt. Het gebruik van de neutrofiele isolatiekit maakt het mogelijk neutrofielen rechtstreeks uit menselijk volbloed te zuiveren door immunomagnetische negatieve selectie op een relatief snelle en gemakkelijke manier. Het aantal beschikbare magneten bepaalt hoeveel bloedmonsters parallel kunnen worden verwerkt. Het is gemakkelijk haalbaar om neutrofielen te isoleren van maximaal zes bloedmonsters parallel met behulp van zes magneten. Een potentieel nadeel is de bijbehorende kosten voor commerciële neutrofiele isolatie kits en de vereiste magneet. Alternatieve methoden voor neutrofiele isolatie van volbloed zijn beschreven en vertrouwen op dichtheidgradiëntscheiding of fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), die belangrijke nadelen hebben. De eerste is aanzienlijk meer tijd en arbeidsintensief en in ieder geval in onze handen niet zo betrouwbaar en efficiënt. Dit laatste vereist een FACS-machine en er zouden extra behandelingsstappen moeten worden ingevoerd, waaronder de uitputting van rode bloedcellen en celvlekken, waardoor tijd wordt toegevoegd aan het celisolatieproces. Over het algemeen is immunomagnetische isolatie snel, genereert een zeer zuiver monster en vermijdt overmatig gebruik van de cellen. Met betrekking tot de verwerking van monsters hebben we eerder aangetoond dat een vertraging tussen bloedafname en neutrofiele isolatie van ten minste 24 uur niet leidt tot een significante verandering of variatie in de uitkomst van onze test, die flexibiliteit biedt voor toekomstige klinische exploitatie11.
De neutrofiele isolatieprocedure zelf is zeer eenvoudig. Wij raden aan om de magnetische kralen voor elk gebruik te vortexen. Het is ook belangrijk om de magneet niet te storen zodra de buis in de magneet zit om turbulentie en loste van de magnetische kralen te voorkomen. Neutrofielen worden verrijkt met suspensie door verschillende rondes van immunomagnetische verwijdering van alle ongewenste cellen. Zorg ervoor dat de zijkant van de buis die in contact staat met de magneet en tijdens de eerste isolatieronde (stap 2.11) niet wordt aangeraakt om de rode bloedcellen aan de onderkant van de buis niet te verstoren. Na de laatste ronde van het pipetteren van de verrijkte celvering in een nieuwe conische buis (stap 2.24), neutrofielen zijn onmiddellijk beschikbaar voor verdere verwerking. Als neutrofielen worden gebruikt om LRRK2-activiteit in cellen te beoordelen, worden neutrofielen vervolgens opgesplitst in twee partijen en na het pelleteren door centrifugeren, opnieuw opgehangen in een LRRK2 kinase-remmer (hier, MLi-2) of DMSO met celkweekmedium. Aangezien defosforylatie in aanwezigheid en refosforylatie bij afwezigheid van LRRK2 kinase-remming relatief snelle voorvallen zijn, moet ervoor worden gezorgd dat de met MLi-2 behandelde neutrofiele fractie blijft blootgesteld aan een LRRK2 kinase-remmer (bijvoorbeeld MLi-2) tot cellyse (stappen 3.8–3.10).
Er zijn verschillende centrifugatiestappen in dit protocol met 15 en 50 mL conische buizen. Hoewel we routinematig de aangegeven centrifugatiesnelheden in het protocol gebruiken, is het mogelijk om de centrifugatiesnelheid te verhogen tot 400 x g zonder de levensvatbaarheid van de cellen negatief te beïnvloeden. Dit resulteert in een iets steviger neutrofiele celpellet die kan helpen om elk potentieel verlies van neutrofiel materiaal tijdens het decanteren en pipetteren van de supernatant stappen tijdens dit protocol te verminderen. Dit zal waarschijnlijk de opbrengst verhogen in termen van totale eiwitlysaat verkregen. Een potentiële zorg is dat een hogere centrifugatiekracht neutrofielen kan activeren en mogelijk van invloed kan zijn op latere analyse. Onze algemene aanbeveling is om neutrofielen te behandelen tijdens elke stap van het protocol zo voorzichtig mogelijk.
Ons protocol maakt gebruik van de zeer krachtige serine proteaseremmer DIFP (0,5 mM) als onderdeel van de neutrofiele lysisbuffer. DIFP is een krachtig organofosforair neurotoxine, en terwijl we alternatieve verbindingen hebben onderzocht, was de toevoeging aan de lysisbuffer essentieel voor de analyse van lrrk2-gecontroleerde Rab10-fosforylatie bij menselijke neutrofielen door immunoblotting. Bijvoorbeeld, het vervangen van DIFP met 1% (w/v) SDS is gebruikt om neutrofielen lyse in andere studies19 en leidde tot significante eiwitafbraak in de mate dat immunoblotting voor LRRK2, Rab10, en zelfs de GAPDH laadcontrole geen signaal opleverde, waardoor het belang van het opnemen van een zeer krachtige proteaseremmer in de lysisbuffer (figuur 2C). Bij het vervangen van DIFP door de minder potente, maar ook minder giftige serine proteaseremmer PMSF op 2,5 mM, rab10 fosporylation werd goed bewaard gebleven, maar de grotere LRRK2 eiwit onderging aanzienlijke afbraak (Figuur 2C). Om de behandeling van de DIFP-voorraadoplossing tot een minimum te beperken, kan de lysisbuffer die DIFP bevat, worden bereid in batches, aliquoted en opgeslagen bij -20 °C of -80 °C11. Met betrekking tot de analyse door kwantitatieve immunoblotting is het van het grootste belang om een fosfospecifiek antilichaam te gebruiken waarvan is aangetoond dat het selectief is voor slechts één LRRK2 fosforylated Rab-eiwit, zoals het MJFF-pRab10-antilichaam dat voor onze studies wordt gebruikt14.
Het protocol kan ook worden opgeschaald met behulp van een maximaal volume van vol bloed van maximaal 25 mL, dat is de limiet die kan worden verwerkt in een isolatieprocedure met behulp van een magneet, die in staat is om 50 mL conische buizen te houden. De enige stappen die aanpassingen nodig zouden hebben zijn stap 2.4 (toevoeging van 50 μL isolatiecocktail per mL bloed), stappen 2.6 en 2.12 (toevoeging van 50 μL magnetische kralen per mL bloed), en een evenredige toename van het volume van lysisbuffer voor neutrofiele lyse in stap 3.12. Alle andere stappen kunnen identiek worden gehouden.
Samengevat, ons protocol beschrijft een eenvoudige en robuuste methode om menselijke neutrofielen te isoleren van perifeer bloed. Neutrofielen kunnen dan worden behandeld met en zonder een krachtige en specifieke LRRK2 kinaserremmer om de kwantificering van de LRRK2-gecontroleerde fosforylatie van Rab10 in vivo mogelijk te maken. Dit kan nuttig zijn voor het stratificeren van individuen volgens LRRK2 kinase traject activiteit en voor het identificeren van mensen met route hyperactivatie die kunnen profiteren van toekomstige LRRK2 kinase remmer behandeling. Hoewel dit onwaarschijnlijk zal zijn voor de meerderheid van de mensen met PD, met name idiopathische PD, is onze test al met succes ingezet bij personen die een zeldzame, heterozygoot mutatie in een ander PD-geassocieerd gen, VPS35 D620N, waar LRRK2 kinase route activiteit aanzienlijk wordt verhoogd door een nog onbekend mechanisme15. We hadden eerder onderzocht LRRK2-gecontroleerde Rab 10 fosforylatie niveaus in een klein aantal personen die de meer voorkomende LRRK2 G2019S mutatie waarvan bekend is dat lrrk2 kinase activiteit te activeren slechts bescheiden door een factor van ongeveer twee zonder het detecteren van een significant verschil in vergelijking met controles en patiënten met idiopathische PD met onze test11,14. Deze en verder ongepubliceerde gegevens suggereren dat LRRK2 kinase activiteit waarschijnlijk een toename van >3x vereist om een significant resultaat te leveren met behulp van kwantitatieve immunoblotting. Echter, de gevoeligheid voor het opsporen van LRRK2 kinase pad activering kan waarschijnlijk worden verhoogd als de inzet van state-of-the-art massaspectrometrie technologie.
Wij stellen voor dat neutrofielen zijn een waardevolle bron voor de ziekte van Parkinson onderzoek naar LRRK2 kinase traject activiteit en kan helpen bij het identificeren van personen die kunnen profiteren van toekomstige LRRK2 kinase remmer behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de gezonde vrijwilligers die vriendelijk bloed hebben gedoneerd voor de huidige studie. Wij danken The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research (MJFF) en de Fox BioNet studie leiderschap (FBN) voor hun steun en input voor het geschreven protocol en de video. Wij danken professor Alexander Zimprich van de Universiteit van Wenen in Oostenrijk voor het testen van ons protocol en samenwerking. Wij waarderen de bijdragen van Paul Davies aan het project (general manager van de MRC PPU). We erkennen ook de uitstekende technische ondersteuning van de MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit (PPU), namelijk Chemische Synthese (Natalia Shpiro voor de synthese van MLi-2), MRC PPU Reagentia en Services antilichaam zuiveringsteams (gecoördineerd door Hilary McLauchlan en James Hastie). Wij danken Mhairi Towler en Fraser Murdoch van Vivomotion voor hun hulp bij het maken van de video's en animaties. Wij danken Steve Soave uit 81 films voor hulp bij de laatste bewerkingen. Esther Sammler wordt ondersteund door een Scottish Senior Clinical Academic Fellowship en heeft financiering ontvangen van Parkinson's UK (K-1706).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
