Summary
류신이 풍부한 반복 키나아제 2 유전자(LRRK2)의 돌연변이는 유전성 파킨슨병을 일으킨다. 우리는 인간 말초 혈액 호중구에서 Rab10의 LRRK2 대조 인산화를 평가하기위한 쉽고 강력한 방법을 개발했습니다. 이 증가 LRRK2 키 나 제 통로 활동을 가진 개인을 식별 하는 데 도움이 수 있습니다.
Abstract
류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2)는 유전성 파킨슨병(PD)에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자이며 모든 병원성 LRRK2 돌연변이는 키나아제 기능의 과활성화를 초래한다. 여기서, 우리는 그것의 생리적 기질 중 하나인 Rab10을 트레오닌 73에서 LRRK2 대조 포스포릴화를 측정함으로써 인간 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 키나아제 통로 활성을 정량화하는 쉽고 강력한 분석방법을 기술한다. 기재된 면역블로팅 분석은 MJFF-pRab10 토끼 모노클로날 항체와 같은 LRRK2에 의해 인산화된 Rab10 Thr73 에피토프를 인식하는 완전 선택적 및 인광특이적 항체를 필요로 한다. 말초 혈액은 쉽게 접근 할 수 있고 호중구는 풍부하고 균일 한 구성 요소이기 때문에 인간의 말초 혈액 호중구를 사용합니다. 중요한 것은, 호중구는 LRRK2와 Rab10 둘 다의 상대적으로 높은 수준을 표현합니다. 호중구의 잠재적인 단점은 그들의 높은 본질적인 세린 프로테아제 활성, 유기 인스포러스 신경 독소 디이소프로필플루오로프포스산염 (DIFP)와 같은 매우 강력한 프로테아제 억제제의 사용을 필요로 하는 리시저 완충제의 일부입니다. 그럼에도 불구하고, 호중구는 생체 내에서 LRRK2 키나아제 통로 활성에 대한 연구를 위한 귀중한 자원이며 PD 생체 저장소 컬렉션에 포함시키는 것으로 고려되어야 한다.
Introduction
파킨슨 병 (PD)을 늦추거나 멈추려는 시도는 지금까지 실패했습니다. 류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2)에서 의한 과다 활성화 돌연변이의 발견은 PD에 대한 위험을 증가시키고 있거나 증가시키는 LRRK2 키나아제 억제제1,,2,,3의발달로 이어졌다. 이들은 지금 임상 시험4를입력했습니다. LRRK2의 정확한 기능은 불분명하지만, 주요 발전은 LRRK2 키나제,5,6,7의첫 번째 보나 피라제 생리기로서 Rab10을 포함하는 랍 GTPase 단백질의 서브세트의 식별이었다.7 질병 변형 치료제의 시대에 주요 과제는 LRRK2 키나아제 활성화 상태의 생화학적 마커및 LRRK2 키나제 억제제의 표적 결합이다.
지금까지, 생체 내 LRRK2 억제제의 주요 약동학 마커는 LRRK2의 구성적으로 인산화된 세린 잔기의 클러스터였으며, 특히 세린 935는 다양한 LRRK2억제제8,,9에반응하여 탈인성화된다. 그러나, 세린 935 인산화는 LRRK2에 의해 직접적으로 인산화되지 않고 여전히 키나제 비활성LRRK2(10)에서인산화되지 않기 때문에 본질적인 세포 LRRK2 키나아제 활성과 상관관계가 없다. LRRK2 키나아제 활성은 세린(1292)의 오토포스포릴레이션과 잘 상관되지만, 본부위에,대한 신뢰할 수 있고 인특이적인 항체의 현재 부족으로 인해 전체 세포 추출물의 면역블롯 분석에 의한 내인성 LRRK2 키나아제 활성에 대한 적절한 판독은 실질적으로아니다.
우리는 스레오닌 7311에서LRRK2 대조 단백질 Rab10의 생리적 표적 인산화를 측정하는 인간 말초 혈액 세포에서 LRRK2 키나아제 경로 활성을 정량화하는 강력하고 쉬운 분석방법을 개발했습니다. 말초 혈액은 최소한의 불편을 일으키는 원인이 되는 낮은 리스크 그리고 빠른 절차인 베니섹션에 의해 쉽게 접근할 수 있습니다. 우리는 인간 말초 혈액 호중구에 초점을 맞추기 때문에 그들은 풍부 (모든 백혈구의 37-80%)와 LRRK2와 Rab1011둘 다의 상대적으로 높은 수준을 발현하는 균질한 세포 인구. 더욱이, 말초 혈액 호중구는 면역자기 음성 접근법을 채택하여 신속하고 효율적으로 단리될 수 있다. 후속 관찰된 Rab10 인산화가 LRRK2에 의해 매개되도록 하기 위해, 호중구의 각 배치는 강력하고 선택적인 LRRK2 키나아제 억제제의 유무에 관계없이 배양된다(MLi-2를 사용하고 권장한다)2,,12. 이어서 프로테아제 억제제 디이소프로필 플루오로포스페이트(DIFP)를 함유하는 완충제에서 세포 용해가 이어서호중구(13)에서높은 것으로 알려진 본질적인 세린 프로테아제 활성을 억제하는 데 필요하다. 정량적 면역블로팅에 의한 최종 분석을 위해, Rab10 Thr73-phoepitope를 특이적으로 검출하고 다른 인산화 된 랍 단백질(14)과교차 반응하지 않는 MJFF-pRab10 토끼 단클론 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 이 항체의 선택성 및 특이성은 상이한 랍 단백질 및 A549 Rab10 녹아웃세포주(14)의과발현 모델에서 검증되었다. 따라서, 강력하고 선택적인 LRRK2 키나아제 억제제2를이치에 없이 처리된 호중구 매립제에서 Rab10 인산화의 차이를 측정한다. 양자택일로, 견본은 또한 정량 질량 분석과 같은 그밖 방법에 의해 분석될 수 있었습니다.
결론적으로, LRRK2 대조군 Rab10 인산화는 세린 935및 인간 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 인산화에 LRRK2 키나아제 활성의 우수한 마커이며, 인간 말초 혈액 호중구는 LRRK2에 대한 PD 연구에 귀중한 자원이다. 당사의 프로토콜은 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 경로 활성을 심문하는 강력하고 쉬운 분석을 제공하고 증가된 LRRK2 키나아제 활성15를가진 개인의 생화학적 계층화를 허용한다. 중요하게는, 그러한 개인은 향후 LRRK2 키나아제 억제제 치료로부터 혜택을 받을 수 있다.
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Protocol
현지 영국 규정에 따르면 인간의 혈액의 모든 조작과 파이펫팅은 카테고리 2 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다. 모든 절차는 지역 윤리 검토 위원회에 따라 수행되었으며 모든 참가자는 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.
1. 준비
- 인산완식염수(PBS)에 100 mM EDTA를 함유한 EDTA 스톡 솔루션 1의 0.1 mL을 준비합니다.
- PBS에서 1 mM EDTA를 포함하는 EDTA 스톡 솔루션 2의 60 mL을 준비하십시오.
- 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5), 1 % (v / v) 트리톤 X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4,50 mM NaF를 포함하는 용해 버퍼를 준비, 10 mMM β-글리세로포스페이트, 5 mMM 파이로포스페이트, 0.27 M 수크로오스, 0.1% (v/v) β-메르카프토에탄올, 1x 프로테아제 억제제 칵테일, 1 μg/mL 마이크로시스틴-LR, 및 0.5 mM 디이소프로필 플루포포스페이트(DP).
참고 : 저자는 정기적으로 EDTA가없는 제품을 사용하지만 EDTA 함유 프로테아제 억제제 칵테일도 작동해야합니다. 용해 완충액은 β-메르카포에탄올, 프로테아제 억제제, 마이크로시스틴-LR 및 DIFP없이 사전에 이루어질 수 있으며, 사용 될 때까지 4°C에서 보관할 수 있다. β-메르카포에탄올, 프로테아제 억제제, 마이크로시스틴-LR 및 DIFP가 사용 직전에만 첨가되었는지 확인하십시오.
주의: DIFP는 독성이 있으며 지역 보건 및 안전 위험 평가 후 연기 후드에서 주의해서 처리해야 합니다. DIFP는 용해 버퍼에 추가하고 즉시 사용할 수 있습니다. 대안적으로, DIFP를 포함한 모든 다른 성분을 포함하는 완전한 용해 완충제는 적어도 4주 동안 후속 사용을 위해 -80°C에서 aliquoted 및 저장될 수 있다.
2. 전혈에서 호중구 격리
- 혈액 수집 튜브에 혈액 10 mL을 수집합니다. 튜브를 7-8x 반전하여 부드럽게 섞으세요.
- 50 mL 원엽 튜브에 혈액 의 10 mL를 전송합니다.
- EDTA 스톡 솔루션 100 μL을 혈액에 추가합니다. 부드럽게 섞으세요.
- 호중구 절연키트(재료 표)에서500 μL의 분리 칵테일(50 μL/mL)을 전혈 샘플에 추가합니다.
- 매우 미세한 자기 비드를 재중단시키기 위해 사용하기 전에 30s에 대한 호중구 격리 키트로부터 의 자기 비드를 소용돌이.
- 혈액 샘플에 자기 비드 500 μL을 추가하고 튜브를 여러 번 반전시켜 부드럽게 섞습니다.
- 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
- EDTA 스톡 솔루션 2로 튜브를 50 mL로 채웁니다. 위아래로 2-3x를 부드럽게 파이펫팅하여 섞으세요.
- 튜브를 자석에 넣고 뚜껑을 제거하여 튜브의 후속 교반을 피하십시오.
- RT에서 10 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 호중구를 포함하는 농축 된 세포 현탁액을 새로운 50 mL 원엽 튜브로 조심스럽게 피펫합니다.
참고 : 자석과 접촉하는 튜브의 측면을 만지지 말고 튜브 바닥에있는 적혈구의 수집 및 교란을 피하십시오. 적혈구 현탁액의 대략 10 mL를 관의 바닥에 뒤에 둡니다. - 사용 전에 30s의 자기 비드를 소용돌이시키고 농축 된 호중구를 함유하는 튜브에 자기 비드0.5 mL를 추가합니다. 튜브를 뒤집어 부드럽게 섞으세요.
- RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 튜브를 자석에 넣고 뚜껑을 제거하여 후속 교반을 피하십시오.
- RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 호중구를 포함하는 농축 된 세포 현탁액을 새로운 50 mL 원엽 튜브로 조심스럽게 피펫합니다.
참고: 자석과 접촉하는 튜브의 측면을 만지지 마십시오. 튜브 바닥에 현탁액의 약 5 mL를 둡니다. - 세포 혼합물에서 자기 비드를 완전히 제거하려면 농축 된 세포가 들어있는 튜브를 자석에 넣습니다.
- RT에서 10 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 순수 호중구를 함유하고 있는 농축 된 세포 현탁액을 새로운 50 mL 원엽 튜브에 조심스럽게 피펫합니다.
참고: 자석과 접촉하는 튜브의 측면을 만지지 마십시오. 튜브 바닥에 현탁액의 약 5 mL를 둡니다. - 단리된 세포를 1 mM EDTA 스톡 솔루션 2와 약 41 mL의 최종 부피와 혼합합니다. 파이펫을 위아래로 섞어 드시면 됩니다.
- 각 튜브에서 약 20 mL로 용액을 두 개의 튜브로 균등하게 나눕니다.
- 335 x g에서 5 분 동안 두 튜브를 원심 분리합니다.
- 이 원심분리 동안 MLi-2 억제제 스톡(200 μM/1,000x 농도)을 -80°C 냉동고에서 꺼내서 후속 사용을 위해 RT에 둡니다.
- 원심 분리 단계 직후와 튜브의 교반없이 호중구 펠릿을 방해하지 않고 상월체를 부어 냅니다. 각 세포 펠릿을 10 mL의 세포 배양배지(재료 표)에서RT에서 세포를 4배 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 다시 중단합니다.
3. 순수 호중구의 LRRK2 키나아제 억제제 치료
- 한 튜브 "DMSO"와 다른 튜브 "MLi-2"에 라벨을 붙입니다.
- "DMSO" 라벨이 부착된 튜브에 10 μL의 DMSO를 추가하고 10mL 파이펫으로 2x 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다. "MLi-2" 라벨이 부착된 튜브에 200 μM MLi-2 스톡 솔루션(최종 농도 200 nM)의 10 μL을 추가하고 10mL 파이펫으로 2x 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
- RT에서 30 분 동안 샘플을 배양하십시오.
- 잠복기 동안, -80°C 냉동고에서 0.5M DIFP 스톡을 제거하고 얼음 위에 연기 후드에 놓습니다. -80°C 냉동고에서 1 mg/mL 마이크로시스틴-LR 스톡 용액을 제거하고 RT에 그대로 두어 해동합니다. 냉동고에서 용해 완충액의 aliquot (0.25 mL)를 가져 와서 RT에서 해동 한 다음 다음 다음 사용을 위해 얼음에 놓습니다.
- DMSO의 1 μL을 포함하는 세포 배양 배지의 1 mL을 준비하고 이 DMSO 재서스펜션 버퍼를 호출한다. 200 μM MLi-2의 1 μL을 포함하는 RPMI 매체의 1 mL를 준비하고 이 MLi-2 재서스펜션 버퍼를 호출합니다.
- 30 분 잠복기 후, 5 분 동안 335 x g에서 두 튜브를 원심 분리.
- 호중구 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브의 상급자를 조심스럽게 버리십시오.
- DMSO 표지 시료의 경우 DMSO 재서스펜션 버퍼의 1mL에서 펠릿을 부드럽게 재중단하고 MLi-2 라벨링 된 튜브의 경우 MLi-2 재서스펜션 버퍼의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 재중단된 세포 펠릿을 "DMSO" 및 "MLi-2" 라고 표시된 해당 원심분리 관으로 옮기고 두 튜브를 335 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 원심분리 단계 동안 용해 완충기를 준비합니다. 연기 후드에서 0.25 mM DIFP 용액의 0.25 μL뿐만 아니라 0.25 mL 의 마이크로 시스틴-LR0.25 mL 용해 버퍼를 신중하게 추가합니다. 섞어서 사용할 때까지 얼음위에 두십시오.
참고: DIFP는 수성 용액에서 상대적으로 불안정하기 때문에 셀 용해 15분 이내에 용해 버퍼에 DIFP를 추가합니다. - 원심 분리 직후 호중구 펠렛을 방해하지 않고 피펫으로 모든 상급자를 조심스럽게 완전히 제거하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 즉시 각 튜브에 DIFP 및 마이크로시스틴-LR을 함유한 용해 완충액 100 μL을 추가합니다. 100-200 μL 파이펫을 사용하여 약 5-10x를 위아래로 파이펫팅하여 셀 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 10 분 동안 얼음에 세포를 용해.
- 세포 파편을 제거하기 위해 4 °C에서 15 분 동안 20,000 x g의 원심 분리튜브.
- 호중구를 함유하는 "DMSO" 및 "MLi-2" 상피제를 새로운 원심분리관으로 옮긴다. 파편 펠릿을 버리십시오.
참고: 호중구 용해염은 이제 사용할 준비가 되거나 액체 질소로 냉동되어 향후 분석을 위해 -80°C에 보관할 수 있습니다.
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Representative Results
우리의 분석법은 LRRK2 의존적 Rab10 인산화를 판독으로 인간 말초 혈액 호중구에서 PD 관련 LRRK2 키나아제의 활성화를 심문할 수 있게 한다. 호중구는 LRRK2 및 Rab10 단백질 둘 다의 상부를 발현하는 균질하고 풍부한 말초 백혈구 집단이다(그림1). 두 단백질의 높은 사본 수를 가진 나머지 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 중 유일한 그밖 세포 인구는 단핵구입니다, 그러나 이들은 백혈구의 단지 2-12%를 구성합니다. 이는 말초 혈액 호중구가 LRRK2 대조되는 Rab10 인산화를 연구하기에 더 적합한 바이오매트릭스임을 나타낸다.
우리의 절차로 혈액의 10 mL에서 말초 혈액 호중구를 분리할 때, 공여자 당 총 단백질 용해액의 0.5-0.75 mg 사이를 얻어졌습니다(그림 2A),이는 겔 레인 당 단지 10 μg의 면역 blot 분석을 위해 충분합니다. 세포의 순도와 생존력을 확인하는 것은 일상적으로 수행되지 않지만, 우리는 3명의 건강한 기증자에게 고립된 호중구의 순도가 CD66b-불소 세포 분석 분석에 의해 결정된 바와 같이 세포의 생존율 ~99%와 CD66b-불등호성 호중구 마커 및 4',6-디아미딘-2'-페닐린돌 디하이드로염화물(DAPI)에 대한 유세포 분석으로 결정되었음을 입증하였다.Figure 2A
이 간행물의 초점은 말초 혈액에서 호중구의 격리 및 처리이고 양적 서쪽 blotting에 의한 분석이 아니라, 도 2B는 스레오닌 73에서 Rab10 인산화를 특이적으로 검출하는 MJFF-pRab10 단일클론 항체가 호중구 샘플에서 강력한 신호를 밝혀냈으며, 이는 강력하고 특이적인 LRRK2 키나아제 억제제로 처리함으로써 현저하게 억제된 MLi-2를 입증한다.
호중구는 후속 서양 얼룩 분석에 영향을 미칠 수있는 세린 프로테아제의 높은 수준을 포함. DIFP는 호중구에서 높은 프로테아제 활성을 효과적으로 억제하지만, 강력한 유기인신경독소이며 페닐메틸설포닐 불소(PMSF)와 같은 동등하게 효과적이지만 독성이 적은 프로테아제 억제제로 대체하는 것이 바람직할 것이다. 우리는 DIFP가 2.5 mM(그림 2C)의농도에서 PMSF로 대체 되었을 때 Rab10 인산화가 동등하게 잘 보존되었다는 것을 발견했습니다. 그러나, LRRK2 단백질의 무결성은 DIFP에 비해 PMSF를 사용할 때 손상되었고, 더 큰 LRRK2 단백질이 분해에 더 취약하다는 것을시사한다(도 2C).
우리는 이전에 또 다른 PD 유발 유전자 돌연변이 VPS35 D620N이 아직 알려지지 않은 기전15에의해 LRRK2 키나아제의 과활성화를 초래한다는 것을 보여주었다. 질병을 유발하는 이형 VPS35 D620N 돌연변이를 항하는 PD를 가진 3명의 호중구는 본 조에 기재된 방법을 사용하여 단리되었다(도3). 9명의 건강한 기증자로부터의 호중구 샘플은 대조군15로서분리되었다. MJFF-pRab10 단일클론 항체를 이용한 면역블롯 분석은 VPS35 D620N 돌연변이를 가진 파킨슨병 환자로부터의 호중구에서 Thr 73에서 Rab10 인산화에서 유의하고 ~3배 증가를 입증한다. 총 Rab10 단백질 발현은 모든 12개의 호중구 샘플에서 유사하다.
도 1: immprot 데이터베이스(http://www.immprot.org)16에서공개적으로 이용 가능한 데이터를 사용하여 인간의 혈액으로부터 분리된 면역 세포에서 LRRK2 및 Rab10 단백질의 풍부. 그래프는 T 세포, B 세포, 단핵구, NK 세포, 수지상 세포 및 과립구 호중구, 호광구 및 호산구의 하위 세트를 포함하는 말초 혈액 면역 세포의 범위에서 LRRK2 및 Rab10에 대한 세포당 단백질 사본수를 나타낸다. 이 그림은 팬 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 인간 말초 혈액 호중구의 특성 화 및 분석 및 호중구에서의 단백질 분해 를 예방하기 위한 DIFP의 중요성. (A)호중구는 세포 용해 후 순도, 생존율 및 총 단백질 수율을 나타내는 3명의 건강한 기증자(A, B 및 C)의 전혈로부터 분리되었다. (B)호중구는 LRRK2 키나아제 억제제(MLi-2)의 유무에 관계없이 처리한 다음, 근적외선(NIR) 형광 이미징을 통해 지시된 항체를 이용한 정량적 면역블롯 분석을 실시하였다. (C)호중구는 2명의 건강한 공여자로부터 분리하고 30분 동안 100 nM MLi-2로 처리하였다. 세포는 호중구에서 세린 프로테아제 활성을 차단하기 위해 0.5 mM DIFP 또는 2.5 mM PMSF의 존재 에서 용해되었다. A와 B는 미르 외15에서수정되었으며 C는 Fan 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 이종VPS35 D620N 돌연변이를 품고 있는 파킨슨병 환자에서 LRRK2 키나아제 통로 활성을 증가시킨다. 호중구는 질병을 유발하는 이종 VPS35 D620N 돌연변이를 가진 9명의 비연령일치 건강한 대조군 및 3명의 PD 환자로부터 분리되었다. 세포를 세포 용해 전 30분 동안 200 nM MLi-2의 유무에 관계없이 처리하였다. (A)근적외선(NIR) 형광 이미징을 통해 지시된 항체를 이용한 정량적 면역블롯 분석을 실시한 전체 세포 추출물의 총 10 μg. 면역혈전은 인-Thr73 Rab10:총 Rab10비율(B)에대해 정량화되었다. 데이터는 Tukey의 다중 비교 테스트를 통해 단방향 ANOVA에 의해 분석되었습니다. 수단으로 제시된 데이터 ± SD; p < 0.0001. 이 수치는 미르 외15에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
강력한 임상, 유전 및 생화학적 증거는 LRRK2및 특히 파킨슨 병에서 의 키나아제 기능에 대한 중요한 역할을지적7. LRRK2 키나아제 억제제가 개발되어 임상 시험2,,4,,12에진입하고 있다. 이와 같이 LRRK2를 환자 계층화뿐만 아니라 표적 참여에 대한 바이오마커로 활용할 필요성이 있다. 당사의 프로토콜은 인간 말초 혈액 호중구의 균질풀에서 의 생리기질 Rab10의 인산화에 의해 반영된 바와 같이 LRRK2 키나아제 경로 활성화를 분석하기 위한 강력하고 쉬운 분석을 기술한다11,,14. 정량적 면역블롯팅에 의한 분석을 위해, 우리는 고도로 선택적인 인광 특이적 Rab10 항체(MJFF-pRab10 단일클론 항체)의 사용을 강력히 권장한다14,,17.
우리는 인간 호중구를 사용하는데, 이는 그들이 지배적인 백혈구 집단 을 구성하는 말초 혈액 세포의 균질한 하위 집합을 구성하기 때문에17,,18. 더 중요한 것은, 호중구는 또한 LRRK2 및 그 하위 상태 Rab10의 높은 단백질 발현 수준을 가지고있다(도 1)16. 대조적으로, PBMC의 풀을 구성하는 백혈구의 나머지 하위 집합은 LRRK2 및 Rab10의 가변적이고 주로 낮은 표현으로 이질적이다. 단핵구 및 수지상 세포는 발현 수준이 높지만 전반적으로풍부도 16이낮습니다.
우리는 EDTA vacutainer 혈액 수집 튜브의 사용을 권장하는 동안, EDTA 이외의 항응고제를 사용할 수 있습니다. 그러나, EDTA의 존재는 호중구 절연 키트의 성능을 위해 중요하다. 따라서 대체 항응고제를 사용하더라도 1 mM EDTA의 최종 농도에 도달하도록 전체 혈액 샘플에 EDTA를 추가하는 것이 좋습니다. 호중구 절연 키트의 사용은 상대적으로 빠르고 쉬운 방법으로 면역 자기 음성 선택에 의해 인간의 전혈에서 직접 호중구를 정화 할 수 있습니다. 사용 가능한 자석의 수는 병렬로 처리 될 수있는 혈액 샘플의 수를 결정합니다. 6개의 자석을 사용하여 최대 6개의 혈액 샘플에서 호중구를 병렬로 분리하는 것이 쉽게 가능합니다. 잠재적인 단점은 상업용 호중구 절연 키트 및 필요한 자석에 대한 관련 비용입니다. 전혈로부터 호중구 격리에 대한 대체 방법이 설명되고 상당한 단점이 있는 밀도 구배 분리 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의존한다. 전자는 훨씬 더 많은 시간과 노동 집약적이며 적어도 우리의 손에는 안정적이고 효율적이지 않습니다. 후자는 FACS 기계를 요구하고 추가 취급 단계는 적혈구와 세포 염색의 고갈을 포함하여, 세포 격리 프로세스에 시간을 추가하는 것을 포함하여 소개될 필요가 있을 것입니다. 전반적으로, 면역 자기 격리는 빠르고, 매우 순수한 샘플을 생성하고, 세포의 과도한 취급을 방지한다. 샘플 처리와 관련하여, 우리는 이전에 적어도 24 시간의 혈액 수집과 호중구 격리 사이의 지연이 미래의 임상 착취에 대한 유연성을 제공하는 우리의 분석법의 결과에 상당한 변화 또는 변화를 초래하지 않는다는 것을 보여주었다11.
호중구 격리 절차 자체는 매우 쉽습니다. 매 번 사용하기 전에 마그네틱 비드를 소용돌이치게 하는 것이 좋습니다. 또한 자석 구슬의 난기류와 이탈을 피하기 위해 튜브가 자석 내부에 있으면 자석을 방해하지 않는 것이 중요합니다. 호중구는 모든 원치 않는 세포의 면역 자기 제거의 여러 라운드에 의해 현탁액에서 농축되고있다. 자석과 접촉하는 튜브의 측면을 만지지 않도록주의해야하며, 튜브의 바닥에 적혈구를 교란하지 않도록 격리의 첫 번째 라운드 (단계 2.11) 동안. 농축 된 세포 현탁액을 새로운 원엽 튜브 (단계 2.24)로 파이펫팅의 최종 라운드 후, 호중구는 즉시 이후 처리를 위해 사용할 수 있습니다. 호중구가 세포에서 LRRK2 활성을 평가하는 데 사용되는 경우, 호중구는 두 개의 배치로 분할되고 원심분리에 의해 펠릿화 된 후, LRRK2 키나아제 억제제 (여기, MLi-2) 또는 DMSO 세포 배양 배지를 함유하는 DMSO에서 재중단됩니다. LRRK2 키나아제 억제가 없는 상태에서의 탈포스포릴화 및 리포스포릴레이션은 비교적 빠른 이벤트이기 때문에, MLi-2 처리된 호중구 분획이 LRRK2 키나아제 억제제(예를 들어, MLi-2)에 노출된 상태로 남아 있는지 확인하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 세포 가해까지 (단계 3.8-3.10).
이 프로토콜에는 15 및 50 mL 원엽 튜브를 사용하는 몇 가지 원심 분리 단계가 있습니다. 우리는 프로토콜에 표시된 원심 분리 속도를 일상적으로 사용하지만 세포의 생존 가능성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 원심 분리 속도를 최대 400 x g까지 증가시킬 수 있습니다. 이것은 이 프로토콜 도중 상급 단계를 디캔팅하고 피펫팅하는 동안 호중구 물자의 어떤 잠재적인 손실을 감소시키는 것을 도울 수 있는 약간 더 단단한 호중구 세포 펠릿 귀착됩니다. 이것은 수득된 총 단백질 포세이트의 관점에서 수율을 증가시킬 가능성이 있다. 잠재적인 관심사는 더 높은 원심 분리힘이 호중구를 활성화하고 잠재적으로 후속 분석에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 우리의 일반적인 권고는 가능한 한 부드럽게 프로토콜의 모든 단계에서 호중구를 처리하는 것입니다.
우리의 프로토콜은 호중구 용해 완충제의 일부로 매우 강력한 세린 프로테아제 억제제 DIFP (0.5 mM)를 사용합니다. DIFP는 강력한 유기 인광 신경 독소이며, 대체 화합물을 조사했지만, 용해 완충제에 첨가하는 것은 면역 블로팅에 의해 인간 호중구에서 LRRK2 대조 되는 Rab10 인산화를 분석하는 데 필수적이었습니다. 예를 들어, DIFP를 1%(w/v) SDS로 대체하는 것은 다른 연구19에서 호중구를 용해시키는 데 사용되어 왔으며 LRRK2, Rab10 및 심지어 GAPDH 로딩 제어에 대한 면역블롯팅이 신호를 산출하지 않았을 정도로 상당한 단백질 분해를 일으켰으며, 따라서 라이시스 2에 매우 강력한 프로테아제억제제(Figure2)를포함하는 것의 중요성을 강조하였다. DIFP를 덜 강력한 것으로 대체할 때, 또한 2.5 mM에서 덜 독성세린 프로테아제 억제제 PMSF, Rab10 인화는 잘 보존되었지만, 더 큰 LRRK2 단백질은 상당한 저하를겪었다(도 2C). DIFP 스톡 솔루션의 처리를 최소화하기 위해, DIFP를 함유하는 용해 버퍼는 -20°C 또는 -80°C11에서배치되고, aliquoted 및 저장될 수 있다. 정량적 면역블로팅에 의한 분석에 관해서는, 당사의 연구에 사용되는 MJFF-pRab10 항체와 같은 단일 LRRK2 인산화 랍 단백질에 대해서만 선택적인 것으로 입증된 인광특이적 항체를 사용하는 것이 가장 중요하다14.
프로토콜은 또한 최대 25 mL의 전혈의 최대 부피를 사용하여 확장 될 수 있으며, 이는 50 mL 원뿔 튜브를 보유 할 수있는 하나의 자석을 사용하여 하나의 절연 절차에서 처리 될 수있는 한계입니다. 조정이 필요한 유일한 단계는 단계 2.4 (혈액의 mL 당 격리 칵테일 50 μL 추가), 단계 2.6 및 2.12 (혈액의 mL 당 자기 비드 50 μL 추가), 그리고 3.12 단계에서 호중구 용해용액에 대한 용해 완충액의 부피의 비례 증가. 다른 모든 단계는 동일하게 유지될 수 있습니다.
요약하자면, 우리의 프로토콜은 말초 혈액으로부터 인간 호중구를 분리하는 쉽고 강력한 방법을 설명합니다. 호중구는 생체 내에서 Rab10의 LRRK2 조절 인산화의 정량화를 가능하게 하는 강력하고 특이적인 LRRK2 키나아제 억제제와 함께 또는 없이 치료될 수 있다. 이것은 LRRK2 키나아제 통로 활동에 따라 개별을 계층화하고 미래 LRRK2 키나아제 억제제 처리에서 유익할 지도 모르다 통로 과활성화를 가진 사람들을 확인하기 위해 유용할 수 있습니다. 이것은 PD, 특히 특발성 PD를 가진 사람들의 대다수에 대한 경우는 드물지만, 우리의 분석은 이미 LRRK2 키나아제 통로 활성이 아직 알려지지 않은 메커니즘15에의해 현저하게 증가하는 다른 PD 관련 유전자, VPS35 D620N에서 희귀, 이형균 돌연변이를 운반하는 개인에 성공적으로 전개되었다. 우리는 이전에 LRRK2 대조군 Rab 10 인산화 수준을 소수의 개인에서 LRRK2 G2019S 돌연변이를 운반하는 소수의 개인에서 LRRK2 키나아제 활성을 활성화하는 것으로 알려져 있으며, 우리의,분석1을 사용한 특이성 PD를11가진 대조군 및 환자와 비교할 때 유의한 차이를 감지하지 않고 약 2의 요인에 의해서만 겸손하게 조사하였다.14 이 및 추가미공개 된 데이터는 LRRK2 키나아제 활성이 아마도 정량적 면역 블롯팅을 사용하여 유의한 결과를 산출하기 위해 >3x의 증가를 필요로 한다는 것을 시사한다. 그러나, 최첨단 질량 분석 기술을 배포하는 경우 LRRK2 키나아제 경로 활성화를 검출하기 위한 감도가 증가할 수 있다.
우리는 호중구가 LRRK2 키나아제 통로 활동에 파킨슨 병 연구를 위한 귀중한 자원이고 미래 LRRK2 키나아제 억제제 처리에서 유익할 수 있는 개별을 확인하는 것을 도울 수 있다는 것을 건의합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
본 연구를 위해 혈액을 기증해 주신 건강한 자원봉사자들에게 감사드립니다. 마이클 J. 폭스 파킨슨 연구 재단(MJFF)과 폭스 바이오넷 연구 리더십(FBN)이 서면 프로토콜과 비디오에 대한 지원과 의견을 제시해 주신 것에 대해 감사드립니다. 오스트리아 비엔나 대학의 알렉산더 질프리치 교수님이 당사의 프로토콜과 협업을 테스트해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 프로젝트 (MRC PPU의 일반 관리자)에 폴 데이비스의 기여를 소중히. 우리는 또한 MRC 단백질 인산화 및 유비퀴틸화 유닛 (PPU) 즉 화학 합성 (MLi-2 합성을위한 나탈리아 슈피로), MRC PPU 시약 및 서비스 항체 정제 팀의 우수한 기술 지원을 인정합니다 (에 의해 조정됨) 힐러리 맥라우클란과 제임스 하스티). 우리는 비디오와 애니메이션을 만드는 데 도움을 비보 모션에서 Mhairi 토울러와 프레이저 머독에게 감사드립니다. 81편의 영화에서 스티브 소아브(Steve Soave)가 최종 편집에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 에스더 샘러는 스코틀랜드 수석 임상 학술 펠로우십의 지원을 받고 있으며 파킨슨 병의 영국 (K-1706)으로부터 자금을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
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