Summary
이 문서에는 ex vivo 공상 장기 형태로 결합 될 수 있는 메 추 라 기 및 닭 배아에서 순수 배아 조직 분리 하는 방법을 제공 합니다.
Abstract
배아 조직 분리 용량 차례로 발달 생물학에서 공개 키 프로세스에 확실 한 공헌을 제공 했다 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템을 설정 하기 위한 필수적인 단계를 했다.
여기는 메 추 라 기를 미세 및 그것의 생물 학적 속성을 유지 하면서 효소 소화에 의해 닭 배아 조직 분리 하는 최적화 된 방법 설명. 절연, 후 48 헤 메 추 라 기에 대 한 생체 외에서 organotypic 분석 결과에서 두 종에서 조직 관련 및 닭고기 조직 고유 핵 기능 및 분자 마커 사이 세포 잡담 연구를 수 있도록 하 여 차별 수 있습니다. heterospecific 협회 조직입니다. 이 접근은, 그러므로, 공부는 foregut의 형성과 pharyngeal morphogenesis 동안 발생 등 매우 역동적인 공간 수정, 개발 프로세스에 복잡 한 조직 상호 작용을 위한 유용한 도구 endoderm 파생 된 기관입니다. 이 실험적인 접근 thymus 형성의 초기 단계 동안 엽 상피 상호 작용 연구를 처음 개발 되었다. 이, 미래의 thymic rudiment endoderm 파생 및 mesoderm 파생 mesenchyme는 각각 메 추 라 기 및 닭 배아에서 분리 했다.
용량의 관련된 조직 기관 생성 하는 더 닭 배아의 chorioallantoic 막 (CAM)에 접목 하 여 테스트할 수 있습니다. 캠은 영양분을 제공 하 고 explanted 조직에 가스 교류를 허용 한다. 비켜 개발에서의 10 일 후 공상 장기 기존의 형태학 방법으로 수확된 explants에 분석 수 있습니다. 이 절차 또한 수 있습니다 초기 개발 (생체 외에서 개발)에서 기관 형성 동안 조직 관련 기여를 공부 (비켜 개발)에서 organogenesis의 최종 단계에.
마지막으로, 향상 된 격리 방법 또한 제공 한다 3 차원으로 (3D) 보존 배아 조직, 조직 관련 유전자 발현 패턴의 고해상도 지형 분석에도 사용할 수 있습니다.
Introduction
1970 년대 초반에 우아한 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 르 Douarin, 새로운 수익원 개발1,2중 세포 이동과 세포 상호 작용의 역할을 이해 하 여에 의해 개발 되었다. 모델 두 종 사이의 셀 교환 것 크게 embryogenesis, 나중에 긴장의 형성 하 고는 조 혈을 포함 하 여 수많은 발달 과정을 연구 하는 데 사용 하는 경우 확인을 방해 하지 않는 전제에서 고안 되었다 시스템1. 예를 들어 후자 복용, 조 혈 창시자 thymic 상피 rudiment 식민지의 주기적 파도 처음 관찰 되었다 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템3를 사용 하 여. Thymus, 세 번째 및 네 번째 pharyngeal 주머니 (3/4PP) endoderm의 미래의 영토 15-30 somite 단계 [배아 일 (전자) 1.5-E2.5]에서 기계적 및 효소 메 추 라 기 (q) 배아에서 분리 했다. 이러한 단계는 닭고기 햄버거와 해밀턴4 (HH)-단계 12 월 17 일에 해당합니다. 격리 절차 트립 신 효소 연결 된 mesenchyme에서 endoderm 해리를 사용 하 여 시작 했다. 격리 된 endoderm E3-E3.5 (HH-단계 20-21)에서 호스트 치킨 (c) 태아의 somatopleura 지역에 투입 했다. 이 분리 mesenchyme thymic 상피 개발 기관 형성3에 기여를 "허용"으로 간주 되었다. 그 후, 닭고기 호스트 혈액을 매개로 조상 세포의 물결이 침투 메 추 라 기 기증자 thymic 상피 대응 호스트 태아3thymus 형성에 기여.
최근에,이 접근의 수정된 된 버전의 초기 단계-thymus 형성5엽 상피 상호 작용을 공부에 대 한 중요 한 것 또한 입증 되었다. 이 점에서 공상 배아3 에서 소성 thymus의 형성에 관련 된 조직 모두 기증자와 호스트 배아에서 분리 되었고 비보 전 관련. 메 추 라 기 3/4PP endoderm (E2.5-E3)와 치킨 somatopleura mesoderm (E2.5-E3)를 분리 하는 향상 된 프로토콜 사용 되었다. 간단히, 배아 조직 했다 생체 외에서 pancreatin 소화 및 미세 하 여 격리 된. 또한, 효소 소화 조건, 온도 시간 외피의 조직 유형 및 발달 단계 (표 1)에 따라 최적화 했다.
다음, 고립 된 조직 했다 관련 한 organotypic에서 48 h에 대 한 시험관 시스템에서 이전에 보고 된5,6. 조직의 생체 외 협회 vivo에서 조작의 몇 가지 제한 사항이 극복 배아에서 지방 세포 상호 작용을 모방 합니다. 이 시스템은 특히 유용 인 두 장치 개발 등 복잡 한 morphogenic 이벤트에서 세포 상호 작용을 공부.
Thymus histogenesis 각 조직의 기여 뿐만 아니라 한 thymus를 생성 하는 heterospecific 협회의 능력 더 탐험을 사용 하 여 캠 방법론, 이전 자세한5,,78일 수 있다. 간결, 교양된 조직 cE8 배아의 캠에 융합 되었고 10 일 비켜 개발 수 있습니다. 다음, thymus 형성 수확된 explants에서 형태소 분석에 의해 평가 되었다. 클래식 메 추 라 기-치킨 연구3, 메 추 라 기 thymic 상피 조상 조 혈 모 세포 (HPCs) 나중 장기 개발9,10 보여 줬던 닭 배아에서 파생 된에 의해 식민지 화 되었다 . HPCs 매우 vascularized 캠5,,78소성 공상 thymus 태아에서 마이그레이션. 메 추 라 기 파생된 thymic 상피 immunohistochemistry 종의 항 체 (즉, QCPN-MAb 메 PeriNuclear), 조직 관련 분자 마커를 위한 필요를 극복을 사용 하 여 확인할 수 있습니다
이 실험 방법은 이전 간행물8, 보고 2 단계 접근 체 외 중 고 비켜 개발에 약리학 대리인의 일반 관리 여 신호 통로의 변조를 허용 합니다. 또한, explants 실험8과정의 어떤 시간 시점에서 수확 될 수 있습니다.
마지막으로, 여기 상세한 격리 프로토콜 수 자연 속성의 보존 및 배아 조직, 그렇지 않으면 배아 영토의 현장에서 유전자 발현 패턴을 자세하게 설명 하는 데 특히 유용의 3D 아키텍처에 의해 액세스할 수 전통적인 방법입니다. 또한, transcriptome 분석 접근, RNA-seq 또는 microarrays를 포함 하 여 적용할 수 있습니다 또한 고립 된 조직에서 조직 관련 높은 처리량 "omics" 분석을 제공 하면서 유전자 마커를 필요로 하지 않고.
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Protocol
이러한 모든 실험 동물 관리 및 센트 Académico 드 메디 시 나의 윤리적 지침 따라 리스보아.
1. 수정 된 메 추 라 기 그리고 닭 계란 외피
- 장소는 3 일 동안 38 ° C 습도 인큐베이터에서 일본 메 추 라 기 (Coturnix coturnix japonica)의 알을 수정 된. 공기 챔버에 향하도록 계란 (계란 무뚝뚝한 끝)를 품 어.
참고: 습도 환경 인큐베이터의 밑에 물 컨테이너를 배치 하 여 이루어집니다. - 38 ° C 습도 인큐베이터에 2.5 일 동안 치킨 (갈 루스 갈 루스)의 수정 된 알을 품 어. 수평 위치에 알 품 어 고 상부 태아 위치를 식별할 수 숯불의 한 조각을 사용 하 여 표시 합니다.
참고:이 실험을 설정할 때 40 메 추 라 기 계란과 60 닭고기 달걀으로 시작.
2. 격리의 메 추 라 기 endoderm thymic rudiment의 예비 도메인을 포함 하
참고: 메 마른 조건에서 수평 층 류 두건 및 멸 균된 악기와 계란 조작 절차에 대 한 자료를 사용 합니다.
- Thymic rudiment의 추정 영역을 포함 하는 배아 지역 제거, 3층 및 4회 를 포함 하는 인 두 아치 지역 설명된7,8로 (3/4PAR), 아치.
- 큰 붕 규 산 유리 그릇 (100 x 50 mm, 100 cm3) 차가운 인산 염 버퍼 염 (PBS) 60 mL을 채우십시오.
- 곡선된가 위의 도움으로 누르고 잘라 원형 구멍을 메 추 라 기의 껍질에 계란을 3 일 동안 incubated 되었습니다. 무딘 계란의 반대 측에 있는 구멍을 확인 하 고 차가운 PBS와 그릇에 노 른 자 (태아)와 전송.
- 여분의 배아 선박 곡선된가 위를 사용 하 여 외부 vitelline 멤브레인을 절단 하 여 노 른 자에서 태아를 제거 합니다.
- 얇은 겸의 도움으로, 작은 사 발 (60 m m x 30 m m, 15 cm3) 배아 전송 차가운 PBS의 10 mL으로 가득합니다.
- 스키 머, 100 mm 페 트리 접시 블랙 기지와 태아 이동 ( 재료의 표참조) 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하 고 있는 stereomicroscope에서.
- 앞에서 설명한83/4PAR를 해 부.
- Aspirate 3/4PAR 및 유리 접시 4 분의 3에 가득 찬 PBS 2 mL 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여.
- Thymic rudiment (3/4PP endoderm)의 추정 영토를 포함 하는 pancreatin와 효소 소화에 의해 endoderm를 격리 합니다.
- 주걱과 얇은 겸의 도움으로 유리 접시 3/4 3/4PAR 이동 찬 pancreatin (8 mg/mL; 25 mg/mL 차가운 PBS와의 1:3 희석)으로 가득합니다.
- 효소 소화에 대 한 얼음에 1 시간에 품 어.
참고: 소화 효소의 시간 개발 (표 1)의 무대의 따라 달라 집니다. - 3/4PAR에서 endoderm을 stereomicroscope (40 x-60 배 확대)에서 유리 접시를 놓습니다.
참고: 모든 표면 및 유지 솔루션 감기이 절차 동안에. 해 부 조직 하는 데 시간이 오래 복용 하는 경우 새로운 차가운 pancreatin 솔루션 변경 (> 15 분). 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 빛을 사용 합니다. - 주변 조직에서 endoderm를 격리 하려면 핀 홀더 2 개의 스테인레스 스틸 microscalpels 사용 하 여.
참고: microscalpels를 사용 하 여 턱 오프닝 직경 1 m m 0 m m의 직경이 0.1 m m와 0.2 m m 니켈 핀 홀더 사이.- 먼저 신경 튜브 및 mesoderm pharyngeal endoderm의 등 쪽 표면에 연결을 제거 합니다.
- 최대 지 면, 신중 하 게 분리 및 제거 인 두 아치 사이 mesenchyme 고 노출 인 두 파우치. 3/4PAR의 양쪽에서이 절차를 수행 합니다.
- 심장 관 및 mesenchyme 둘러싼 앞쪽 주머니를 제거 합니다.
- 복 부 쪽으로 2차 및 3rd 인 두 아치 ectoderm 잘라내어 mesenchyme는 파우치에 연결 된를 조심 스럽게 제거. 3/4PAR의 다른 측면에서이 절차를 반복 합니다. 이 단계에서 갑 상선 rudiment 표시 되어야 합니다.
- 두 개의 microscalpels와 인 두 endoderm에 연결 된 모든 나머지 중간 엽 세포를 제거 합니다.
- 2차 및 3rd 3rd 및 갑 상선 rudiment 및 2nd endoderm의 앞쪽 부분에서 4번째 파우치 포함 하 인 두 endoderm 해리 PP 사이 횡단 컷 만들기 인 두 주머니입니다.
- 주걱과 얇은 겸의 도움으로 전송 격리 3/4PP endoderm 유리 접시 4 분의 3에 100% 찬 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)으로 가득합니다.
- 생체 외 분석 실험의 준비 하는 동안 얼음에 고립 된 조직 유리 접시를 유지. 또는 격리 된 조직을 3 차원으로 보존 될 수 하 고 현장에서 유전자 발현에 대 한 분석.
3입니다. 치킨 somatopleura mesoderm의 격리
참고: 수행 계란 수평 층 류 두건 및 소독된 기기 및 자료를 사용 하 여 무 균 상태에서 조작 절차.
- Somites 19-24 (ss19-24)의 수준에서 somatopleura mesoderm 포함 된 배아 영토를 제거 합니다.
- 외피의 2.5 일 후 인큐베이터에서 닭 계란을 제거 합니다.
- 곡선가 위, 껍질에 작은 구멍을 엽니다. 바늘을 삽입 하 고 낮은 알 부 민 달걀 내부 볼륨 (포탄의 표시 영역 아래에 있는) 태아의 손상을 방지 하는 10 mL 주사기와 알 부의 2 개 mL를 발음. 발음된 알 부 민을 삭제 합니다.
- 컷 원형 곡선된가 위를 사용 하 여 셸 표시 된 지역에 (최대-3 분의 2는 상단 표면 영역)를 구멍.
- 잘라 vitelline 막 외부 extraembryonic 배 얇은 집게로 태아를 잡고 있는 동안.
- Stereomicroscope에서 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하는 검은 기지와 태아 100 mm 페 트리 접시에에서 놓습니다.
참고:이 시점에서 stereomicroscope를 사용 하 여 미세 절차의 점진적 확대에 대 한. - 접시의 바닥에는 배아를 4 개의 얇은 곤충 핀을 사용 합니다. 사각형 모양을 형성 하는 extraembryonic 지역에 핀을 배치 합니다.
- 19와 24 transversely 배아 축 somites wecker 눈이 위를 사용 하 여 모든 배아 영토를 건너 사이 두 컷을 수행 합니다.
- 한계 배아 가장자리 절단 ss19-24, 배아 섹션을 놓습니다.
- Aspirate ss19 24 조직 및 유리 접시 4 분의 3에 차가운 PBS 2 mL 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 채워집니다.
- Pancreatin (8 mg/mL; 25 mg/mL 차가운 PBS와의 1:3 희석)와 효소 소화에 의해 somatopleura 지역 (ss19-24)에서 측면 mesoderm를 격리 합니다.
- 주걱과 얇은 집게, 전송의 도움으로 유리 ss19 24 조직 접시 가득 찬 pancreatin 솔루션으로 3/4.
- 효소 소화에 대 한 얼음에 30 분 동안 품 어.
- Stereomicroscope, 아래에 홀더 2 개의 microscalpels를 사용 하 여 주변 조직에서 mesoderm을 격리 합니다.
참고: 모든 표면 및 유지 솔루션 감기이 절차 동안에. 해 부 조직 하는 데 시간이 오래 복용 하는 경우 새로운 차가운 pancreatin 솔루션 변경 (> 10 분.). 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 빛을 사용 합니다. - Mesoderm 격리 하는 동안 먼저 ectoderm ventrally 위치 splancnopleura 조직의 주의 초연 뒤 표면에서 제거 합니다.
- 릴리즈 신경 튜브를 병렬 동작에서 절단 하 여 somatopleura의 오른쪽 측면 mesoderm.
- 태아의 왼쪽의 mesoderm 분리를 반복 합니다.
참고:이 절차 동안 microscalpel의 움직임을 느리게 합니다. 노출 된 엑스트라 세포 매트릭스 단백질 조직 및 유체 움직임을 방지 하는 악기에 충실. - 주걱과 얇은 겸의 도움으로 유리 접시 4 분의 3에 전송 격리 mesoderm 차가운 FBS 가득합니다.
- 생체 외 분석 실험의 준비 하는 동안 얼음에 고립 된 조직 유리 접시를 유지.
4입니다. 생체 외에서 organotypic 분석 결과: 메 추 라 기 3/4PP endoderm와 치킨 somatopleura mesoderm heterospecific 협회
- 10 %FBS 1% 펜/Strep3,5보충 RPMI 1640 매체와 문화 매체를 준비 합니다.
- 35 mm 페 트리 접시 배양의 5 mL에에서 금속 그리드를 배치 합니다.
참고: 격자의 상단 중간 표면을 액체의 과잉을 제거 합니다. - 얇은 포 셉의 도움으로 멤브레인 필터 문화 매체에와 공기와 접촉 한 표면에 그리드 위에 배치.
참고: 1/4의 막 (13 m m 직경) 조직 협회에 대 한 적절 한입니다. - Stereomicroscope에서 멤브레인 필터 위에 고립 된 조직에 연결. 먼저 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드러운 슬라이딩 유리 접시에서 3/4PP endoderm (2 단계)을 전송 하 고 얇은 집게. 격리 된 mesoderm (3 단계)에 대 한이 절차를 반복 합니다.
참고:는 microscalpel의 도움으로의 그것의 협회를 극대화 하기 위해 조직 믹스. - 48 h. 교양된 조직 chorioallantoic 막 (CAM)에 투입 될 수에 대 한 신중 하 게 5% CO2 와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에 관련된 조직 배치 합니다.
참고: 카메라에 소성 기관 형성 이전 자세한8이었다.
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Representative Results
프로토콜에는 여러 세포 및 개발 생물학 기술 접근에 사용 되는 조류 배아 조직 분리 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 이 방법은 이전 thymus 형성5의 초기 단계 동안 엽 상피 상호 작용을 공부 고용 되었다. 여기, 새로운 결과 그림 1 과 그림 2, 비슷한 방법을 사용 하 여 표시 됩니다.
그림 1 . 유전자 발현의 대표적인 결과 연구의 3 차원으로 보존 추정 영토를 포함 하는 인 두 endoderm의 thymus rudiment의. 인 두 기구 및 절연된 endoderm 2PP, 3PP 4PP (cE3.5 또는 qE3)에서 포함 된 도식 표현 (A). 전체-마운트 BMP7와 제자리 교 잡 (B) 및 cE3.5에서 격리 endoderm의 소닉 고슴도치 (C). BMP7와 소닉 고슴도치의 강한 교 잡 신호 endoderm 2PP 3PP의 흰색 화살표에 의해 지적 (B) 및 중앙 인 (C), 각각. A, 앞쪽; cE, 닭 배아 일; L, 왼쪽; P, 후부; PP, pharyngeal 주머니; qE, 메 추리 배아 일; R, 오른쪽입니다. 스케일 바, 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 1 은 endoderm에서 qE3 (cE3.5) 인 두에서 분리의 도식 그리기 (그림 1A)와 2 endoderm 관련 유전자, 소닉 고슴도치11,12 , BMP713 의 현장에서 식 격리 된 조직. 전체-마운트 제자리 교 잡 절차는 앞에서 설명한5,7으로 수행 했다. BMP7의 식 2PP 3PP의 endoderm에서 발견 되었고 중앙 인 두와 4PP에서 제외 (프로브 친절 하 게 제공 했다 엘리자베스 dupin) (그림 1B). 반대로, 소닉 헤 지 호 그 중앙 인 두의 endoderm에서 발견 되었고 파우치7 (그림 1c)에서 제외.
그림 2 . Ex vivo 공상 장기의 형성의 대표적인 결과. 메 추 라 기-닭고기 공상 thymi (A)를 개발 하는 데 사용 하는 실험적인 접근의 도식 적인 표현입니다. 간단히, 격리 된 메 추 라 기 3/4PP endoderm (qE3)는 연관 된 생체 외에서 48 h의 치킨 somatopleura mesoderm (cE2.5). 48 h 교양 조직 캠 (cE8)에 융합 그리고 비켜 더 10 일에 대 한 개발을 허용 했다. 캠 파생 explants (B-G)의 직렬 섹션 전통적인 조직학 (B 와 C) 및 immunohistochemistry (D g)에 의해 분석 되었다. B 와 C ( B의 높은 확대), 슬라이드는 물 들일 H & e. D , E ( D의 높은 확대) 슬라이드 immunodetected QCPN 항 체와 고 길의 hematoxylin와 counterstained. F , G ( F의 높은 확대) 슬라이드 immunodetected 안티 팬 CK 항 체와 고 길의 hematoxylin와 counterstained. 검은색 화살표 머리 QCPN (E) 및 팬 CK (G)의 강한 갈색 immunostaining을 가리킵니다. 이미지 수집 세부 정보 테이블의 자료 를 참조 하십시오. Ca, 연골; Ep, 상피; PP, pharyngeal 주머니; 솜, 부드러운 근육 스케일 바: 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 ex vivo 메 추 라 기-닭고기 공상 장기 개발 하는 데 사용 하는 실험 설계를 보여 줍니다. 조직의 heterospecific 협회는 10 일 (그림 2A) 비켜 개발에 48 h에 대 한 생체 외에서 성장 했다. Thymi 캠 파생 explants에 형성 된 전통적인 조직학으로 확인 되었다. Thymus는 잘 발달 된 수 질과 피 질 구획 (그림 2B, C) 정상적인 형태학 상 특징을 제시. explants의 직렬 섹션 설명된5,7immunocytochemistry (그림 2DG), 더 치료 했다. QCPN-MAb 메 perinuclear (2D 그림, E)와 안티 팬 cytokeratin (CK) (그림 2F, G) 항 체 (종의) 메 추 라 기에 대 한 표식으로 사용 되었다, 상피 세포, 각각. 공상 thymus가 보여주었다 QCPN+ thymic 상피 세포 (그림 2D, E), (그림 2F, G), 망상 구조 및 기증자 원점 (닭)의 림프 세포 (QCPN-)에 의해 식민지.
| 격리 된 조직 | 개발의 단계 | 농도 | 온도 | 잠복기 |
| 인 두 endoderm | q e 2-E2.5 | 8 mg/mL | 얼음에 | 45-60 분입니다. |
| c E2.5-E3 | ||||
| q e 3 | 8 mg/mL | 얼음에 | 60-90 분입니다. | |
| c E3.5 | ||||
| q e 4 | 8 mg/mL | 얼음에 | 90 분입니다. | |
| c E4.5 | ||||
| Somatopleura mesoderm | q e 2-E2.5 | 8 mg/mL | 얼음에 | 30-50 분입니다. |
| c E2.5-E3 | ||||
| c, 닭; E, 배아 일; q, 메 추 라 기입니다. | ||||
표 1: 배아 조직 격리 중 효소 소화의 조건.
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Discussion
여기 상세한 배아 조직 격리 절차는 다른 생물학 문맥3,,56에 메 추 라 기-닭고기 공상 배아를 생산 하는 이전 기술에서 개선 되었다.
이 방식은 유전자 조작 이나 결정, 유전자 변형된 동물 모델의 사용을 제한 하지는 조직의 특정 마커를 사용 하 여 필요 없이 순수 배아 조직 분리에 적합 합니다. 그것은 능력을 제한 하는 요인이 되 고 순수한 조직 분리 개발 하는 동안 엽 상피 상호 작용을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 개발 진행, 조직 및 두꺼운, 더 조밀한 그들의 별거는 더 어려운 같은 다른 인접 조직에 연결. 이 격리 절차가 아니다, 따라서, 개발, 즉 늦은 organogenesis의 나중의 단계에 적합.
이 메서드는 고유 3D 보존 배아 조직에서 유전자 발현을 연구 합니다. 고립 된 직물의 3D 무결성을 보장 하려면 기기, 재료 및 솔루션 과정 전반에 걸쳐 낮은 온도에서 유지 되어야 한다.
조직 서 절차는 또한 실험 조건 (온도 같은 효소 소화에 exemplified 표 1의 기간)의 주의 설립에 뿐만 아니라 의존 하는 중요 한 단계 뿐만 아니라에 시간이 걸리는 실습 훈련. 이 절차에는 인 내와 연습이 필요합니다. 연산자는 지역의 해 부 될 참조를 잃으면 stereoscope 확대 (20 배)을 감소 도움이 될 것 입 다음 이동 결정 전반적인 관찰을 제공할 것입니다.
체 외 단계에서 48 h 설립에 비켜 동안 뚜렷한 배아 조직 간의 세포 상호 작용을 촉진 하는 캠에서 성장 하는 조직 지원 장기 개발 및 조직의 heterospecific 협회의 공상 기관 형성 5. 생체 조직 협회 vivo에서 조작의 몇 가지 한계를 극복 하기 수 있습니다. 약물 이나 성장 요인의 예를 들어, 로컬 관리 (를 사용 하 여 구슬) 배아 비보에 그렇지 않으면 액세스할 수의 지역에서 수행할 수 있습니다 쉽게 생체 외에서이 방식을 사용 하 여. 이 이전 인 두 지역5에서 기관 형성 동안 로컬 조직 상호 작용을 모방 하 고 나타났습니다.
Explants 캠5,,78 성장 수확 덜 소모 이며 추적 하는 간단한 방법을 explants 공상 배아3의 체 벽에 융합 조직 수집의 방법에 비교 될 때 이다. 또한, 캠 세포와 다른 비-조류 종, 조직 이식 될 수 있는 고 암14,15개발에서 여러 가지 실험 상황에서 성공적으로 사용 되었습니다. 예를 들어 카메라 분석 결과 쥐에 치킨 xenografts 연구16 에 이전에 적용 하 고 인간 종양 세포15의 침략 적 용량을 테스트 하 자주 사용 된다.
최근,는 우아한 인간으로 닭이 종이 식 연구 테스트 하 고 초기 인간 발달17탐험 모델로 닭 배아를 검증 했다. 미래에, 그것은 여기 마우스와 인간 발달 연구에 추가적인 접근을 제공할 수 있습니다 조직의 interspecies 협회를 사용 하 여 설명 하는 방법론을 탐구 흥미로울 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 원고의 중요 한 독서에 대 한 감사 이사벨 Alcobia 비디오 나레이션 대 한 마리 Henriques Instituto de Histologia e Biologia의 조직학 서비스에서 Vitor 쾌속 범선을 할 Desenvolvimento, Faculdade de Medicina 드 리스보아 Universidade 드 리스보아, 기술 지원에 대 한입니다. 우리는 특히 파울로 카에 이루와 휴고 실바 Unidade 드 audiovisuais (시청각 단위), Faculdade 데에서에서 빚을 Medicina 드 리스보아,이 비디오의 생산에 그들의 뛰어난 노력에 대 한 Universidade 드 리스보아. 친절 하 게 제공 Interaves 비디오 시스템을 갖추고 stereoscope Leica 마이크로 시스템즈 인정-계란을 기름 지 게 하 고 있다 농업-Pecuária, 메 추 라 기와 기여에 대 한 활발. 이 작품은 Faculdade 드에 의해 지원 되었다 Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아 (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
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