Summary
Mutasjoner i leucine rike gjenta kinase 2 genet (LRRK2) forårsake arvelig Parkinsons sykdom. Vi har utviklet en enkel og robust metode for å vurdere LRRK2-kontrollert fosforylering av Rab10 i humane perifere blodnøytrofiler. Dette kan bidra til å identifisere personer med økt LRRK2 kinase pathway aktivitet.
Abstract
Leucine rik gjenta kinase 2 (LRRK2) er det hyppigst muterte genet i arvelig Parkinsons sykdom (PD) og alle patogene LRRK2 mutasjoner resulterer i hyperaktivering av kinasefunksjonen. Her beskriver vi en enkel og robust analyse for å kvantifisere LRRK2 kinase pathway aktivitet i humane perifere blod nøytrofiler ved å måle LRRK2-kontrollert fosforylering av en av sine fysiologiske substrater, Rab10 ved threonine 73. Den immunoblotting analysen beskrevet krever et fullt selektivt og fosforspesifikt antistoff som gjenkjenner Rab10 Thr73 epitopfosforylert av LRRK2, slik som MJFF-pRab10 kanin monoklonalt antistoff. Den bruker humane perifere blod nøytrofiler, fordi perifert blod er lett tilgjengelig og nøytrofiler er en rikelig og homogen bestanddel. Viktigere, nøytrofiler uttrykker relativt høye nivåer av både LRRK2 og Rab10. En potensiell ulempe for nøytrofiler er deres høye egenserinproteaseaktivitet, som nødvendiggjør bruk av svært potente proteasehemmere som organofosfornevrotoksindiisopropylfluorfofat (DIFP) som en del av lysisbufferen. Likevel er nøytrofiler en verdifull ressurs for forskning på LRRK2 kinase pathway aktivitet in vivo og bør vurderes for inkludering i PD biorepositorisamlinger.
Introduction
Forsøk på å bremse eller stoppe Parkinsons sykdom (PD) har så langt mislyktes. Oppdagelsen av hyperaktiverende mutasjoner i leucinrike repetisjonkinase 2 (LRRK2) som forårsaker og/eller øker risikoen for PD har ført til utvikling av LRRK2 kinasehemmere1,2,3. Disse har nå inngått kliniske studier4. Den nøyaktige funksjonen til LRRK2 er uklar, men et stort fremskritt har vært identifisering av et undersett av Rab GTPase proteiner, inkludert Rab10, som de første bona fide fysiologiske substrater av LRRK2 kinase5,6,7. Viktige utfordringer i en tid med sykdomsmodifiserende terapeutiske midler er biokjemiske markører for LRRK2 kinase aktiveringsstatus og målengasjement av LRRK2 kinase hemmere.
Så langt har den viktigste farmakokinetiske markøren for LRRK2-hemmere in vivo vært en klynge av konstitutivt fosforert serinrester av LRRK2, spesielt serin 935, som blir defosforylert som svar på ulike LRRK2-hemmere8,9. Serine 935 fosforylering korrelerer imidlertid ikke med egencellulær LRRK2 kinase aktivitet fordi det ikke er direkte fosforylert av LRRK2 og er fortsatt fosforert i kinase-inaktiv LRRK210. LRRK2 kinase aktivitet korrelerer godt med autofosforylering av serin 1292, men det er i praksis ikke en egnet avlesning for endogene LRRK2 kinase aktivitet ved immunoblot analyse av hele celleekstrakter på grunn av dagens mangel på pålitelige og fosforspesifikke antistoffer for dette nettstedet10,11.
Vi har utviklet en robust og enkel analyse for å kvantifisere LRRK2 kinase pathway aktivitet i menneskelige perifere blodlegemer som måler LRRK2-kontrollert fosforylering av sitt fysiologiske målprotein Rab10 ved threonin 7311. Perifert blod er lett tilgjengelig ved veneseksjon, noe som er en lav risiko og rask prosedyre som forårsaker minimal ubehag. Vi fokuserer på humane perifere blod nøytrofiler fordi de utgjør en rikelig (37-80% av alle hvite blodlegemer) og homogen cellepopulasjon som uttrykker relativt høye nivåer av både LRRK2 og Rab1011. Videre kan perifere blod nøytrofiler isoleres raskt og effektivt ved å bruke en immunomagnetisk negativ tilnærming. For å sikre at den påfølgende observerte Rab10 fosforylering medieres av LRRK2, inkuberes hver gruppe nøytrofiler med eller uten en potent og selektiv LRRK2 kinasehemmer (vi bruker og anbefaler MLi-2)2,12. Dette etterfølges deretter av cellelyse i en buffer som inneholder proteasehemmeren diisopropylfluorofosfat (DIFP), som er nødvendig for å undertrykke den indre serinproteaseaktiviteten som er kjent for å være høy i nøytrofiler13. For den endelige analysen ved kvantitativ immunblotting anbefaler vi at du bruker MJFF-pRab10 kaninmonoklonalt antistoff som spesifikt oppdager Rab10 Thr73-fosfoepitop og ikke kryssreagerer med andre fosforerte Rab-proteiner14. Selektivitet og spesifisitet av dette antistoffet har blitt validert i overuttrykkmodeller av forskjellige Rab-proteiner og en A549 Rab10 knock-out celle linje14. Dermed måler vi forskjellen i Rab10 fosforylering hos nøytrofile lysater som har blitt behandlet med og uten en potent og selektiv LRRK2 kinasehemmer2. Alternativt kan prøver også analyseres ved andre metoder, for eksempel kvantitativ massespektrometri.
Til slutt er LRRK2-kontrollert Rab10 fosforylering en overlegen markør for LRRK2 kinase aktivitet til LRRK2 fosforylering ved serin 935 og humane perifere blod nøytrofiler er en verdifull ressurs for PD forskning på LRRK2. Vår protokoll gir en robust og enkel analyse for å avhøre LRRK2 pathway aktivitet i perifert blod nøytrofiler og tillater biokjemisk stratifisering av personer med økt LRRK2 kinase aktivitet15. Viktigere, slike individer kan ha nytte av fremtidig LRRK2 kinase hemmerbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I henhold til lokal britisk regulering utføres alle manipulasjoner og pipettering av menneskelig blod i et biologisk sikkerhetsskap i kategori 2. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med lokale etikk gjennomgang styret og alle deltakerne har gitt informert samtykke.
1. Forberedelse
- Forbered 0,1 ml EDTA Lageroppløsning 1 som inneholder 100 mM EDTA i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Forbered 60 ml EDTA Lageroppløsning 2 som inneholder 1 mM EDTA i PBS.
- Forbered lysisbufferen som inneholder 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1 % (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosfat, 5 mM natriumpyrofosfat, 0,27 M sukrose, 0,1% (v/v) β-merkaptoetanol, 1x proteasehemmer cocktail, 1 μg/ml mikrocystin-LR og 0,5 mM diisopropylfluorosfat (DIFP).
MERK: Forfatterne bruker rutinemessig et EDTA-fritt produkt, men en EDTA-inneholdende proteasehemmercocktail bør også fungere. Lysisbufferen kan gjøres på forhånd uten β-merkaptoetanol, proteasehemmere, mikrocystin-LR og DIFP, og lagres ved 4 °C til bruk. Sørg for at β-merkaptoetanol, proteasehemmere, microcystin-LR og DIFP kun tilsettes umiddelbart før bruk.
FORSIKTIG: DIFP er giftig og bør håndteres med forsiktighet i en røykhette etter lokal helse- og sikkerhetsrisikovurdering. DIFP kan legges til lysebufferen og brukes umiddelbart. Alternativt kan den komplette lysisbufferen som inneholder alle andre komponenter, inkludert DIFP, bli lagret og lagret ved -80 °C for etterfølgende bruk i minst 4 uker.
2. Nøytrofil isolasjon fra fullblod
- Samle 10 ml blod i et blodinnsamlingsrør. Bland forsiktig ved å invertere rør 7−8x.
- Overfør 10 ml blod til et 50 ml konisk rør.
- Tilsett 100 μL EDTA Stock Solution 1 i blodet. Bland forsiktig.
- Tilsett 500 μL av isolasjonscocktailen (50 μL/ml) fra det nøytrofile isolasjonssettet (Materialbord) til hele blodprøven.
- Vortex de magnetiske perlene fra nøytrofil isolasjonssett for 30 s før bruk for å resuspendere de svært fine magnetiske perlene.
- Tilsett 500 μL av de magnetiske perlene i blodprøven og bland forsiktig ved å invertere røret flere ganger.
- Inkuber ved romtemperatur (RT) i 5 min.
- Fyll røret til 50 ml med EDTA Lagerløsning 2. Bland ved å forsiktig pipetting opp og ned 2-3x.
- Plasser røret i magneten og fjern lokket for å unngå etterfølgende agitasjon av røret.
- Inkuber i 10 min på RT.
- Pipetter forsiktig den berikede cellesuspensjonen som inneholder nøytrofile i et nytt 50 ml konisk rør.
MERK: Ikke berør siden av røret som er i kontakt med magneten og unngå innsamling og perturbasjon av de røde blodlegemene nederst på røret. La ca. 10 ml av den røde blodcellesuspensjonen ligge nederst på røret. - Vortex de magnetiske perlene i 30 s før bruk og tilsett 0,5 ml av de magnetiske perlene til røret som inneholder de berikede nøytrofiler. Bland forsiktig ved å snu røret.
- Inkuber ved RT i 5 min.
- Plasser røret i magneten og fjern lokket for å unngå etterfølgende agitasjon.
- Inkuber ved RT i 5 min.
- Pipetter forsiktig den berikede cellesuspensjonen som inneholder nøytrofile i et nytt 50 ml konisk rør.
MERK: Ikke berør siden av røret som er i kontakt med magneten. La ca. 5 ml av fjæringen stå nederst på røret. - For å sikre fullstendig fjerning av magnetiske perler fra celleblandingen, plasser røret som inneholder de berikede cellene i magneten.
- Inkuber i 10 min på RT.
- Pipetter forsiktig den berikede cellesuspensjonen som nå inneholder rene nøytrofiler i et nytt 50 ml konisk rør.
MERK: Ikke berør siden av røret som er i kontakt med magneten. La ca. 5 ml av fjæringen stå nederst på røret. - Bland de isolerte cellene med 1 mM EDTA Stock Solution 2 til et endelig volum på ca. 41 ml. Pipette opp og ned for å blande.
- Del oppløsningen likt i to rør med ca. 20 ml i hvert rør.
- Sentrifuge begge rørene ved 335 x g i 5 min.
- Under denne sentrifugeringen ta MLi-2 hemmer lager (200 μM/1,000x konsentrasjon) ut av -80 °C fryser og la på RT for senere bruk.
- Umiddelbart etter sentrifugeringstrinnet og uten agitasjon av rørene, hell av supernatanten uten å forstyrre nøytrofile pellets. Resuspender hver cellepellet i 10 ml cellekulturmedier (Materialtabell) ved RT ved å forsiktig pipettere celler opp og ned 4x.
3. LRRK2 kinasehemmerbehandling av rene nøytrofiler
- Merk det ene røret "DMSO" og det andre røret "MLi-2".
- Til merket dmso-merket rør til "DMSO" tilsett 10 μL DMSO og bland forsiktig ved å pipe opp og ned 2x med en 10 ml pipette. Til merket mLi-2-merket rør tilsetter du 10 μL mLi-2-lageroppløsning (endelig konsentrasjon 200 nM) og bland forsiktig ved å pipetting opp og ned 2x med en 10 ml pipette.
- Inkuber prøvene i 30 min ved RT. Bland forsiktig ved inversjon hver 10.
- I inkubasjonsperioden fjerner du 0,5 M DIFP-bestanden fra fryseren -80 °C og legg i en røykhette på is. Fjern 1 mg/ml mikrocystin-LR-lageroppløsning fra fryseren -80 °C og la den stå ved RT for å tine. Ta en aliquot (0,25 ml) av lysisbufferen ut av fryseren, la den tine ved RT, og legg den på is for senere bruk.
- Forbered 1 ml cellekulturmedium som inneholder 1 μL DMSO og kall denne DMSO-resuspensionsbufferen. Forbered 1 ml RPMI-medier som inneholder 1 μL av 200 μM MLi-2 og kall denne MLi-2 resuspensionbufferen.
- Etter 30 min inkubasjonsperiode, sentrifuge begge rørene på 335 x g i 5 min.
- Kast forsiktig supernatanten i hvert rør uten å forstyrre nøytrofile pellet.
- For DMSO-merket prøve må pelleten suspenderes forsiktig i 1 ml av DMSO-resuspensjonsbufferen og for MLi-2-merket rør, må pelleten suspenderes i 1 ml av MLi-2-resuspensjonsbufferen.
- Overfør resuspendertcellepellets til tilsvarende sentrifugeringsrør merket "DMSO" og "MLi-2" og sentrifuge begge rørene ved 335 x g i 3 min.
- Under sentrifugeringstrinnet, forberede lysisbufferen. I røykhetten tilsett forsiktig 0,25 μL av 0,5 M DIFP-oppløsning samt 0,25 μL av 1 mg/ml mikrocystin-LR til 0,25 ml lysisbufferen. Bland og la stå på is til bruk.
MERK: Legg DIFP til lysisbufferen innen 15 minutter fra cellelysis, fordi DIFP er relativt ustabil i en vandig løsning. - Umiddelbart etter sentrifugeringen fjerner du forsiktig og fjerner alle supernatantene med en pipette uten å forstyrre nøytrofilpelleten og legg rørene på isen.
- Tilsett umiddelbart 100 μL lysisbuffer som inneholder DIFP og microcystine-LR til hvert rør. Ved hjelp av en 100–200 μL pipette, må du suspendere cellepellets ved å pipe opp og ned ca. 5–10x.
- Lyse cellene på is en 10 min.
- Sentrifugerør ved 20 000 x g i 15 min ved 4 °C for å fjerne cellerester.
- Overfør "DMSO" og "MLi-2" supernatants som inneholder nøytrofile lysates til nye sentrifugeringsrør. Kast ruskpelleten.
MERK: Nøytrofile lysater er nå klare til bruk eller kan festes frosset i flytende nitrogen og lagres ved -80 °C for fremtidig analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår analyse gjør det mulig å forhøre aktiveringen av PD-assosierte LRRK2 kinase i humane perifere blod nøytrofiler med LRRK2-avhengige Rab10 fosforylering som en avlesning. Nøytrofiler er en homogen og rikelig perifer hvitblodcellepopulasjon som uttrykker høye nivåer av både LRRK2- og Rab10-proteinene (Figur 1). Den eneste andre cellepopulasjonen blant de gjenværende perifere blodmonukleære cellene (PBMCer) med høyt kopiantall av begge proteiner er monocytter, men disse utgjør bare 2–12% av hvite blodlegemer. Dette indikerer at perifere blod nøytrofiler er en mer egnet biomatrix for å studere LRRK2-kontrollert Rab10 fosforylering.
Ved isolering av perifert blod nøytrofiler fra 10 ml blod med vår prosedyre, ble det oppnådd mellom 0,5–0,75 mg total proteinlysat per donor (figur 2A), som er tilstrekkelig for et betydelig antall immunblotanalyse som bare er 10 μg per gelbane er nødvendig for. Mens kontroll av renhet og levedyktighet av celler ikke rutinemessig utføres, vi demonstrerte for tre friske donorer at renheten av isolerte nøytrofiler er mellom 94-98% og levedyktigheten til celler ~ 99% som bestemmes av flow cytometrianalyse ved hjelp av CD66b−Fluorescein isotiocyanat nøytrofil markør og 4',6-Diamidine-2'-fenylindzoldihydroklorid (DAPI) farging for levedyktighet (figur 2A).
Mens fokuset for denne publikasjonen er isolasjon og behandling av nøytrofiler fra perifert blod og ikke analysen av kvantitativ vestlig blotting, Figur 2B viser at MJFF-pRab10 monoklonalt antistoff som spesifikt oppdager Rab10 fosforylert ved threonin 73 avslørte robuste signaler i nøytrofile prøver, som ble markert undertrykt av behandling med en potent og spesifikk LRRK2 kinasehemmer, i dette tilfellet MLi-2.
Nøytrofiler inneholder høye nivåer av serine proteaser som kan påvirke påfølgende vestlig blot analyse. Mens DIFP effektivt undertrykker den høye proteaseaktiviteten hos nøytrofiler, er det et potent organofosfor nevrotoksin, og det ville være ønskelig å erstatte den med en like effektiv, men mindre giftig proteasehemmer, som fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). Vi fant at Rab10 fosforylering var like godt bevart da DIFP ble erstattet av PMSF i en konsentrasjon på 2,5 mM (figur 2C). Integriteten til LRRK2-proteinet ble imidlertid kompromittert ved bruk av PMSF sammenlignet med DIFP, noe som tyder på at det større LRRK2-proteinet er mer utsatt for nedbrytning (figur 2C).
Vi har tidligere vist at en annen PD-forårsaker genmutasjon VPS35 D620N resulterer i hyperaktivering av LRRK2 kinase med en ennå ukjent mekanisme15. Nøytrofiler fra tre personer med PD som huser en sykdomsfremkallende heterozygous VPS35 D620N mutasjon ble isolert ved hjelp av metoden som er beskrevet i denne artikkelen (Figur 3). Nøytrofile prøver fra ni friske donorer ble isolert som kontroller15. Immunoblot analyse ved hjelp av MJFF-pRab10 monoklonalt antistoff viser en betydelig, ~ 3x økning i Rab10 fosforylering ved Thr 73 i nøytrofiler fra Parkinsons pasienter med en VPS35 D620N mutasjon sammenlignet med kontrollene. Det totale Rab10-proteinuttrykket er likt i alle 12 nøytrofile prøver.
Figur 1: Overflod av LRRK2- og Rab10-proteiner i immunceller isolert fra humant blod ved hjelp av data som er offentlig tilgjengelig på immprot-databasen (http://www.immprot.org)16. Grafen viser antall proteinkopier per celle for LRRK2 og Rab10 i en rekke perifere blodimmunceller, inkludert undergrupper av T-celler, B-celler, monocytter, NK-celler, dendrittiske celler og granulocytter nøytrofiler, basofiler og eosinofiler. Dette tallet er endret fra Fan et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering og analyse av perifere allagtrofiler i perifert perifert blod og viktigheten av DIFP for forebygging av proteolytisk nedbrytning i nøytrofiler. (A) Nøytrofiler ble isolert fra hele blodet til tre friske donorer (A, B og C) som viser renhet, levedyktighet og total proteinutbytte etter cellelysis. (B) Nøytrofiler ble behandlet med eller uten LRRK2 kinasehemmer (MLi-2), deretter lysed og utsatt for kvantitativ immunblotanalyse med de angitte antistoffene via nærinfrarød (NIR) fluorescensavbildning. (C) Nøytrofiler ble isolert fra to friske donorer og behandlet med 100 nM MLi-2 i 30 min. Celler ble lysed i nærvær av enten 0,5 mM DIFP eller 2,5 mM PMSF for å blokkere serinproteaseaktivitet hos nøytrofiler. A og B har blitt endret fra Mir et al.15, mens C har blitt endret fra Fan et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Økt LRRK2 kinase pathway aktivitet hos Parkinsons sykdom pasienter som huser en heterozygeous VPS35 D620N mutasjon. Nøytrofiler ble isolert fra ni ikke-alderstilpassede friske kontroller og tre PD-pasienter med en sykdomsfremkallende heterozygous VPS35 D620N mutasjon. Cellene ble behandlet med eller uten 200 nM MLi-2 i 30 min før cellelysis. (A) Totalt 10 μg helcelleekstrakt utsatt for kvantitativ immunoblotanalyse med de angitte antistoffene via nærinfrarød (NIR) fluorescensavbildning. Immunoblots ble kvantifisert for fosfor-Thr73 Rab10:total Rab10 ratio (B). Data ble analysert av enveis ANOVA med Tukeys multisammenligningstest. Data presentert som midler ± SD; p < 0.0001. Dette tallet er endret fra Mir et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overbevisende klinisk, genetisk og biokjemisk bevis peker mot en viktig rolle for LRRK2 og spesielt kinasefunksjonen i Parkinsons sykdom7. LRRK2 kinasehemmere er utviklet og går inn i kliniske studier2,,4,12. Som sådan er det behov for å utnytte LRRK2 som en biomarkør for målengasjement samt pasientstratifisering. Vår protokoll beskriver en robust og enkel analyse for å analysere LRRK2 kinase pathway aktivering som gjenspeiles av fosforylering av sin fysiologiske substrat Rab10 i homogen pool av humane perifere blod nøytrofiler11,14. For analyse av kvantitativ immunblotting anbefaler vi på det sterkeste bruk av et svært selektivt fosforspesifikt Rab10-antistoff (MJFF-pRab10 monoklonalt antistoff)14,17.
Vi bruker humane nøytrofiler fordi de utgjør en homogen undergruppe av perifere blodceller som utgjør den dominerende leukocytterpopulasjonen17,18. Enda viktigere, nøytrofiler har også høye proteinuttrykksnivåer av LRRK2 og dens undertilstand Rab10 (Figur 1)16. I motsetning er de resterende undersidene av leukocytter som utgjør bassenget av PBMCer heterogen med variabel og overveiende lavt uttrykk for LRRK2 og Rab10. Monocytter og dendrittiske celler har høye uttrykksnivåer, men er lave i samlet overflod16.
Mens vi anbefaler bruk av EDTA vacutainer blod samling rør, en antikoagulant annet enn EDTA kan brukes. Tilstedeværelsen av EDTA er imidlertid viktig for ytelsen til det nøytrofile isolasjonssettet. Vi anbefaler derfor å legge EDTA til hele blodprøven slik at en endelig konsentrasjon på 1 mM EDTA nås selv om et alternativt antikoagulant brukes. Bruken av nøytrofilisolasjonssettet gjør det mulig å rense nøytrofiler direkte fra menneskelig fullblod ved immunmagnetisk negativt utvalg på en relativt rask og enkel måte. Antall tilgjengelige magneter bestemmer hvor mange blodprøver som kan behandles parallelt. Det er lett å isolere nøytrofiler fra opptil seks blodprøver parallelt ved hjelp av seks magneter. En potensiell ulempe er den tilknyttede kostnaden for kommersielle nøytrofile isolasjonssett og den nødvendige magneten. Alternative metoder for nøytrofil isolasjon fra fullblod har blitt beskrevet og stole på tetthet gradient separasjon eller fluorescens aktivert celle sortering (FACS), som har betydelige ulemper. Førstnevnte er betydelig mer tid og arbeidskrevende og i hvert fall i våre hender ikke så pålitelig og effektiv. Sistnevnte krever en FACS-maskin, og ytterligere håndteringstrinn må innføres, inkludert uttømming av røde blodlegemer og cellefarging, og legger tid til celleisolasjonsprosessen. Samlet sett er immunomagnetisk isolasjon rask, genererer en svært ren prøve, og unngår overdreven håndtering av cellene. Når det gjelder prøvebehandling, har vi tidligere vist at en forsinkelse mellom blodinnsamling og nøytrofil isolering på minst opptil 24 timer ikke resulterer i en betydelig endring eller variasjon i utfallet av vår analyse, noe som gir fleksibilitet for fremtidig klinisk utnyttelse11.
Den nøytrofile isolasjonsprosedyren i seg selv er veldig enkelt. Vi anbefaler å vortexing de magnetiske perlene før hver bruk. Det er også viktig å ikke forstyrre magneten når røret er inne i magneten for å unngå turbulens og oppløsning av de magnetiske perlene. Nøytrofiler blir beriket i suspensjon av flere runder med immunomagnetisk fjerning av alle uønskede celler. Det bør tas hensyn til at du ikke berører siden av røret som er i kontakt med magneten og i løpet av den første isolasjonsrunden (trinn 2.11) for ikke å perturb de røde blodlegemene nederst på røret. Etter den siste runden med pipettering av den berikede cellesuspensjonen i et nytt konisk rør (trinn 2.24), nøytrofiler er umiddelbart tilgjengelige for videre behandling. Hvis nøytrofiler brukes til å vurdere LRRK2-aktivitet i celler, deles nøytrofiler deretter i to grupper og etter pelleting av sentrifugering, resuspendert i enten en LRRK2 kinasehemmer (her MLi-2) eller DMSO som inneholder cellekulturmedium. Da dephosphorylation i nærvær og rephosfatning i fravær av LRRK2 kinase hemming er relativt raske hendelser, må det utvises forsiktighet for å sikre at den MLi-2 behandlede nøytrofile fraksjonen forblir utsatt for en LRRK2 kinasehemmer (f.eks. MLi-2) opp til cellelysis (trinn 3,8–3,10).
Det er flere sentrifugeringstrinn i denne protokollen ved hjelp av 15 og 50 ml koniske rør. Mens vi rutinemessig bruker de angitte sentrifugeringshastighetene i protokollen, er det mulig å øke sentrifugeringshastigheten opp til 400 x g uten å påvirke levedyktigheten til cellene negativt. Dette resulterer i en litt fastere nøytrofil celle pellet som kan bidra til å redusere eventuelle tap av nøytrofilmateriale under dekantering og pipettering av supernatant trinnene under denne protokollen. Dette vil sannsynligvis øke utbyttet når det gjelder total protein lysat oppnådd. En potensiell bekymring er at en høyere sentrifugeringskraft kan aktivere nøytrofiler og potensielt påvirke etterfølgende analyser. Vår generelle anbefaling er å håndtere nøytrofiler under hvert trinn i protokollen så forsiktig som mulig.
Vår protokoll bruker den svært potente serinproteasehemmeren DIFP (0,5 mM) som en del av nøytrofillysisbufferen. DIFP er et potent organofosfor nevrotoksin, og mens vi har undersøkt alternative forbindelser, var tillegg til lysisbufferen avgjørende for analysen av LRRK2-kontrollert Rab10 fosforylering hos humane nøytrofiler ved immunblotting. For eksempel, erstatte DIFP med 1% (w / v) SDS har blitt brukt til å lyse nøytrofiler i andre studier19 og førte til betydelig protein nedbrytning i den grad at immunblotting for LRRK2, Rab10, og selv GAPDH lasting kontroll ikke gir et signal, og dermed fremhever viktigheten av å inkludere en svært potent protease hemmer i lysis buffer (Figur 2C). Ved utskifting av DIFP med mindre potent, men også mindre giftig serinproteasehemmer PMSF ved 2,5 mM, ble Rab10-fosporylering godt bevart, men det større LRRK2-proteinet gjennomgikk betydelig nedbrytning (figur 2C). For å minimere håndteringen av DIFP-lagerløsningen kan lysisbuffer som inneholder DIFP tilberedes i grupper, iblant sitert og lagret ved -20 °C eller -80 °C11. Når det gjelder analysen av kvantitativt immunblotting, er det avgjørende å bruke et fosforspesifikt antistoff som har vist seg å være selektivt for bare et enkelt LRRK2 fosforylert Rab-protein, slik som MJFF-pRab10-antistoffet som brukes til våre studier14.
Protokollen kan også skaleres opp ved hjelp av et maksimalt volum av fullblod på opptil 25 ml, som er grensen som kan behandles i en isolasjonsprosedyre ved hjelp av en magnet, som er i stand til å holde 50 ml koniske rør. De eneste trinnene som trenger justeringer er trinn 2,4 (tilsetning av 50 μL isolasjonscocktail per ml blod), trinn 2,6 og 2,12 (tilsetning av 50 μL magnetiske perler per ml blod), og en forholdsmessig økning i volumet av lysisbuffer for nøytrofil lysis i trinn 3.12. Alle andre trinn kan holdes identiske.
Oppsummert beskriver vår protokoll en enkel og robust metode for å isolere menneskelige nøytrofiler fra perifert blod. Nøytrofiler kan deretter behandles med og uten en potent og spesifikk LRRK2 kinasehemmer for å muliggjøre kvantifisering av LRRK2-kontrollert fosforylering av Rab10 in vivo. Dette kan være nyttig for stratifiserende individer i henhold til LRRK2 kinase pathway aktivitet og for å identifisere de med pathway hyperaktivering som kan ha nytte av fremtidig LRRK2 kinase hemmer behandling. Selv om dette vil være usannsynlig tilfelle for de fleste mennesker med PD, spesielt idiopatisk PD, vår analyse har allerede blitt vellykket utplassert i personer som bærer en sjelden, heterozygous mutasjon i et annet PD-assosiert gen, VPS35 D620N, hvor LRRK2 kinase pathway aktivitet er betydelig økt med en ennå ukjent mekanisme15. Vi hadde tidligere undersøkt LRRK2-kontrollerte Rab 10 fosforyleringsnivåer hos et lite antall individer som bærer den mer vanlige LRRK2 G2019S mutasjonen som er kjent for å aktivere LRRK2 kinase aktivitet bare beskjedent med en faktor på rundt to uten å oppdage en betydelig forskjell sammenlignet med kontroller og pasienter med idiopatisk PD med vår analyse11,14. Dette og ytterligere upubliserte data tyder på at LRRK2 kinase aktivitet sannsynligvis krever en økning på > 3x for å gi et betydelig resultat ved hjelp av kvantitativ immunblotting. Følsomheten for å oppdage LRRK2 kinase pathway aktivering kan trolig økes hvis du distribuerer toppmoderne massespektrometri teknologi.
Vi foreslår at nøytrofiler er en verdifull ressurs for Parkinsons sykdom forskning på LRRK2 kinase pathway aktivitet og kan bidra til å identifisere personer som kan ha nytte av fremtidig LRRK2 kinase hemmerbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker de friske frivillige som vennligst donerte blod til den nåværende studien. Vi takker Michael J. Fox Foundation for Parkinsons Research (MJFF) og Fox BioNet-studieledelsen (FBN) for deres støtte og innspill til den skriftlige protokollen og videoen. Vi takker professor Alexander Zimprich fra Universitetet i Wien i Østerrike for å teste vår protokoll og samarbeid. Vi verdsetter bidragene fra Paul Davies til prosjektet (daglig leder av MRC PPU). Vi anerkjenner også den utmerkede tekniske støtten til MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit (PPU), nemlig kjemisk syntese (Natalia Shpiro for syntesing av MLi-2), MRC PPU Reagenser og tjenester antistoffrenseteam (koordinert av Hilary McLauchlan og James Hastie). Vi takker Mhairi Towler og Fraser Murdoch fra Vivomotion for deres hjelp med å lage videoer og animasjoner. Vi takker Steve Soave fra 81 filmer for å få hjelp med de endelige redigerte. Esther Sammler støttes av en skotsk Senior Clinical Academic Fellowship og har mottatt støtte fra Parkinsons UK (K-1706).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
