Summary
Mutationen im Leucin-reichen Repeatkinase-2-Gen (LRRK2) verursachen eine erbliche Parkinson-Krankheit. Wir haben eine einfache und robuste Methode zur Beurteilung der LRRK2-kontrollierten Phosphorylierung von Rab10 bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen entwickelt. Dies kann helfen, Personen mit erhöhter LRRK2-Kinase-Signalweg-Aktivität zu identifizieren.
Abstract
Die leucinreiche Wiederholungskinase 2 (LRRK2) ist das am häufigsten mutierte Gen bei der erblichen Parkinson-Krankheit (PD) und alle pathogenen LRRK2-Mutationen führen zu einer Hyperaktivierung seiner Kinase-Funktion. Hier beschreiben wir einen einfachen und robusten Test zur Quantifizierung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen, indem wir die LRRK2-kontrollierte Phosphorylierung eines seiner physiologischen Substrate, Rab10 bei Threonin 73, messen. Die beschriebene Immunoblotting-Analyse erfordert einen vollständig selektiven und phosphospezifischen Antikörper, der das von LRRK2 phosphorylierte Rab10 Thr73-Epitop erkennt, wie z. B. den monoklonalen Antikörper MJFF-pRab10 Kaninchen. Es verwendet menschliche periphere Blutneutrophilen, weil peripheres Blut leicht zugänglich ist und Neutrophile ein reichlicher und homogener Bestandteil sind. Wichtig ist, dass Neutrophile relativ hohe Konzentrationen von LRRK2 und Rab10 ausdrücken. Ein potenzieller Nachteil von Neutrophilen ist ihre hohe intrinsische Serinproteaseaktivität, die die Verwendung sehr potenter Proteasehemmer wie dem Organophosphor-Neurotoxin Diisopropylfluorphosphat (DIFP) als Teil des Lysepuffers erfordert. Dennoch sind Neutrophile eine wertvolle Ressource für die Erforschung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität in vivo und sollten für die Aufnahme in PD-Biorepository-Sammlungen in Betracht gezogen werden.
Introduction
Versuche, die Parkinson-Krankheit (PD) zu verlangsamen oder zu stoppen, sind bisher gescheitert. Die Entdeckung hyperaktivierender Mutationen in der leucinreichen Repeatkinase 2 (LRRK2), die das Risiko für PD verursachen und/oder erhöhen, hat zur Entwicklung von LRRK2-Kinase-Inhibitoren1,2,3geführt. Diese sind nun in klinische Studien aufgenommen4. Die genaue Funktion von LRRK2 ist unklar, aber ein großer Fortschritt war die Identifizierung einer Teilmenge von Rab GTPase Proteinen, einschließlich Rab10, als die ersten gutgläubigen physiologischen Substrate der LRRK2 Kinase5,6,7. Die wichtigsten Herausforderungen im Zeiten der krankheitsmodifizierenden Therapeutika sind biochemische Marker des LRRK2-Kinase-Aktivierungsstatus und das gezielte Engagement von LRRK2-Kinase-Inhibitoren.
Bisher war der wichtigste pharmakokinetische Marker für LRRK2-Inhibitoren in vivo ein Cluster konstitutiv phosphorylierter Serinrückstände von LRRK2, insbesondere Serin 935, die als Reaktion auf verschiedene LRRK2-Inhibitoren8,9dephosphoryliert werden. Die serinfarbene 935-Phosphorylierung korreliert jedoch nicht mit der intrinsischen zellulären LRRK2-Kinase-Aktivität, da sie nicht direkt von LRRK2 phosphoryliert wird und immer noch in Kinase-inaktivem LRRK210phosphoryliert wird. Die LRRK2-Kinase-Aktivität korreliert gut mit der Autophosphorylierung des Serins 1292, ist aber praktisch keine geeignete Auslesung für die endogene LRRK2-Kinase-Aktivität durch Immunoblot-Analyse ganzer Zellextrakte aufgrund des aktuellen Mangels an zuverlässigen und phosphospezifischen Antikörpern für diese Stelle10,11.
Wir haben einen robusten und einfachen Test entwickelt, um die Aktivität des LRRK2-Kinase-Signalwegs in menschlichen peripheren Blutzellen zu quantifizieren, der die LRRK2-kontrollierte Phosphorylierung seines physiologischen Zielproteins Rab10 an Threonin 7311misst. Peripheres Blut ist leicht zugänglich durch Venesection, Das ist ein geringes Risiko und schnelle Verfahren, das minimale Beschwerden verursacht. Wir konzentrieren uns auf menschliche periphere Blutneutrophile, weil sie eine reichliche (37-80% aller weißen Blutkörperchen) und homogene Zellpopulation, die relativ hohe Konzentrationen von LRRK2 undRab11ausdrückt. Darüber hinaus können periphere Blutneutrophile schnell und effizient isoliert werden, indem ein immunmagnetischer negativer Ansatz verwendet wird. Um sicherzustellen, dass die anschließende beobachtete Rab10-Phosphorylierung durch LRRK2 vermittelt wird, wird jede Charge Neutrophilen mit oder ohne potenten und selektiven LRRK2-Kinase-Inhibitor inkubiert (wir verwenden und empfehlen MLi-2)2,12. Es folgt eine Zelllyse in einem Puffer, der den Protease-Inhibitor Diisopropylfluorphosphat (DIFP) enthält, der zur Unterdrückung der intrinsischen Serinproteaseaktivität notwendig ist, die bei Neutrophilen bekannt ist13. Für die abschließende Analyse durch quantitative Immunoblotting empfehlen wir die Verwendung des monoklonalen Antikörpers MJFF-pRab10 Kaninchen, der das Rab10 Thr73-Phosphoepitop spezifisch detektiert und nicht mit anderen phosphorylierten Rab-Proteinen14kreuzreagiert. Selektivität und Spezifität dieses Antikörpers wurden in Überexpressionsmodellen verschiedener Rab-Proteine und einer A549 Rab10-Knock-out-Zelllinie14validiert. So messen wir den Unterschied in der Rab10-Phosphorylierung in neutrophilen Lysaten, die mit und ohne einen potenten und selektiven LRRK2-Kinase-Inhibitor2behandelt wurden. Alternativ könnten Proben auch mit anderen Methoden, wie z. B. der quantitativen Massenspektrometrie, analysiert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die LRRK2-gesteuerte Rab10-Phosphorylierung ein überlegener Marker der LRRK2-Kinase-Aktivität zur LRRK2-Phosphorylierung bei Serin 935 und humanen peripheren Blutneutrophilen ist eine wertvolle Ressource für die PD-Forschung zu LRRK2. Unser Protokoll bietet einen robusten und einfachen Test zur Abhörung der LRRK2-Signalwegaktivität bei peripheren Blutneutrophilen und ermöglicht eine biochemische Schichtung von Personen mit erhöhter LRRK2-Kinaseaktivität15. Wichtig ist, dass solche Personen von der zukünftigen Behandlung von LRRK2-Kinase-Hemmern profitieren können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gemäß der lokalen britischen Verordnung werden alle Manipulationen und Pipettierungen von menschlichem Blut in einem biologischen Sicherheitsschrank der Kategorie 2 durchgeführt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem lokalen Ethik-Überprüfungsausschuss durchgeführt und alle Teilnehmer haben in Kenntnis der Sachlage ihre Zustimmung erteilt.
1. Vorbereitung
- Bereiten Sie 0,1 ml EDTA-Lagerlösung 1 mit 100 mM EDTA in phosphatgepufferter Saline (PBS) vor.
- Bereiten Sie 60 ml EDTA-Lagerlösung 2 mit 1 mM EDTA in PBS vor.
- Vorbereiten von Lysepuffermitenthalten mit 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM -Glyzerophosphat, 5 mM Natriumpyrophosphat, 0,27 M Saccharose, 0,1% (v/v) -Mercaptoethanol, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail, 1 g/ml Mikrocystin-LR und 0,5 mM Diisopropylfluorphosphat (DIFP).
HINWEIS: Die Autoren verwenden routinemäßig ein EDTA-freies Produkt, aber ein EDTA-haltiger Protease-Hemmer-Cocktail sollte auch funktionieren. Der Lysepuffer kann im Voraus ohne die Mercaptoethanol-, Proteasehemmer, Microcystin-LR und DIFP hergestellt und bis zur Anwendung bei 4 °C gelagert werden. Stellen Sie sicher, dass das Mercaptoethanol, die Proteasehemmer, Microcystin-LR und DIFP erst unmittelbar vor der Anwendung zugesetzt werden.
VORSICHT: DIFP ist toxisch und sollte nach der lokalen Bewertung des Gesundheits- und Sicherheitsrisikos mit Vorsicht in einer Dunstabzugshaube behandelt werden. DIFP kann dem Lysepuffer hinzugefügt und sofort verwendet werden. Alternativ kann der komplette Lysepuffer, der alle anderen Komponenten, einschließlich DIFP, enthält, für die spätere Verwendung mindestens 4 Wochen lang aliquoted und bei -80 °C gelagert werden.
2. Neutrophile Isolation aus Vollblut
- Sammeln Sie 10 ml Blut in ein Blutentnahmeröhrchen. Mischen Sie sanft, indem Sie Rohre 7 x 8x invertieren.
- 10 ml Blut in ein 50 ml konisches Rohr geben.
- Fügen Sie 100 L EDTA-Lagerlösung 1 ins Blut. Mischen Sie sanft.
- Fügen Sie der Blutprobe 500 l des Isolationscocktails (50 l/ml) aus dem Neutrophilen-Isolationskit (Materialtabelle)hinzu.
- Wirbeln Sie die magnetischen Perlen aus dem Neutrophilen-Isolationskit für 30 s vor dem Gebrauch, um die sehr feinen magnetischen Perlen wieder auszusetzen.
- Fügen Sie der Blutprobe 500 l der magnetischen Perlen hinzu und mischen Sie sie vorsichtig, indem Sie die Röhre mehrmals invertieren.
- Bei Raumtemperatur (RT) für 5 min inkubieren.
- Füllen Sie das Rohr auf 50 ml mit EDTA Stock Solution 2. Mischen Sie durch sehr sanfte Pipettierung nach oben und unten 2-3x.
- Legen Sie das Rohr in den Magneten und entfernen Sie den Deckel, um eine nachträgliche Rührung des Rohres zu vermeiden.
- 10 min bei RT inkubieren.
- Die angereicherte Zellsuspension, die die Neutrophilen enthält, sorgfältig in ein neues 50 ml konisches Rohr zu zerlegen.
HINWEIS: Berühren Sie nicht die Seite des Rohres, die mit dem Magneten in Berührung kommt, und vermeiden Sie die Entnahme und Störung der roten Blutkörperchen an der Unterseite des Rohres. Lassen Sie ca. 10 ml der roten Blutkörperchen Suspension am Boden der Röhre. - Wirbeln Sie die magnetischen Perlen für 30 s vor Gebrauch und fügen Sie 0,5 ml der magnetischen Perlen in die Röhre mit den angereicherten Neutrophilen. Mischen Sie sanft, indem Sie das Rohr invertieren.
- Inkubieren Bei RT für 5 min.
- Legen Sie das Rohr in den Magneten und entfernen Sie den Deckel, um nachfolgende Rührung zu vermeiden.
- Inkubieren Bei RT für 5 min.
- Die angereicherte Zellsuspension, die die Neutrophilen enthält, sorgfältig in ein neues 50 ml konisches Rohr zu zerlegen.
HINWEIS: Berühren Sie nicht die Seite des Rohres, die mit dem Magneten in Berührung kommt. Lassen Sie ca. 5 ml der Suspension an der Unterseite des Rohres. - Um die vollständige Entfernung von Magnetperlen aus dem Zellgemisch zu gewährleisten, legen Sie das Rohr mit den angereicherten Zellen in den Magneten.
- 10 min bei RT inkubieren.
- Die angereicherte Zellsuspension, die nun reine Neutrophilen enthält, in einem neuen 50 ml konischen Rohr sorgfältig pipette.
HINWEIS: Berühren Sie nicht die Seite des Rohres, die mit dem Magneten in Berührung kommt. Lassen Sie ca. 5 ml der Suspension an der Unterseite des Rohres. - Mischen Sie die isolierten Zellen mit 1 mM EDTA Stock Solution 2 auf ein Endvolumen von ca. 41 ml. Pipette nach oben und unten zu mischen.
- Teilen Sie die Lösung gleichmäßig in zwei Rohre mit ca. 20 ml in jedem Rohr.
- Zentrifugieren Sie beide Rohre bei 335 x g für 5 min.
- Während dieser Zentrifugation nehmen Sie den MLi-2-Inhibitorbestand (200 M/1.000x Konzentration) aus dem -80 °C Gefrierschrank und lassen Sie bei RT zur späteren Verwendung.
- Unmittelbar nach dem Zentrifugationsschritt und ohne Rühren der Schläuche den Überstand abgießen, ohne die neutrophilen Pellets zu stören. Setzen Sie jedes Zellpellet in 10 ml Zellkulturmedien (Tabelle der Materialien) bei RT wieder auf, indem Sie Zellen 4x sanft nach oben und unten pipetieren.
3. LRRK2 Kinase-Inhibitor Behandlung von reinen Neutrophilen
- Beschriften Sie eine Röhre "DMSO" und die andere Röhre "MLi-2".
- Zum "DMSO" beschrifteten Rohr, fügen Sie 10 L DMSO hinzu und mischen Sie sanft, indem Sie 2x mit einer 10 ml Pipette auf und ab pfeifen. Zum beschrifteten Rohr "MLi-2" 10 L mit 200 M MM MLi-2-Lagerlösung (Endkonzentration 200 nM) hinzufügen und vorsichtig mischen, indem Sie 2x mit einer 10 ml Pipette auf und ab pfeifen.
- Inkubieren Sie die Proben für 30 min bei RT. Mischen Sie sanft durch Inversion alle 10 min während der Inkubation.
- Während der Inkubationszeit 0,5 M DIFP-Lager aus dem Gefrierschrank von -80 °C entfernen und in einer Dunstabzugshaube auf Eis stellen. 1 mg/ml Mikrocystin-LR-Stammlösung aus dem Gefrierschrank -80 °C entfernen und bei RT auftauen lassen. Nehmen Sie ein Aliquot (0,25 ml) des Lysepuffers aus dem Gefrierschrank, lassen Sie es bei RT auftauen und legen Sie es dann zur späteren Verwendung auf Eis.
- Bereiten Sie 1 ml Zellkulturmedium vor, das 1 L DMSO enthält, und rufen Sie diesen DMSO-Resuspensionspuffer auf. Bereiten Sie 1 ml RPMI-Medien vor, die 1 L von 200 M MLi-2 enthalten, und rufen Sie diesen MLi-2-Resuspensionspuffer auf.
- Nach der 30 min Inkubationszeit zentrieren beide Rohre bei 335 x g für 5 min.
- Entsorgen Sie den Überstand in jedem Rohr vorsichtig, ohne das neutrophile Pellet zu stören.
- Für die DMSO-markierte Probe das Pellet vorsichtig in 1 ml des DMSO-Resuspendiertpuffers und für das MLi-2-markierte Rohr wieder aufsetzen, setzen Sie das Pellet in 1 ml des MLi-2-Resuspensionspuffers wieder auf.
- Übertragen Sie die resuspendierten Zellpellets in entsprechende Zentrifugationsröhrchen mit der Bezeichnung "DMSO" und "MLi-2" und Zentrifugen beider Rohre bei 335 x g für 3 min.
- Bereiten Sie während des Zentrifugationsschritts den Lysepuffer vor. In der Dunstabzugshaube geben Sie dem 0,25 ml DiFP-Puffer vorsichtig 0,25 l 0,5 M DIFP-Lösung sowie 0,25 l 1 mg/ml Mikrocystin-LR hinzu. Mischen und auf Eis lassen, bis zum Gebrauch.
HINWEIS: Fügen Sie DIFP dem Lysepuffer innerhalb von 15 min Zelllyse hinzu, da DIFP in einer wässrigen Lösung relativ instabil ist. - Unmittelbar nach der Zentrifugation den restaanten Überstand mit einer Pipette vorsichtig und vollständig entfernen, ohne das neutrophile Pellet zu stören, und die Schläuche auf Eis legen.
- Fügen Sie sofort 100 l Lysepuffer mit DIFP und Mikrocystin-LR in jedes Rohr. Mit einer 100–200-L-Pipette können Sie die Zellpellets wieder aufhängen, indem Sie etwa 5–10x nach oben und unten pfeifen.
- Lyse die Zellen auf Eis für 10 min.
- Zentrifugenrohre bei 20.000 x g für 15 min bei 4 °C, um Zellablagerungen zu entfernen.
- Übertragen Sie die Übertreibungen "DMSO" und "MLi-2", die die Neutrophilenlysate enthalten, in neue Zentrifugationsröhrchen. Entsorgen Sie das Trümmerpellet.
HINWEIS: Die neutrophilen Lysate sind nun einsatzbereit oder können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C für zukünftige Analysen gelagert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Unser Assay ermöglicht die Abhörung der PD-assoziierten LRRK2-Kinase bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen mit LRRK2-abhängiger Rab10-Phosphorylierung als Auslese. Neutrophile sind eine homogene und reichlich periphere weiße Blutkörperchenpopulation, die hohe Konzentrationen der LRRK2- und Rab10-Proteine ausdrückt (Abbildung 1). Die einzige andere Zellpopulation unter den verbleibenden peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mit hoher Kopierzahl beider Proteine sind Monozyten, aber diese machen nur 2–12% der weißen Blutkörperchen aus. Dies deutet darauf hin, dass periphere Blutneutrophile eine geeignetere Biomatrix für die Untersuchung der LRRK2-kontrollierten Rab10-Phosphorylierung sind.
Bei der Isolierung peripherer Blutneutrophile aus 10 ml Blut mit unserem Verfahren wurde zwischen 0,5–0,75 mg Gesamtproteinlysat pro Spender erhalten (Abbildung 2A), was für eine signifikante Anzahl von Immunoblot-Analysen ausreicht, für die nur 10 g pro Gellane erforderlich sind. Während die Kontrolle der Reinheit und Lebensfähigkeit der Zellen nicht routinemäßig durchgeführt wird, Wir haben bei drei gesunden Spendern gezeigt, dass die Reinheit isolierter Neutrophile zwischen 94–98% und die Lebensfähigkeit der Zellen bei 99% liegt, wie durch die Durchflusszytometrieanalyse mit dem CD66b-Fluorescein-Isothiocyanat-Neutrophilenmarker und 4',6-Diamidin-2'-Phenylindoledihydrochlorid (DAPI) zur Lebensfähigkeit bestimmt wird (Abbildung 2A).
Während der Schwerpunkt dieser Veröffentlichung auf der Isolierung und Verarbeitung von Neutrophilen aus peripherem Blut und nicht auf der Analyse durch quantitatives Western Blotting liegt, zeigt Abbildung 2B, dass der monoklonale MjFF-pRab10-Antikörper, der speziell Rab10-phosphoryliert bei Threonin 73 erkennt, robuste Signale in den neutrophilen Proben zeigte, die durch die Behandlung mit einem potenten und spezifischen LRRK2-Kinaseninhibitor deutlich unterdrückt wurden.
Neutrophile enthalten hohe Mengen an Serinproteasen, die sich auf die nachfolgende Western-Blot-Analyse auswirken können. Während DIFP effektiv die hohe Proteaseaktivität bei Neutrophilen unterdrückt, ist es ein starkes Organophosphor-Neurotoxin und es wäre wünschenswert, es durch einen ebenso wirksamen, aber weniger toxischen Protease-Inhibitor zu ersetzen, wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Wir stellten fest, dass die Rab10-Phosphorylierung ebenso gut erhalten war, als DIFP mit einer Konzentration von 2,5 mM durch PMSF ersetzt wurde (Abbildung 2C). Die Integrität des LRRK2-Proteins wurde jedoch bei der Verwendung von PMSF im Vergleich zu DIFP beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass das größere LRRK2-Protein anfälliger für Abbau ist (Abbildung 2C).
Wir haben bereits gezeigt, dass eine andere PD-verursachende Genmutation VPS35 D620N zu einer Hyperaktivierung der LRRK2-Kinase durch einen noch unbekannten Mechanismus15führt. Neutrophile von drei Patienten mit PD, die eine krankheitserregende heterozygote VPS35 D620N-Mutation beherbergen, wurden mit der in diesem Artikel beschriebenen Methode isoliert (Abbildung 3). Neutrophilenproben von neun gesunden Spendern wurden als Kontrollen15isoliert. Die Immunoblot-Analyse mit dem monoklonalen Antikörper MJFF-pRab10 zeigt eine signifikante, 3x-Zunahme der Rab10-Phosphorylierung bei Thr 73 bei Neutrophilen von Parkinson-Patienten mit einer VPS35 D620N-Mutation im Vergleich zu den Kontrollen. Die gesamte Rab10-Proteinexpression ist in allen 12 neutrophilen Proben ähnlich.
Abbildung 1: Häufigkeit von LRRK2- und Rab10-Proteinen in Immunzellen, die aus menschlichem Blut isoliert sind, mit Daten, die in der immprot-Datenbank (http://www.immprot.org) öffentlich verfügbar sind16. Die Grafik zeigt die Anzahl der Proteinkopien pro Zelle für LRRK2 und Rab10 in einer Reihe von peripheren Blutimmunzellen, einschließlich Teilmengen von T-Zellen, B-Zellen, Monozyten, NK-Zellen, dendritischen Zellen und den Granulozyten Neutrophilen, Basophilen und Eosinophilen. Diese Zahl wurde von Fan et al.11geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Charakterisierung und Analyse von menschlichen peripheren Blutneutrophilen und Bedeutung von DIFP zur Vorbeugung des proteolytischen Abbaus bei Neutrophilen. (A) Neutrophile wurden aus dem Ganzen Blut von drei gesunden Spendern (A, B und C) isoliert, die Reinheit, Lebensfähigkeit und Gesamtproteinausbeute nach Zelllyse aufweisen. (B) Neutrophile wurden mit oder ohne LRRK2-Kinase-Inhibitor (MLi-2) behandelt, dann lysiert und einer quantitativen Immunoblot-Analyse mit den angegebenen Antikörpern mittels Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebung unterzogen. (C) Neutrophile wurden von zwei gesunden Spendern isoliert und 30 min mit 100 nM MLi-2 behandelt. Zellen wurden entweder in Gegenwart von 0,5 mM DIFP oder 2,5 mM PMSF lysiert, um die Serinproteaseaktivität bei Neutrophilen zu blockieren. A und B wurden von Mir et al.15modifiziert, während C von Fan et al.11modifiziert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Erhöhte LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität bei Parkinson-Patienten mit einer heterozygeous VPS35 D620N-Mutation. Neutrophile wurden von neun nicht altersgerechten gesunden Kontrollen und drei PD-Patienten mit einer krankheitserregenden heterozygoten VPS35 D620N-Mutation isoliert. Die Zellen wurden 30 min vor der Zelllyse mit oder ohne 200 nM MLi-2 behandelt. (A) Insgesamt 10 g ganzer Zellextrakt, der quantitativen Immunoblot-Analysen mit den angegebenen Antikörpern mittels Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebung unterzogen wird. Immunoblots wurden für Phospho-Thr73 Rab10:total Rab10 Verhältnis quantifiziert (B). Die Daten wurden mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey durch einwegs ANOVA analysiert. Daten, die als Mittel dargestellt werden, sD; p < 0,0001. Diese Zahl wurde von Mir et al.15geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Überzeugende klinische, genetische und biochemische Beweise deuten auf eine wichtige Rolle für LRRK2 und insbesondere seine Kinase-Funktion bei der Parkinson-Krankheithin 7. LRRK2-Kinase-Inhibitoren wurden entwickelt und gehen in klinische Studien2,4,12. Daher ist es notwendig, LRRK2 als Biomarker für das Zielengagement sowie die Patientenschichtung zu nutzen. Unser Protokoll beschreibt einen robusten und einfachen Test zur Analyse der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivierung, wie er durch die Phosphorylierung seines physiologischen Substrats Rab10 im homogenen Pool menschlicher peripherer Blutneutrophilen widergespiegelt wird11,14. Für die Analyse durch quantitative Immunoblotting empfehlen wir dringend die Verwendung eines hochselektiven phosphospezifischen Rab10-Antikörpers (MJFF-pRab10 monoklonaler Antikörper)14,17.
Wir verwenden menschliche Neutrophile, weil sie eine homogene Teilmenge peripherer Blutzellen bilden, die die dominante Leukozytenpopulation17,18bilden. Noch wichtiger ist, dass Neutrophile auch einen hohen Proteinexpressionsgehalt von LRRK2 und seinem Unterzustand Rab10 (Abbildung 1)16aufweisen. Im Gegensatz dazu sind die verbleibenden Teilmengen von Leukozyten, aus denen der Pool von PBMCs besteht, heterogen mit variabler und überwiegend niedriger Expression von LRRK2 und Rab10. Monozyten und dendritische Zellen haben hohe Expressionsniveaus, sind aber in der Gesamtfülle16niedrig.
Während wir die Verwendung von EDTA Vacutainer Blutentnahmeröhrchen empfehlen, kann ein anderes Antikoagulans als EDTA verwendet werden. Jedoch, das Vorhandensein von EDTA ist wichtig für die Leistung der Neutrophilen Isolation Kit. Wir empfehlen daher, der Vollblutprobe EDTA zuzurechnen, so dass eine Endkonzentration von 1 mM EDTA erreicht wird, selbst wenn ein alternatives Antikoagulans verwendet wird. Die Verwendung des Neutrophilen-Isolationskits ermöglicht die Reinigung von Neutrophilen direkt aus menschlichem Vollblut durch immunmagnetische negative Selektion auf relativ schnelle und einfache Weise. Die Anzahl der verfügbaren Magnete bestimmt, wie viele Blutproben parallel verarbeitet werden können. Es ist leicht möglich, Neutrophile aus bis zu sechs Blutproben parallel mit sechs Magneten zu isolieren. Ein potenzieller Nachteil sind die damit verbundenen Kosten für kommerzielle Neutrophilen-Isolationskits und den benötigten Magneten. Alternative Methoden zur Neutrophilenisolation aus Vollblut wurden beschrieben und stützen sich auf die Dichtegradiententrennung oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), die erhebliche Nachteile haben. Ersteres ist deutlich zeit- und arbeitsintensiver und zumindest in unseren Händen nicht so zuverlässig und effizient. Letzteres erfordert eine FACS-Maschine und zusätzliche Handhabungsschritte müssten eingeführt werden, einschließlich der Erschöpfung der roten Blutkörperchen und der Zellfärbung, wodurch der Zellisolationsprozess Zeit wird. Insgesamt ist die immunmagnetische Isolation schnell, erzeugt eine hochreine Probe und vermeidet eine übermäßige Handhabung der Zellen. Was die Probenverarbeitung betrifft, so haben wir zuvor gezeigt, dass eine Verzögerung zwischen Blutentnahme und neutrophiler Isolierung von mindestens 24 h nicht zu einer signifikanten Veränderung oder Variation des Ergebnisses unseres Assays führt, was Flexibilität für die zukünftige klinische Verwertung bietet11.
Das Neutrophilen-Isolationsverfahren selbst ist sehr einfach. Wir empfehlen, die magnetischen Perlen vor jedem Gebrauch zu wirbeln. Es ist auch wichtig, den Magneten nicht zu stören, sobald sich das Rohr im Inneren des Magneten befindet, um Turbulenzen und das Lösen der Magnetischen Perlen zu vermeiden. Neutrophile werden in Suspension durch mehrere Runden der immunmagnetischen Entfernung aller unerwünschten Zellen angereichert. Es sollte darauf geachtet werden, die Seite des Rohres, die mit dem Magneten in Berührung kommt, und während der ersten Isolationsrunde (Schritt 2.11) nicht zu berühren, um die roten Blutkörperchen an der Unterseite des Rohres nicht zu stören. Nach der letzten Runde des Pipettierens der angereicherten Zellsuspension in ein neues konisches Rohr (Schritt 2.24) stehen Neutrophile sofort zur Weiterverarbeitung zur Verfügung. Wenn Neutrophile verwendet werden, um die LRRK2-Aktivität in Zellen zu bewerten, werden Neutrophile dann in zwei Chargen aufgeteilt und nach dem Pelletieren durch Zentrifugation, resuspendiert entweder in einem LRRK2-Kinase-Inhibitor (hier, MLi-2) oder DMSO enthaltendes Zellkulturmedium. Da die Dephosphorylierung in Gegenwart und Rephosphorylierung in Abwesenheit der LRRK2-Kinase-Hemmung relativ schnelle Ereignisse sind, ist darauf zu achten, dass die mLi-2 behandelte neutrophile Fraktion einem LRRK2-Kinase-Inhibitor ausgesetzt bleibt (z. B. MLi-2) bis zur Zelllyse (Schritte 3.8–3.10).
Es gibt mehrere Zentrifugationsschritte in diesem Protokoll mit 15 und 50 ml konischen Rohren. Während wir routinemäßig die angegebenen Zentrifugationsgeschwindigkeiten im Protokoll verwenden, ist es möglich, die Zentrifugationsgeschwindigkeit auf bis zu 400 x g zu erhöhen, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Dies führt zu einem etwas festeren neutrophilen Zellpellet, das dazu beitragen könnte, jeden potenziellen Verlust von neutrophilem Material während der Dekantierung und Pipettierung der überständlichen Schritte während dieses Protokolls zu reduzieren. Dies wird wahrscheinlich den Ertrag in Bezug auf das gesamte gewonnene Proteinlysat erhöhen. Ein potenzielles Problem ist, dass eine höhere Zentrifugationskraft Neutrophile aktivieren und möglicherweise die nachfolgende Analyse beeinflussen könnte. Unsere allgemeine Empfehlung ist es, Neutrophile bei jedem Schritt des Protokolls so schonend wie möglich zu behandeln.
Unser Protokoll verwendet den hochwirksamen Serin-Protease-Inhibitor DIFP (0,5 mM) als Teil des neutrophilen Lysepuffers. DIFP ist ein starkes Organophosphor-Neurotoxin, und während wir alternative Verbindungen untersucht haben, war seine Zugabe zum Lysepuffer wesentlich für die Analyse der LRRK2-kontrollierten Rab10-Phosphorylierung bei menschlichen Neutrophilen durch Immunoblotting. Beispielsweise wurde das Ersetzen von DIFP durch 1% (w/v) SDS in anderen Studien19 zur Lyse von Neutrophilen verwendet und führte zu einem signifikanten Proteinabbau in dem Maße, dass Immunoblotting für LRRK2, Rab10 und sogar die GAPDH-Ladekontrolle kein Signal lieferte, was die Bedeutung der Aufnahme eines hochwirksamen Proteasehemmers in den Lysepuffer hervorhob (Abbildung 2C). Beim Ersetzen von DIFP durch den weniger potenten, aber auch weniger toxischen Serinprotease-Inhibitor PMSF bei 2,5 mM war die Rab10-Phosporylierung gut erhalten, aber das größere LRRK2-Protein wurde erheblich abgebaut (Abbildung 2C). Um die Handhabung der DIFP-Lagerlösung zu minimieren, kann der DIFP-haltige Lysepuffer in Chargen hergestellt, aliquotedundiert und bei -20 °C oder -80 °C11gelagert werden. Im Hinblick auf die Analyse durch quantitative Immunoblotting ist es von größter Bedeutung, einen phosphospezifischen Antikörper zu verwenden, der nachweislich nur für ein einziges LRRK2-phosphoryliertes Rab-Protein selektiv ist, wie den MJFF-pRab10-Antikörper, der für unsere Studien verwendet wird14.
Das Protokoll kann auch mit einem maximalen Vollblutvolumen von bis zu 25 ml skaliert werden, was der Grenzwert ist, der in einem Isolationsverfahren mit einem Magneten verarbeitet werden kann, der in der Lage ist, 50 ml konische Röhren aufzunehmen. Die einzigen Schritte, die Anpassungen benötigen würden, sind Schritt 2.4 (Zugabe von 50 l Isolationscocktail pro ml Blut), Schritte 2.6 und 2.12 (Zugabe von 50 l magnetischen Perlen pro ml Blut) und eine proportionale Erhöhung des Volumens des Lysepuffers für neutrophile Lyse in Schritt 3.12. Alle anderen Schritte können identisch gehalten werden.
Zusammenfassend beschreibt unser Protokoll eine einfache und robuste Methode, um menschliche Neutrophile aus peripherem Blut zu isolieren. Neutrophile können dann mit und ohne einen potenten und spezifischen LRRK2-Kinase-Inhibitor behandelt werden, um die Quantifizierung der LRRK2-gesteuerten Phosphorylierung von Rab10 in vivo zu ermöglichen. Dies kann nützlich sein, um Personen nach LRRK2 Kinase-Signalweg-Aktivität zu stratifizieren und für die Identifizierung von Personen mit Pfad-Hyperaktivierung, die von zukünftigen LRRK2-Kinase-Hemmer-Behandlung profitieren könnte. Während dies für die Mehrheit der Menschen mit PD, insbesondere idiopathische PD, unwahrscheinlich sein wird, wurde unser Assay bereits erfolgreich bei Personen eingesetzt, die eine seltene, heterozygote Mutation in einem anderen PD-assoziierten Gen, VPS35 D620N, tragen, wo die LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität durch einen noch unbekannten Mechanismus signifikant erhöht wird15. Wir hatten zuvor DIE LRRK2-gesteuerten Rab-10-Phosphorylierungsspiegel bei einer kleinen Anzahl von Personen untersucht, die die häufigere LRRK2 G2019S-Mutation trugen, von der bekannt ist, dass sie die LRRK2-Kinase-Aktivität nur geringfügig um den Faktor zwei aktiviert, ohne einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu Kontrollen und Patienten mit idiopathischer PD mit unserem Assay11,14zu erkennen. Diese und weitere unveröffentlichte Daten deuten darauf hin, dass die LRRK2-Kinaseaktivität wahrscheinlich eine Erhöhung um >3x erfordert, um ein signifikantes Ergebnis mit quantitativer Immunoblotting zu erzielen. Die Empfindlichkeit für die Erkennung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivierung kann jedoch wahrscheinlich erhöht werden, wenn modernste Massenspektrometrie-Technologie eingesetzt wird.
Wir schlagen vor, dass Neutrophile eine wertvolle Ressource für die Parkinson-Krankheit Forschung in LRRK2 Kinase-Signalweg-Aktivität sind und könnte helfen, Personen zu identifizieren, die von zukünftigen LRRK2 Kinase-Hemmer-Behandlung profitieren könnte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken den gesunden Freiwilligen, die freundlicherweise Blut gespendet haben, für die vorliegende Studie. Wir danken der Michael J. Fox Foundation for Parkinson es Research (MJFF) und der Fox BioNet Studienleitung (FBN) für ihre Unterstützung und Ihren Beitrag zum schriftlichen Protokoll und Video. Wir danken Professor Alexander Zimprich von der Universität Wien in Österreich für die Prüfung unseres Protokolls und der Zusammenarbeit. Wir schätzen die Beiträge von Paul Davies zum Projekt (Geschäftsführer der MRC PPU). Wir würdigen auch die hervorragende technische Unterstützung der MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit (PPU), nämlich Chemical Synthesis (Natalia Shpiro für die Synthese von MLi-2), MRC PPU Reagents und Services Antikörper-Reinigungsteams (koordiniert von Hilary McLauchlan und James Hastie). Wir danken Mhairi Towler und Fraser Murdoch von Vivomotion für ihre Hilfe bei der Herstellung der Videos und Animationen. Wir danken Steve Soave aus 81 Filmen für die Unterstützung bei den letzten Bearbeitungen. Esther Sammler wird von einem Scottish Senior Clinical Academic Fellowship unterstützt und wurde von Parkinson es UK (K-1706) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
