Summary
यह लेख बटेर और चिकन भ्रूण है कि पूर्व vivo chimeric अंगों फार्म के लिए संयुक्त किया जा सकता से शुद्ध भ्रूण के ऊतकों को अलग करने के लिए एक विधि प्रदान करता है ।
Abstract
भ्रूण के ऊतकों को अलग करने की क्षमता बटेर-चिकन कल्पना प्रणाली है, जो बारी में विकास जीव विज्ञान में प्रमुख प्रक्रियाओं का अनावरण करने के लिए निर्विवाद योगदान प्रदान की है की स्थापना के लिए एक आवश्यक कदम था ।
इस के साथ साथ microsurgery और एंजाइमी पाचन द्वारा बटेर और मुर्गियों से भ्रूण के ऊतकों को अलग करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन किया है, जबकि इसके जैविक गुणों के संरक्षण । अलगाव के बाद, दोनों प्रजातियों के ऊतकों में एक में जुड़े है इन विट्रो organotypic परख के लिए ४८ h. बटेर और चिकन के ऊतकों को अलग परमाणु सुविधाओं और आणविक मार्करों के बीच सेलुलर पार बात के अध्ययन की अनुमति द्वारा भेदभाव किया जा सकता है ऊतकों के heterospecific एसोसिएशन । इस दृष्टिकोण है, इसलिए, ग्रसनी morphogenesis और अग्रांत्र के गठन के दौरान होने वाले उन के रूप में अत्यधिक गतिशील स्थानिक संशोधनों के साथ विकासात्मक प्रक्रियाओं में जटिल ऊतक बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है अन्तः-व्युत्पंन अंगों । इस प्रायोगिक दृष्टिकोण सबसे पहले थाइमस गठन के प्रारंभिक चरणों के दौरान उपकला-mesenchymal बातचीत का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था. इस में, अन्तः भावी thymic और मध्य त्वक स्तर-व्युत्पंन mesenchyme व्युत्पंन, बटेर और चिकन भ्रूण, क्रमशः से अलग किया गया ।
अंगों को उत्पन्न करने के लिए संबद्ध ऊतकों की क्षमता आगे उन्हें एक चिकन भ्रूण के chorioallantoic झिल्ली (सांचा) पर भ्रष्टाचार द्वारा परीक्षण किया जा सकता है । कैम पोषक तत्वों प्रदान करता है और explanted ऊतकों को गैस एक्सचेंजों की अनुमति देता है । ovo के विकास में 10 दिनों के बाद, chimeric अंगों को पारंपरिक रूपात्मक विधियों द्वारा काटा explants में विश्लेषण किया जा सकता है । यह प्रक्रिया भी अंग गठन के दौरान ऊतक विशिष्ट योगदान का अध्ययन करने की अनुमति देता है, अपने प्रारंभिक विकास से (इन विट्रो विकास) organogenesis के अंतिम चरणों (ovo विकास में) ।
अंत में, बेहतर अलगाव विधि भी प्रदान करता है तीन आयामी (3 डी) संरक्षित भ्रूण के ऊतकों, कि भी ऊतक के उच्च संकल्प स्थलाकृतिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता विशिष्ट जीन-अभिव्यक्ति पैटर्न.
Introduction
1970 के दशक में, एक सुरुचिपूर्ण बटेर-चिकन कल्पना प्रणाली Le Douarin द्वारा विकसित किया गया था, नए रास्ते खोलने के लिए सेल प्रवासन और सेलुलर बातचीत के विकास के दौरान की भूमिका को समझने के लिए1,2. मॉडल आधार है कि दो प्रजातियों के बीच सेल विनिमय काफी embryogenesis परेशान नहीं होता पर तैयार किया गया था, बाद में जब कई विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल की पुष्टि की, तंत्रिका और टेम के गठन सहित सिस्टम1. एक उदाहरण के रूप में उत्तरार्द्ध ले रही है, टेम progenitors बस्तियां thymic उपकला रुडी के चक्रीय तरंगों पहली बार बटेर का उपयोग कर मनाया गया था-चिकन कल्पना प्रणाली3. उस के लिए, थाइमस के संभावित क्षेत्र, तीसरे और चौथे ग्रसनी पाउच (3/4PP) के अन्तः, यांत्रिक और enzymatically बटेर से अलग कर दिया गया था (क्यू) 15 से 30-somite चरण [भ्रूण दिवस (ई) १.५ में भ्रूण-ई 2.5] । इन चरणों चिकन हैमबर्गर और हैमिल्टन4 (एचएच) के अनुरूप-चरणों 12-17 । trypsin के उपयोग से शुरू की गई अलगाव प्रक्रियाएं अन्तः को संलग्न mesenchyme से enzymatically अलग कर देना । अलग अन्तः एक मेजबान चिकन के somatopleura क्षेत्र में भ्रष्टाचार किया गया था (सी) E3 पर भ्रूण-e 3.5 (एचएच-20-21 चरणों) । इस heterologous mesenchyme "स्वतंत्र" thymic उपकला विकास भी अंग गठन3के लिए योगदान करने के लिए माना जाता था. इसके बाद, चिकन मेजबान रक्त जनित जनक कोशिकाओं के क्रमिक तरंगों बटेर दाता thymic उपकला समकक्ष मेजबान भ्रूण3में थाइमस गठन के लिए योगदान घुसपैठ ।
हाल ही में, इस दृष्टिकोण का एक संशोधित संस्करण भी थाइमस गठन5के प्रारंभिक चरणों के दौरान उपकला-mesenchymal बातचीत के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण साबित हो गया था । इस संबंध में, chimeric भ्रूण3 में अस्थानिक थाइमस के गठन में शामिल ऊतकों अलग थे, दोनों दाता और मेजबान भ्रूण से, और संबद्ध पूर्व vivo । एक बेहतर प्रोटोकॉल के लिए बटेर 3/4PP अन्तः (ई 2.5-e3) और चिकन somatopleura मध्य त्वक स्तर (ई 2.5-e3) को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । संक्षेप में, भ्रूण के ऊतकों microsurgery द्वारा अलग किया गया था और के अधीन इन विट्रो pancreatin पाचन । इसके अलावा, एंजाइमी पाचन, तापमान और समय की गर्मी की स्थिति ऊतक के अनुसार अनुकूलित-प्रकार और विकासात्मक चरण (तालिका 1) थे ।
अगले, अलग ऊतक एक organotypic में ४८ एच के लिए इन विट्रो प्रणाली में जुड़े थे, के रूप में पहले5,6की सूचना दी । ऊतकों के इन विट्रो एसोसिएशन में स्थानीय सेलुलर बातचीत भ्रूण की नकल, vivo हेरफेर में से कुछ प्रतिबंध पर काबू पाने. यह प्रणाली विशेष रूप से जटिल morphogenic घटनाओं में सेलुलर बातचीत, जैसे ग्रसनी तंत्र के विकास के अध्ययन के लिए उपयोगी है ।
थाइमस histogenesis में प्रत्येक ऊतक के योगदान, के रूप में अच्छी तरह के रूप में heterospecific एसोसिएशन की क्षमता के लिए एक थाइमस उत्पंन आगे सांचा पद्धति का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है, पहले विस्तृत5,7,8। संक्षेप में, प्रसंस्कृत ऊतकों cE8 भ्रूण के सांचा पर भ्रष्टाचार कर रहे थे और 10 दिनों के लिए ovo में विकसित करने की अनुमति दी । फिर, थाइमस गठन रूपात्मक विश्लेषण द्वारा काटा explants में मूल्यांकन किया गया था । के रूप में शास्त्रीय बटेर-चिकन अध्ययन3, बटेर thymic उपकला टेम जनक कोशिकाओं (HPCs) चिकन भ्रूण है, जो बाद में अंग विकास9,10 में योगदान दिखाया गया से व्युत्पंन द्वारा बृहदांत्र था . HPCs उच्च संवहनी सांचा5,7,8के माध्यम से अस्थानिक chimeric थाइमस के लिए भ्रूण से चले गए । बटेर व्युत्पंन thymic उपकला प्रजातियों का उपयोग immunohistochemistry द्वारा पहचाना जा सकता है विशिष्ट एंटीबॉडी (यानी, QCPN-मॉब बटेर PeriNuclear), ऊतक विशिष्ट आणविक मार्करों के लिए की जरूरत पर काबू पाने ।
इस प्रायोगिक विधि, दो कदम दृष्टिकोण के रूप में पिछले8प्रकाशन में रिपोर्ट, औषधीय एजेंटों के नियमित प्रशासन द्वारा संकेत रास्ते के मॉडुलन में इन विट्रो में और ovo विकास के दौरान अनुमति देता है । इसके अलावा, explants प्रयोग8के पाठ्यक्रम के किसी भी समय-बिंदु पर काटा जा सकता है ।
अंत में, अलगाव प्रोटोकॉल यहां विस्तृत प्राकृतिक गुणों और भ्रूण के ऊतकों की 3d वास्तुकला के संरक्षण की अनुमति देता है, विशेष रूप से सीटू जीन में विस्तार करने के लिए उपयोगी-भ्रूण क्षेत्रों के अभिव्यक्ति पैटर्न अंयथा द्वारा दुर्गम पारंपरिक तरीकों । इसके अलावा, आरएनए-seq या microarrays सहित transcriptome विश्लेषण दृष्टिकोण, एक ऊतक विशिष्ट उच्च प्रवाह "ओमिक्स" विश्लेषण प्रदान करते हुए आनुवंशिक मार्कर की आवश्यकता के बिना भी अलग ऊतकों में लागू किया जा सकता है.
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Protocol
इन सभी प्रयोगों Centro Académico de Medicina de Lisboa के पशु देखभाल और नैतिक दिशा निर्देशों का पालन करें ।
1. निषेचित बटेर और चिकन अंडे की मशीन
- 3 दिनों के लिए एक ३८ डिग्री सेल्सियस humidified मशीन में जापानी बटेर (Coturnix Coturnix बिही) के निषेचित अंडे प्लेस । अंडे की मशीन (अंडा कुंद अंत) हवा चैंबर में सामना करना पड़ ।
नोट: humidified पर्यावरण मशीन के तल पर एक पानी कंटेनर रखकर हासिल की है । - एक ३८ डिग्री सेल्सियस humidified मशीन में २.५ दिनों के लिए चिकन के निषेचित अंडे (गैलस गैलस) की मशीन । एक क्षैतिज स्थिति में अंडे की मशीन और ऊपरी लकड़ी का कोयला का एक टुकड़ा का उपयोग कर भ्रूण स्थान की पहचान के निशान ।
नोट: ४० बटेर अंडे और ६० चिकन अंडे के साथ शुरू जब इस प्रयोग की स्थापना ।
2. thymic रुडी के भावी डोमेन युक्त बटेर अन्तः का अलगाव
नोट: बाँझ स्थितियों में अंडा हेरफेर प्रक्रियाओं के लिए एक क्षैतिज लामिना प्रवाह हूड और निष्फल उपकरणों और सामग्री का उपयोग करें ।
- भ्रूण thymic के प्रकल्पित क्षेत्र से युक्त क्षेत्र निकालें, ग्रसनी आर्क 3rd और 4वें मेहराब (3/4PAR) युक्त क्षेत्र,7,8वर्णित के रूप में ।
- एक बड़ा borosilicate ग्लास बाउल भरें (१०० मिमी x ५० मिमी; १०० सेमी3) कोल्ड फॉस्फेट-बफर खारा समाधान (पंजाब) के ६० मिलीलीटर के साथ ।
- घुमावदार कैंची की मदद से, नल और एक बटेर अंडे कि 3 दिनों के लिए मशीन किया गया है के खोल में एक परिपत्र छेद में कटौती । अंडा कुंद के विपरीत पक्ष पर छेद बनाओ और जर्दी (भ्रूण के साथ) ठंडे पंजाबियों के साथ कटोरा को हस्तांतरण ।
- vitelline झिल्ली बाहरी रूप से अतिरिक्त भ्रूण घुमावदार कैंची का उपयोग करने के लिए जहाजों को काटने के द्वारा जर्दी से भ्रूण निकालें ।
- पतली संदंश की मदद से, भ्रूण को एक छोटी कटोरी (६० मिमी x 30 मिमी; 15 सेमी3) ठंडे पंजाबियों के 10 मिलीलीटर से भरा स्थानांतरण ।
- एक स्किमर के साथ, एक काले आधार के साथ एक १०० mm पेट्री डिश के लिए भ्रूण हटो ( सामग्री की मेजदेखें) ठंड पंजाबियों की 10 मिलीलीटर युक्त है और यह एक stereomicroscope के तहत जगह है ।
- काटना 3/4PAR, के रूप में पहले8वर्णित है ।
- महाप्राण 3/4PAR और एक गिलास पकवान तीन-ठंडे पंजाबियों के साथ भरा क्वार्टर एक 2 मिलीलीटर बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए स्थानांतरण ।
- अन्तः के साथ पाचन एंजाइमी द्वारा thymic के प्रकल्पित क्षेत्र (3/4PP pancreatin) से युक्त अन्तः को अलग ।
- रंग और पतले संदंश की मदद से, 3/4PAR को एक ग्लास डिश में ट्रांसफर करें तीन-चौथाई कोल्ड pancreatin से भरे हुए (8 मिलीग्राम/एमएल; 1:3 कमजोर पड़ने के साथ 25 मिलीग्राम/
- एंजाइमी पाचन के लिए बर्फ पर 1 एच के लिए मशीन ।
नोट: एंजाइमी पाचन के समय विकास (तालिका 1) के चरण का निर्भर करता है । - 3/4PAR से अन्तः को अलग करने के लिए stereomicroscope (40x-60x आवर्धन) के नीचे ग् डिश लगाएं ।
नोट: इस प्रक्रिया के दौरान सभी सतहों और समाधान ठंडा रखें । एक नया शीत pancreatin समाधान के लिए बदल अगर एक लंबे समय लेने के लिए ऊतकों काटना (> 15 मिनट) । एक रोशनी स्रोत के रूप में, एलईडी stereomicroscope में या ऑप्टिक फाइबर में शामिल रोशनी का उपयोग करें, सीमित गर्मी लोड पर विचार । - आसपास के ऊतकों से अन्तः को अलग करने के लिए, पिन धारकों में दो स्टेनलेस स्टील microscalpels का उपयोग करें ।
नोट: का प्रयोग करें microscalpels के बीच एक व्यास के साथ ०.१ mm और ०.२ mm और निकेल पिन धारकों के साथ एक जबड़ा खोलने के व्यास के साथ 0 मिमी 1 मिमी ।- सबसे पहले तंत्रिका ट्यूब और ग्रसनी अन्तः की पृष्ठीय सतह से जुड़ी मध्य त्वक स्तर निकालें ।
- ऊपर पृष्ठीय पक्ष के साथ, ध्यान से अलग और ग्रसनी मेहराब के बीच mesenchyme को हटाने और ग्रसनी पाउच बेनकाब । 3/4PAR के दोनों किनारों पर इस कार्यविधि को निष्पादित करें ।
- दिल ट्यूब और पूर्वकाल पाउच आसपास mesenchyme निकालें ।
- ventral पक्ष के साथ, 2एन डी और 3आरडी ग्रसनी मेहराब के बाह्य त्वक स्तर काट और ध्यान से पाउच से जुड़ी mesenchyme को दूर । इस कार्यविधि को 3/4PAR के दूसरी ओर दोहराएं । इस स्तर पर थायरॉयड रुडी दिखाई जानी चाहिए ।
- दो microscalpels के साथ ग्रसनी अन्तः से जुड़ी हुई शेष mesenchymal कोशिकाओं को हटा दें ।
- 2एन डी और 3आरडी पीपी के बीच एक आड़ा कट बनाओ, dissociating ग्रसनी अन्तः युक्त 3rd और 4गु पाउच अन्तः के पूर्वकाल भाग से थायराइड रुडी और 2एन डी होने ग्रसनी थैली ।
- रंग और पतली संदंश की मदद से, अलग 3/4PP अन्तः एक ग्लास डिश तीन-१००% ठंडा भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) से भरा क्वार्टर स्थानांतरण ।
- इन विट्रो परख की तैयारी के दौरान बर्फ पर अलग-थलग ऊतकों के साथ ग्लास डिश रखें । वैकल्पिक रूप से, अलग ऊतक तीन आयामी हो सकता है संरक्षित और सीटू में जीन अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया ।
3. चिकन somatopleura मध्य त्वक स्तर का अलगाव
नोट: एक क्षैतिज लामिना प्रवाह हूड और निष्फल उपकरणों और सामग्री का उपयोग कर बाँझ स्थितियों में अंडा हेरफेर प्रक्रियाओं प्रदर्शन.
- somites 19-24 (ss19-24) के स्तर पर somatopleura मध्य त्वक स्तर युक्त भ्रूण क्षेत्र निकालें ।
- मशीन से चिकन अंडे निकालें मशीन के २.५ दिनों के बाद ।
- घुमावदार कैंची के साथ, खोल में एक छोटा सा छेद खोलें । एक सुई डालें और अंडे के अंदर एल्ब्युमिन मात्रा को कम करने के लिए एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के साथ एल्ब्युमिन के 2 मिलीलीटर महाप्राण और भ्रूण की क्षति को रोकने (शेल के चिह्नित क्षेत्र के नीचे स्थित) । aspirated एल्ब्युमिन को त्यागें ।
- घुमावदार कैंची का उपयोग शेल के चिह्नित क्षेत्र में एक परिपत्र छेद (शीर्ष सतह क्षेत्र के दो तिहाई करने के लिए) में कटौती ।
- पतली संदंश के साथ भ्रूण पकड़े जबकि extraembryonic जहाजों के लिए बाह्य vitelline झिल्ली में कटौती ।
- एक stereomicroscope के तहत, ठंडे पंजाबियों के 10 मिलीलीटर युक्त एक काले आधार के साथ एक १०० मिमी पेट्री डिश में भ्रूण प्लेस ।
नोट: microsurgery प्रक्रियाओं के प्रगतिशील आवर्धन के लिए इस बिंदु से आगे एक stereomicroscope का उपयोग करें । - चार पतली कीट पिन का उपयोग करने के लिए थाली के नीचे भ्रूण पकड़ । एक चौकोर आकार बनाने extraembryonic क्षेत्र में पिन रखें ।
- somites 19 और 24 transversely के बीच भ्रूण धुरी के लिए दो कटौती प्रदर्शन और सभी भ्रूण क्षेत्र को पार, wecker नेत्र कैंची का उपयोग कर ।
- भ्रूण धारा, ss19-24, सीमांत भ्रूण किनारों को काटने से रिलीज ।
- महाप्राण ss19-24 ऊतकों और एक गिलास पकवान तीन-ठंडे पंजाबियों एक 2 मिलीलीटर बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग कर के साथ भरा तिमाहियों को हस्तांतरण ।
- pancreatin के साथ पाचन एंजाइमी द्वारा somatopleura क्षेत्र (ss19-24) से पार्श्व मध्य त्वक स्तर को अलग (8 मिलीग्राम/एमएल; 1:3 कमजोर पड़ने के साथ 25 मिलीग्राम/
- रंग और पतले संदंश की मदद से, ss19-24 ऊतकों को एक ग्लास डिश थ्री-क्वार्टर कोल्ड pancreatin सॉल्यूशन से भरा हुआ ट्रांसफर करें ।
- एंजाइमी पाचन के लिए बर्फ पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
- stereomicroscope के तहत, एक धारक में दो microscalpels का उपयोग आसपास के ऊतकों से मध्य त्वक स्तर को अलग ।
नोट: इस प्रक्रिया के दौरान सभी सतहों और समाधान ठंडा रखें । एक नया ठंडा pancreatin समाधान के लिए बदलें अगर एक लंबे समय लेने के ऊतकों काटना (> 10 मिनट.) । एक रोशनी स्रोत के रूप में, एलईडी stereomicroscope में या ऑप्टिक फाइबर में शामिल रोशनी का उपयोग करें, सीमित गर्मी लोड पर विचार । - मध्य त्वक स्तर अलगाव के दौरान, पहले ventrally स्थित splancnopleura ऊतकों की सावधान टुकड़ी के बाद सतह पर बाह्य त्वक स्तर निकालें ।
- यह तंत्रिका ट्यूब के लिए एक समानांतर गति में कटौती से somatopleura के सही पार्श्व मध्य त्वक स्तर जारी.
- भ्रूण के बाईं ओर के मध्य त्वक स्तर जुदाई दोहराएं ।
नोट: इस प्रक्रिया के दौरान धीमी microscalpel आंदोलनों बनाओ । उजागर अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन ऊतकों और द्रव आंदोलनों को रोकने के उपकरणों के लिए छड़ी । - रंग और पतली संदंश की मदद से एक गिलास पकवान तीन-ठंड FBS से भरा तिमाहियों के लिए अलग मध्य त्वक स्तर हस्तांतरण ।
- इन विट्रो परख की तैयारी के दौरान बर्फ पर अलग-थलग ऊतकों के साथ ग्लास डिश रखें ।
4. इन विट्रो organotypic परख: heterospecific के बटेर 3/4PP अन्तः और चिकन somatopleura मध्य त्वक स्तर
- RPMI के साथ संस्कृति माध्यम तैयार-१६४० मध्यम 10% FBS और 1% कलम/Strep3,5के साथ पूरक ।
- कल्चरल मीडियम के 5 एमएल वाले ३५ एमएम पेट्री डिश में मेटल ग्रिड लगाएं ।
नोट: ग्रिड के शीर्ष के साथ मध्यम सतह के स्तर के लिए तरल की अधिकता निकालें । - पतली संदंश की मदद से, संस्कृति माध्यम में एक झिल्ली फिल्टर डुबकी और फिर यह ग्रिड के शीर्ष पर जगह के लिए हवा के साथ संपर्क में एक सतह है ।
नोट: झिल्ली क्षेत्र के एक चौथाई (13 मिमी व्यास के साथ) ऊतक एसोसिएशन के लिए पर्याप्त है । - stereomicroscope के तहत, झिल्ली फ़िल्टर के शीर्ष पर अलग ऊतक सहयोगी । पहले एक प्रत्यारोपण चंमच (या रंग) और पतली संदंश की मदद से कोमल फिसलने से ग्लास डिश से 3/4PP अन्तः (चरण 2) स्थानांतरण । अलग मध्य त्वक स्तर (चरण 3) के लिए इस कार्यविधि को दोहराएँ ।
नोट: एक microscalpel की मदद से, अपने संघ को अधिकतम करने के लिए ऊतकों को मिलाएं । - ध्यान से एक humidified मशीन में संबद्ध ऊतकों प्लेस ३७ ° c के साथ 5% सह2 ४८ के लिए ज. प्रसंस्कृत ऊतकों chorioallantoic झिल्ली (सांचा) पर भ्रष्टाचार किया जा सकता है ।
नोट: कैम में अस्थानिक अंग गठन पहले8विस्तृत किया गया था.
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Representative Results
प्रोटोकॉल एक विधि के लिए एवियन भ्रूण के ऊतकों को अलग करने के लिए कई सेलुलर और विकासात्मक जीवविज्ञान तकनीकी दृष्टिकोण में इस्तेमाल किया जा विवरण । इस विधि पहले थाइमस गठन5के प्रारंभिक चरणों के दौरान उपकला-mesenchymal बातचीत का अध्ययन करने के लिए कार्यरत था. साथ ही, नए परिणाम चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाए जाते हैं, समान दृष्टिकोण का उपयोग कर ।
चित्रा 1 . तीन-आयामी संरक्षित ग्रसनी अन्तः के जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के प्रतिनिधि परिणाम थाइमस रुडी केप्रकल्पित क्षेत्र युक्त. ग्रसनी तंत्र और अलग 2PP, 3PP और 4PP युक्त अन्तः के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (ce 3.5 या qE3 पर) (ए) । पूरे-BMP7 के साथ सीटू संकरण में माउंट (बी) और ध्वनि हेज हॉग (सी) अलग अन्तः के ce 3.5 पर. BMP7 और ध्वनि हेज हॉग के मजबूत संकरण संकेतों क्रमशः 2PP और 3PP (बी) और केंद्रीय ग्रसनी (सी) के अन्तः में सफेद ऐरोहेड द्वारा बताया । एक, पूर्वकाल; cE, चिकन भ्रूण दिवस; L, वाम; P, पीछे; पीपी, ग्रसनी थैली; qE, बटेर भ्रूण दिवस; आर, ठीक है । स्केल बार्स, ५० µm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 1 qE3 पर ग्रसनी से अलग अन्तः के एक योजनाबद्ध ड्राइंग है (और ce 3.5) (आंकड़ा 1a) और दो अन्तः-संबंधित जीन की सीटू अभिव्यक्ति में, ध्वनि हेज हॉग11,12 और BMP713 अलग ऊतक में । सीटू संकरण प्रक्रियाओं में पूरे-माउंट पहले वर्णित5,7के रूप में प्रदर्शन किया गया । BMP7 की अभिव्यक्ति 2PP और 3PP के अन्तः में पाया गया और केंद्रीय ग्रसनी और 4PP से बाहर रखा गया था (जांच कृपया Elisabeth Dupin द्वारा प्रदान की गई थी) (आंकड़ा 1b) । इसके विपरीत, ध्वनि हेज हॉग केंद्रीय ग्रसनी के अन्तः में पता चला और पाउच से बाहर रखा गया था7 (चित्रा 1C).
चित्रा 2 . chimeric अंगों के पूर्व vivo गठन के प्रतिनिधि परिणाम. प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व बटेर-चिकन chimeric thymi (एक) विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया । संक्षेप में, अलग बटेर 3/4PP अन्तः (qE3) ४८ ज के लिए चिकन somatopleura मध्य त्वक स्तर (ce 2.5) के साथ इन विट्रो में जुड़ा हुआ था । ४८ ज संस्कृति वाले ऊतकों तो सांचा (cE8) पर भ्रष्टाचार किया गया और आगे के लिए ovo में विकसित करने की अनुमति दी 10 दिन । कैम के धारावाहिक वर्गों-व्युत्पंन explants (बी जी) पारंपरिक प्रोटोकॉल द्वारा विश्लेषण किया गया (बी और सी) और immunohistochemistry (डी टू जी) । बी और सी में ( बीके उच्चतर आवर्धन), स्लाइड एच & ई के साथ सना हुआ था । डी और ई में ( डीके उच्च इज़ाफ़ा), स्लाइड QCPN एंटीबॉडी और गिल hematoxylin के साथ counterstained के साथ immunodetected था । एफ और जी में ( एफके उच्च आवर्धन), स्लाइड विरोधी पैन CK एंटीबॉडी और गिल hematoxylin के साथ counterstained के साथ immunodetected था । काले तीर प्रमुखों QCPN (ई) और पैन CK (जी) के मजबूत भूरे रंग के immunostaining के लिए बिंदु । छवि अधिग्रहण विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें । Ca, उपास्थि; Ep, उपकला; पीपी, ग्रसनी थैली; सोम, चिकनी मांसपेशियों । स्केल बार्स: ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 के लिए पूर्व vivo बटेर-चिकन chimeric अंगों के विकास के लिए इस्तेमाल प्रयोगात्मक डिजाइन को दर्शाया गया है । ऊतकों के heterospecific एसोसिएशन ४८ के लिए इन विट्रो में बड़े हो गए थे के बाद ovo विकास में 10 दिनों के लिए (चित्रा 2a). सांचा-व्युत्पन्न explants में Thymi का गठन परम्परागत प्रोटोकॉल द्वारा पहचाना गया. थाइमस अच्छी तरह से विकसित मज्जा और प्रांतस्था डिब्बों (चित्रा बी, सी) के साथ सामांय रूपात्मक सुविधाएं प्रस्तुत की । explants के धारावाहिक वर्गों आगे immunocytochemistry के लिए इलाज किया गया (चित्रा 2d-जी), के रूप में वर्णित5,7। QCPN-मॉब बटेर perinuclear (चित्रा 2d, ई) और विरोधी पैन cytokeratin (सी) (चित्रा 2F, जी) एंटीबॉडी बटेर के लिए मार्करों के रूप में इस्तेमाल किया गया (प्रजाति विशेष) और उपकला कोशिकाओं, क्रमशः । chimeric थाइमस दिखाया QCPN+ thymic उपकला कोशिकाओं (चित्रा 2 डी, ई), एक जालीदार वास्तुकला (चित्रा 2F, जी), और औपनिवेशीकरण कोशिकाओं (लसीकावत्-) द्वारा दाता मूल (चिकन).
| पृथक ऊतक | विकास का मंच | एकाग्रता | तापमान | गर्मी की अवधि |
| ग्रसनी अन्तः | q E2-e 2.5 | 8 मिलीग्राम/एमएल | बर्फ पर | ४५ – ६० min. |
| सी ई 2.5-E3 | ||||
| क्यू E3 | 8 मिलीग्राम/एमएल | बर्फ पर | ६०-९० मिनट । | |
| सी ई 3.5 | ||||
| q E4 | 8 मिलीग्राम/एमएल | बर्फ पर | ९० min. | |
| सी ई 4.5 | ||||
| Somatopleura मध्य त्वक स्तर | q E2-e 2.5 | 8 मिलीग्राम/एमएल | बर्फ पर | 30 – ५० min. |
| सी ई 2.5-E3 | ||||
| सी, चिकन; ई, भ्रूण दिवस; क्यू, बटेर । | ||||
तालिका 1: भ्रूण के ऊतकों अलगाव के दौरान एंजाइमी पाचन की स्थिति ।
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Discussion
भ्रूण ऊतक अलगाव प्रक्रिया यहां विस्तृत पिछले तकनीक से सुधार के लिए बटेर-चिकन chimeric भ्रूण विभिंन जैविक संदर्भों में3,5,6उत्पादन किया गया ।
यह दृष्टिकोण आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता के बिना शुद्ध भ्रूण ऊतकों को अलग करने के लिए उपयुक्त है या ऊतक के उपयोग विशिष्ट मार्करों, जो अक्सर अनिर्धारित हैं, आनुवंशिक रूप से संशोधित पशु मॉडलों के उपयोग को सीमित. यह विकास के दौरान उपकला-mesenchymal बातचीत का अध्ययन करने के लिए शुद्ध ऊतकों को अलग करने की क्षमता के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है सीमित कारक । उदाहरण के लिए, के रूप में विकास की प्रगति, ऊतकों मोटा हो, और अधिक कॉंपैक्ट और अंय पड़ोसी ऊतकों ऐसी है कि उनकी जुदाई अधिक कठिन है के लिए देते हैं । इस अलगाव की प्रक्रिया है, इसलिए, विकास के बाद के चरणों के लिए अनुपयुक्त, अर्थात् देर-organogenesis ।
इस विधि 3 डी संरक्षित भ्रूण ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय है । पृथक ऊतकों की 3d अखंडता सुनिश्चित करने के लिए, उपकरण, सामग्री और समाधान प्रक्रिया भर में कम तापमान पर रखा जाना चाहिए ।
ऊतक microdissection प्रक्रिया भी एक महत्वपूर्ण कदम है कि निर्भर करता है, न केवल प्रयोगात्मक स्थितियों की सावधान स्थापना (तापमान और एंजाइमी पाचन की अवधि की तरह, 1 तालिकामें उदाहरण के रूप में), लेकिन यह भी पर समय लेने वाले हाथों के प्रशिक्षण पर । इस प्रक्रिया में धैर्य और अभ्यास की आवश्यकता है । यदि ऑपरेटर के लिए इस क्षेत्र के संदर्भ खो देता है, stereoscope आवर्धन (20x) कम एक समग्र प्रेक्षण है कि अगले कदम के फैसले में मदद मिलेगी प्रदान करेगा ।
इन विट्रो चरण में ४८ ज विशिष्ट भ्रूण के ऊतकों के बीच सेलुलर बातचीत को बढ़ावा देने के लिए स्थापित किया गया था, जबकि ovo ऊतक के सांचा में उगाया जाता है लंबे समय तक विकास और ऊतकों के heterospecific एसोसिएशन के chimeric अंग गठन का समर्थन करता है 5. इन विट्रो ऊतकों संघों में vivo जोड़तोड़ की कुछ सीमाओं को दूर कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, दवाओं या विकास के स्थानीय प्रशासन कारकों (मोती का उपयोग कर) अंयथा vivo में दुर्गम भ्रूण के क्षेत्रों में, आसानी से इन विट्रो दृष्टिकोण में इस का उपयोग किया जा सकता है । यह पहले ग्रसनी क्षेत्र5में अंग गठन के दौरान स्थानीय ऊतक बातचीत की नकल करने के लिए दिखाया गया है ।
हार्वेस्टिंग explants5,7,8 में बढ़ रहा है कम समय लेने वाली है और एक सरल तरीका है explants ट्रैक जब ऊतकों को इकट्ठा करने के तरीकों की तुलना में chimeric भ्रूण3के शरीर की दीवार पर भ्रष्टाचार । इसके अलावा, कैम कोशिकाओं और अन्य गैर-एवियन प्रजातियों से ऊतकों के साथ प्रत्यारोपित किया जा सकता है, और यह सफलतापूर्वक कैंसर14,15के लिए विकास से, कई प्रयोगात्मक संदर्भों में इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण के लिए, सांचा परख पहले चूहों में लागू किया गया था में चिकन xenografts अध्ययन16 और अक्सर मानव ट्यूमर कोशिकाओं15की इनवेसिव क्षमता का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
हाल ही में, मानव में चिकन xenograft के साथ एक सुरुचिपूर्ण अध्ययन के लिए परीक्षण और जल्दी मानव विकास17का पता लगाने के लिए एक मॉडल के रूप में चिकन भ्रूण की पुष्टि की है । भविष्य में, यह इस के साथ साथ ऊतक, जो माउस और मानव विकास के अध्ययन के लिए अतिरिक्त दृष्टिकोण प्रदान कर सकते है की प्रजातियों के संघ का उपयोग कर वर्णित पद्धति का पता लगाने दिलचस्प होगा ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए इसाबेल Alcobia के आभारी हैं, वीडियो कथन के लिए Mário हेनरिक्स के लिए और Proa de प्रोटोकॉल ई Instituto Histologia, Biologia de Desenvolvimento de Faculdade की Medicina सेवा से वीटर Lisboa, Universidade डी Lisboa, तकनीकी सहायता के लिए । हम विशेष रूप से पाउलो Caeiro और ह्यूगो सिल्वा Unidade de audiovisuais (Audiovisual इकाई), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa के लिए उनके इस वीडियो के उत्पादन के लिए उत्कृष्ट प्रतिबद्धता के लिए ऋणी हैं । हम एक वीडियो प्रणाली के साथ सुसज्जित stereoscope प्रदान करने के लिए Leica माइक्रोसिस्टंस स्वीकार करते हैं और बटेर निषेचित अंडे के साथ योगदान के लिए Interaves-Sociedade एग्रो Pecuária, एस. ए. यह काम Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
