Summary
Bu makalede embriyonik dokulardan saf formu ex vivo chimeric organları için bir araya getirilebilen bıldırcın ve tavuk embriyolar izole etmek için bir yöntem sağlar.
Abstract
Embriyonik Doku yalıtmak için kapasite sırayla gelişim biyolojisi örtüsünü açmak temel süreçleri tartışmasız katkılar sağlamıştır bıldırcın-tavuk chimera sistemi kurulması için önemli bir adım oldu.
Burada olduğunu bıldırcın ve Mikrocerrahi ve biyolojik özelliklerini koruyarak süre enzimatik sindirim tarafından tavuk embriyonik dokulardan yalıtmak için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi açıklanmıştır. Yalıtım sonra her iki tür dokulardan bir tüp bebek organotypic tahlil 48 h. bıldırcın için ilişkili ve tavuk dokuları farklı nükleer özellikleri ve moleküler işaretleyiciler hücresel çapraz konuşma arasında çalışma izin tarafından ayrımcılığa dokuların heterospecific Derneği. Bu yaklaşım, bu nedenle, karmaşık doku etkileşimleri gelişim süreçlerinde olanlar faringeal morfogenez ve foregut oluşumu sırasında meydana gelen gibi son derece dinamik uzamsal değişiklikler ile çalışmak için yararlı bir araçtır endoderm elde edilen organlar. Bu deneysel yaklaşım ilk mezenkimal epitel etkileşimleri erken-evrelerinde timus oluşumu incelemek için geliştirilmiştir. Bu, potansiyel timik rudiment endoderm kaynaklı ve Mezenşim mesoderm kaynaklı, sırasıyla bıldırcın ve tavuk embriyo izole edildi.
Organları oluşturmak için kapasite ilişkili dokuların daha fazla tavuk embriyo chorioallantoic membran (CAM) aşılama tarafından test edilecek. CAM besin sağlar ve explanted dokulara gaz alışverişi sağlar. Ovo geliştirme 10 gün sonra chimeric organ hasat explants geleneksel morfolojik yöntemlerle analiz edilebilir. Bu yordam ayrıca organogenesis (ovo gelişiminde) son dönemlerinde için ilk gelişimi (tüp bebek geliştirme) üzerinden organ oluşumu sırasında doku özgü katkıları eğitim verir.
Son olarak, geliştirilmiş yalıtım yöntemini sağlar ayrıca üç boyutlu (3D) doku özel gen ekspresyonu desenleri yüksek çözünürlüklü topografik analizi için de kullanılabilir embriyonik dokular, korunmuş.
Introduction
1970'lerin başında, bir zarif bıldırcın-tavuk chimera sistem Le Douarin, geliştirme1,2sırasında hücre göç ve hücresel etkileşimlerin rolünü anlamak için yeni yollar açma tarafından geliştirilmiştir. Hücre değişimi iki tür arasındaki önemli ölçüde embriyogenez, daha sonra gergin oluşumu ve hematopoetik dahil olmak üzere çok sayıda gelişimsel süreçleri çalışmaya kullanıldığında doğruladı rahatsız değil öncül modeli geliştirildi sistemleri1. İkinci örnek olarak alırsak, hematopoetik ataları timik epitel rudiment kolonize döngüsel dalgaları ilk gözlenen bıldırcın-tavuk chimera sistem3kullanarak. Bunun için timus, üçüncü ve dördüncü faringeal torbalar (3/4PP), endoderm aday bölge 15-30 - somite aşamada [embriyonik gün (E) 1.5-E2.5] bıldırcın (q) embriyo mekanik ve enzimatik izole edildi. Bu aşamalar tavuk Hamburger ve Hamilton4 (HH) - aşamaları 12-17 karşılık gelir. Yalıtım yordamlar tripsin enzimatik endoderm ekli Mezenşim dan ayırmak için kullanımı ile başladı. İzole endoderm ana tavuk (c) embriyo E3-E3.5 (SS-aşamaları 20-21), somatopleura bölgeye aşılı. Bu Contegra Mezenşim timik epitel gelişimine de katkıda organ oluşumu3' e "keyfi" olarak kabul edildi. Daha sonra art arda gelen dalgalar tavuk ev sahibi kan yoluyla progenitör hücrelerin ana bilgisayar embriyo3timus oluşumunda katkıda bulunmak ve bıldırcın donör timik epitel muadili sızmış.
Son zamanlarda, bu yaklaşım değiştirilmiş bir sürümü de erken-evrelerinde timus oluşumu5mezenkimal epitel etkileşimleri eğitimi için önemli olduğu kanıtlanmış oldu. Bu bağlamda, ektopik timus chimeric embriyo3 oluşumu dahil dokular, donör ve ana bilgisayar embriyolar, her ikisi de izole ve ex vivo ilişkili. Bıldırcın 3/4PP endoderm (E2.5-E3) ve tavuk somatopleura mesoderm (E2.5-E3) izole etmek için kullanılan gelişmiş bir protokol. Kısaca, embriyonik doku mikrocerrahi ve tüp bebek Pankreatin sindirim tabi izole edildi. Ayrıca, enzimatik sindirim, sıcaklığı ve süresi, kuluçka koşulları doku ve gelişimsel sahne (Tablo 1) göre optimize.
Ardından, izole dokular bir organotypic vitro sistemde 48 h, daha önce bildirilen5,6ilişkili. Tüp bebek derneğin dokuların içinde vivo manipülasyon bazı sınırlamalar üstesinden embriyo, yerel hücresel etkileşimlerde taklit eder. Bu sistem geliştirme faringeal cihazları gibi karmaşık morphogenic olaylarda hücresel etkileşimlerin çalışmaya özellikle yararlıdır.
Timus doku her dokusunda katkısını yanı sıra yetenek bir timus oluşturmak için heterospecific derneğin keşfedilmeyi kullanarak daha fazla CAM metodolojisi, daha önce ayrıntılı5,7,8olabilir. Kısaca, kültürlü dokulara cE8 embriyo CAM aşılı ve 10 gün boyunca ovo içinde geliştirmek için izin. O zaman, timus oluşumu hasat explants morfolojik analizi ile değerlendirilmiştir. Olduğu gibi klasik bıldırcın-tavuk çalışmalar3, bıldırcın timik epitel hematopoetik progenitör hücreler (HPCs) daha sonra organ gelişimi9' a,10 katkıda bulunmak için gösterildi tavuk embriyo elde tarafından kolonize . HPCs ile son derece bozukluklarına CAM5,7,8chimeric ektopik timus embriyo göç. Bıldırcın türetilmiş timik epitel doku özel moleküler işaretleyiciler ihtiyacını üstesinden species-specific antikorlar (yani, QCPN - MAb bıldırcın Perinükleer), kullanarak immünhistokimya belirlenebilir.
Bu deneysel Yöntem, önceki yayın8' de bildirilen iki aşamalı yaklaşım olarak sinyalleme yollarının modülasyonu düzenli yönetim sırasında tüp bebek ve ovo geliştirme farmakolojik ajanlar tarafından sağlar. Ayrıca, explants herhangi bir zaman-noktada deneme8tabii hasat edilebilir.
Son olarak, burada ayrıntılı yalıtım Protokolü doğal özellikleri korunması ve 3D-mimari embriyonik dokuların, aksi takdirde yerinde gen ekspresyonu desenleri embriyonik'in ayrıntılı için özellikle yararlı tarafından erişilemeyen sağlar geleneksel yöntemleri. Buna ek olarak, transcriptome analiz yaklaşımları, RNA-seq veya microarrays, dahil olmak üzere de izole dokularda bir doku özgü yüksek üretilen iş "omics" analiz sağlarken genetik işaretler gerek kalmadan uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deneylerin hayvan bakımı ve Centro Académico de Medicina de etik kuralları izleyin Lisboa.
1. bıldırcın ve tavuk yumurta kuluçka döllenmiş
- Yer yumurta Japon bıldırcın (Coturnix coturnix japonica) 38 ° C oksijen kuluçka makinesine 3 gün boyunca döllenmiş. Yukarı dönük olacak şekilde hava odasında yumurta (yumurta künt son) kuluçkaya.
Not: Kuluçka makinesi alt kısmında bir su kabı yerleştirerek oksijen ortamı elde edilir. - Döllenmiş yumurta tavuk (Gallus gallus) 38 ° C oksijen kuluçka 2,5 gün kuluçkaya. Yatay bir konumda yumurtaları kuluçkaya ve embriyo konum belirlemek için bir parça kömür kullanarak üst tarafı işaretleyin.
Not: Bu deneme kurarken 40 bıldırcın yumurtası ve 60 tavuk yumurtası ile başlayın.
2. bıldırcın endoderm timik rudiment potansiyel etki alanını içeren yalıtım
Not: yatay laminar akış kukuIeta ve steril aletler ve malzemeler yumurta işleme yordamları için steril koşullarda kullanın.
- Timik rudiment meşru topraklarının içeren embriyonik bölge kaldırmak içinrd 3 ve 4th içeren faringeal kemer bölgesi (3/4PAR), açıklanan7,8olarak kemerler.
- Bir büyük borosilikat cam kase (100 x 50 mm; 100 cm3) 60 mL soğuk fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile doldurun.
- Eğri makas yardımıyla dokunun ve 3 gün boyunca inkübe yumurta dairesel delik bir bıldırcın kabuk. Yumurta karşı tarafta delik künt aç ve soğuk PBS ile kase yumurta sarısı (embriyo ile) aktarmak.
- Embriyo vitelline membran harici olarak eğri makas kullanarak ekstra embriyonik damarları keserek sarısı kaldırın.
- İnce forseps yardımıyla, transfer embriyo için küçük bir kase (60 x 30 mm; 15 cm3) 10 mL soğuk PBS ile dolu.
- Bir kepçe ile 100 mm Petri kabına siyah bir tabanı ile embriyo taşımak ( Tablo malzemelerigörmek) 10 mL soğuk PBS içeren ve stereomicroscope yerleştirin.
- 3/4PAR, yukarıda açıklanan8olarak incelemek.
- 3/4PAR ve bir cam tabak dörtte üçü aktarmak 2 mL steril Pasteur pipet kullanarak soğuk PBS ile dolu Aspire edin.
- Pankreatin ile enzimatik sindirim tarafından timik rudiment (3/4PP endoderm) meşru topraklarının içeren endoderm yalıtmak.
- Spatula ve ince forseps yardımıyla, soğuk Pankreatin (8 mg/mL; 1:3 seyreltme olarak 25 mg/mL soğuk PBS ile) transferi bir cam tabak dörtte üçü 3/4PAR dolu.
- Buz enzimatik sindirim için 1 h için kuluçkaya.
Not: Geliştirme (Tablo 1) aşaması enzimatik sindirim bağlıdır. - 3/4PAR dan endoderm yalıtmak için stereomicroscope (40 x-60 x büyütme) altında cam tabak yerleştirin.
Not: tüm yüzeyler ve çözümleri soğuk bu yordam sırasında tutmak. Eğer belgili tanımlık doku incelemek için uzun süren yeni bir soğuk Pankreatin çözüm değiştirmek (> 15 dk). Bir ışık kaynağı olarak LED ışıklar sınırlı ısı yükü dikkate alınarak stereomicroscope veya optik lifler dahil kullanın. - Çevre dokular üzerinden endoderm yalıtmak için PIN sahipleri iki paslanmaz çelik microscalpels kullanın.
Not: 0,1 mm ve 0.2 mm ve nikel iğne sahipleri arasında çapı 1 mm 0 mm çene açılış büyüklüğündeki microscalpels kullanın.- Önce nöral tüp ve faringeal endoderm dorsal yüzeye bağlı mesoderm kaldırın.
- Sırt tarafı yukarı ile dikkatli bir şekilde ayırmak ve faringeal kemerler arasında Mezenşim kaldırmak ve faringeal torbalar içinde karşı karşıya. 3/4PAR her iki tarafta bu yordamı gerçekleştirin.
- Kalbini tüp ve anterior torbalar çevreleyen Mezenşim kaldırın.
- Ventral tarafı yukarı ile 2nd ve 3rd faringeal kemerler ektoderm kesme ve torbalar için bağlı Mezenşim dikkatli bir şekilde çıkarın. 3/4PAR diğer tarafında bu yordamı yineleyin. Bu aşamada tiroid rudiment görünür olmalıdır.
- Faringeal endoderm iki microscalpels ile bağlı kalan mezenkimal hücreler kaldırın.
- 2nd ve 3rd s,rd 3 ve 4th torbalar tiroid rudiment ve 2nd endoderm ön kısmından içeren faringeal endoderm dissociating arasında enine bir kesim yapmak faringeal kese.
- Spatula ve ince forseps yardımıyla transfer izole 3/4PP endoderm bir cam tabak dörtte üçü için % 100 soğuk fetal Sığır serum ile (FBS) dolu.
- Buz üzerinde izole dokular ile cam çanak tüp bebek tahlil hazırlanması sırasında tutmak. Alternatif olarak, izole doku üç boyutlu korunabilir ve in situ olarak gen-ifade için analiz edilebilir.
3. yalıtım tavuk somatopleura mesoderm
Not: yumurta gerçekleştirmek işleme yordamları steril koşullarda yatay laminar akış kukuIeta ve sterilize edilmiş aletler ve malzemeler kullanarak.
- Somites 19-24 (ss19-24) düzeyinde somatopleura mesoderm içeren embriyonik bölge kaldırın.
- Tavuk yumurta inkübatör kuluçka 2.5 gün sonra kaldırın.
- Eğri makas ile kabukta küçük bir delik açın. Bir iğne takın ve albümin 2 mL içinde yumurta albümin birim alt ve (işaretli kabuk altında bulunan) embriyo zarar görmesini önlemek için bir 10 mL şırınga ile Aspire edin. Emişli albümin atmak.
- Bir daire kesme delik (ilâ 2 / 3 üst yüzey alanı) eğri makas kullanarak kabuk işaretli bölgesinde.
- Vitelline membran ince forseps ile embriyo tutarken extraembryonic gemiler dışarıdan kesti.
- Bir stereomicroscope altında embriyo soğuk PBS 10 mL içeren bir siyah Bankası ile bir 100 mm Petri kabına yerleştirin.
Not: bir stereomicroscope bu aşamadan itibaren mikrocerrahi yordamlar ilerici büyütme için kullanın. - Embriyo plaka altına tutmak için dört ince böcek pimleri kullanın. Pimleri bir kare şekli oluşturan extraembryonic bölgede yerleştirin.
- 19 ve somites 24-kemiği embriyo eksen ve wecker göz makas kullanarak tüm embriyo bölge geçiş arasında iki kesim gerçekleştirin.
- Embriyo bölümünde, ss19-24, kesme marjinal embriyonik kenarlarından serbest bırakın.
- Aspiratı ss19-24 doku ve bir cam tabak dörtte üçü aktarmak 2 mL steril Pasteur pipet kullanarak soğuk PBS ile dolu.
- Somatopleura bölge (ss19-24) yanal mesoderm Pankreatin (8 mg/mL; 1:3 seyreltme olarak 25 mg/mL soğuk PBS ile) ile enzimatik sindirim tarafından izole et.
- Spatula ve ince forseps, transfer yardımıyla dörtte üçü soğuk Pankreatin çözüm ile dolu bir cam ss19-24 dokuların çanağı.
- Buz enzimatik sindirim için 30 dk için kuluçkaya.
- Stereomicroscope altında bir sahibi iki microscalpels kullanarak çevre dokular üzerinden mesoderm yalıtmak.
Not: tüm yüzeyler ve çözümleri soğuk bu yordam sırasında tutmak. Eğer belgili tanımlık doku incelemek için uzun süren yeni bir soğuk Pankreatin çözüm değiştirmek (> 10 dak.). Bir ışık kaynağı olarak LED ışıklar sınırlı ısı yükü dikkate alınarak stereomicroscope veya optik lifler dahil kullanın. - Mesoderm yalıtım sırasında önce ektoderm ventrally bulunduğu splancnopleura dokular dikkatli dekolmanı tarafından takip yüzeyde kaldırın.
- Somatopleura sağ yanal mesoderm nöral tüp paralel hareket halinde keserek serbest bırakın.
- Embriyo sol tarafındaki mesoderm ayrılması yineleyin.
Not: Bu işlem sırasında microscalpel hareketleri yavaş olun. Maruz kalan ekstra hücresel matris proteinler doku ve sıvı hareketleri önleme aletleri için sopa. - Spatula ve ince forseps yardımıyla bir cam tabak dörtte üçü izole mesoderm aktarmak ile soğuk FBS dolu.
- Buz üzerinde izole dokular ile cam çanak tüp bebek tahlil hazırlanması sırasında tutmak.
4. İn vitro organotypic tahlil: bıldırcın 3/4PP endoderm ve tavuk somatopleura mesoderm heterospecific Derneği
- %10 FBS ve % 1 kalem/Strep3,5RPMI-1640 orta ile kültür ortamı hazırlamak.
- Bir metal ızgara 35 mm ile 5 mL kültür ortamının Petri kabına yerleştirin.
Not: üst kılavuz ile orta yüzey seviye için sıvı fazlalığı kaldırın. - İnce forseps yardımıyla bir membran filtre kültür orta daldırma ve sonra hava ile temas halinde bir yüzeye sahip ızgaranın üstüne yerleştirin.
Not: Membran alanı (13 mm çap ile) dörtte biri doku Derneği için yeterlidir. - Stereomicroscope altında membran filtre üst izole doku ilişkilendirin. İlk nazik bir nakli kaşık (veya spatula) yardımı ile kaydırarak cam tabak 3/4PP endoderm (adım 2) aktarmak ve ince forseps. İzole mesoderm (adım 3) için bu yordamı yineleyin.
Not: bir microscalpel yardımı ile ilişkisini en üst düzeye çıkarmak belgili tanımlık doku karıştırın. - Dikkatle 48 h. kültürlü dokulara chorioallantoic membran (CAM) aşılı için ilişkili dokulara oksijen kuluçka %5 CO2 37 ° C'de yer.
Not: CAM ektopik organ oluşumu daha önce ayrıntılı8yaşındaydım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İletişim kuralı birkaç hücresel ve gelişim biyolojisi teknik yaklaşım içinde kullanılmak üzere kuş embriyonik doku yalıtmak için bir yöntemi ayrıntıları. Bu yöntem daha önce timus oluşumu5erken evrelerinde mezenkimal epitel etkileşimleri çalışmaya istihdam edildi. Burada, yeni sonuçları Şekil 1 ve Şekil 2benzer yaklaşımları kullanarak, gösterilir.
Resim 1 . Gen ekspresyonu temsilcisi sonuçlarını incelemek üç boyutlu faringeal endoderm meşru bölge içeren korunmuş timus rudiment. Faringeal aparatı ve 2PP, 3PP ve 4PP (at cE3.5 veya qE3) içeren izole endoderm şematik gösterimi(a). Bütün Monte BMP7 ile In situ hibridizasyon (B) ve Sonic Kirpi (C) cE3.5, izole endoderm. Güçlü hibridizasyon sinyalleri BMP7 ve Sonic Kirpi işaret endoderm, 2PP ve 3PP içinde beyaz ok uçları tarafından (B) ve Merkez farinks (C), anılan sıraya göre. A, ön; cE, tavuk embriyonik gün; L, sol; P, posterior; S, faringeal çantası; qE, bıldırcın embriyonik gün; R, sağ. Ölçek çubukları, 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 1 olan qE3 (ve cE3.5), farinks dan izole endoderm şematik çizimi (Şekil 1A) ve in situ olarak ifade iki endoderm ilgili gen, sonic kirpi11,12 ve BMP713 izole dokusunda. Bütün-mount In situ hibridizasyon yordamlar yukarıda açıklanan5,7olarak gerçekleştirilmiştir. BMP7 ifade 2PP ve 3PP endoderm algılandı ve merkezi farinks ve 4PP hariç (sonda nazikçe Elisabeth Dupin tarafından sağlanan) (Şekil 1B). Bunun tersi olarak, sonic kirpi merkezi yutak endoderm algılandı ve torbalar içinde7 (Şekil 1 C) hariç.
Resim 2 . Ex vivo chimeric organ oluşumu temsilcisi sonuçlarını. Bıldırcın-tavuk chimeric thymi(a)geliştirmek için kullanılan deneysel yaklaşım şematik gösterimi. Kısaca, izole bıldırcın 3/4PP endoderm (qE3) tüp bebek 48 h için tavuk somatopleura mesoderm (cE2.5) ile ilişkili. 48 h kültürlü doku daha sonra CAM (cE8) aşılı ve daha fazla 10 gün içinde ovo geliştirmek için izin. CAM elde edilen explants (B-G) seri bölümlerini geleneksel Histoloji (B ve C) ve immünhistokimya (D G) tarafından analiz edildi. B ve C ( byüksek büyütme), slayt H & E. ile lekeli yapıldı. D ve E ( ddaha yüksek büyütme), slayt immunodetected QCPN antikor ile yapıldı ve Gill'in hematoksilen ile counterstained. F ve G ( fdaha yüksek büyütme), slayt immunodetected Anti-Pan CK antikor ile yapıldı ve Gill'in hematoksilen ile counterstained. Siyah ok uçları için QCPN (E) ve Pan CK (G) güçlü kahverengi immunostaining gelin. Malzemeler tablo görüntü edinme Ayrıntılar için bkz. CA, kıkırdak; EP, epitel; S, faringeal çantası; SoM, düz kas. Ölçek çubukları: 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2 ex vivo bıldırcın-tavuk chimeric organları geliştirmek için kullanılan deneysel tasarım gösteriyor. Dokulara heterospecific Derneği tüp bebek 48 h 10 gün (Şekil 2A) ovo geliştirmede takip için yetiştirilmiştir. Thymi explants CAM kaynaklı oluşan geleneksel Histoloji tarafından tespit edildi. Timus normal morfolojik özellikleri iyi gelişmiş korteks ve medulla bölmeleri ile (Şekil 2B, C) sundu. Explants seri bölümlerini daha fazla immunocytochemistry (Şekil 2B- G), açıklanan5,7olarak tedavi edildi. QCPN - MAb bıldırcın Perinükleer (2D rakam, E) ve anti-pan cytokeratin (CK) (Şekil 2F, G) antikorları bıldırcın (species-specific) için işaretleyici olarak kullanılmıştır ve epitel hücreleri, anılan sıraya göre. Chimeric timus QCPN+ timik epitel hücreleri (Şekil 2B, E), (Şekil 2F, G) retiküler mimarisi ve lenfoid hücreleri (QCPN-) tarafından kolonizasyon donör kökenli (tavuk) gösterdi.
| İzole doku | Geliştirme aşaması | Konsantrasyon | Sıcaklık | Kuluçka dönemi |
| Yutak endoderm | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | Buz üstünde | 45-60 dk. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| q E3 | 8 mg/mL | Buz üstünde | 60 - 90 dk. | |
| c E3.5 | ||||
| q E4 | 8 mg/mL | Buz üstünde | 90 dakika. | |
| c E4.5 | ||||
| Somatopleura mesoderm | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | Buz üstünde | 30 – 50 dak. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| c, tavuk; E, embriyonik gün; q, bıldırcın. | ||||
Tablo 1: Koşullar enzimatik sindirim sırasında embriyonik doku yalıtım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada verilen embriyonik doku yalıtım yordam bıldırcın-tavuk chimeric bebekleri farklı biyolojik bağlamlarda3,5,6üretmek için önceki teknik geliştirildi.
Bu yaklaşım genetik manipülasyon veya belirsiz, genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri kullanımını sınırlama çoğu kez doku özgü işaretleri kullanımı gerektirmeden saf embriyonik doku yalıtmak uygundur. Mezenkimal epitel etkileşimleri geliştirme sırasında çalışma yeteneğini ile saf doku sınırlayıcı bir faktör olarak izole etmek için kullanılabilir. Örneğin, geliştirme ilerledikçe, doku haline daha kalın, daha kompakt ve ayırma daha zor olacak diğer komşu dokulara ekleyebilirsiniz. Bu yalıtım yordamı bu nedenle, daha sonra gelişimin, yani geç organogenesis için uygun değildir.
Bu yöntem gen-ifade embriyonik dokularda 3D korunmuş eğitim için benzersizdir. İzole dokuların 3D bütünlüğü sağlamak amacıyla, aletleri, malzemeler ve çözümleri süreci boyunca düşük sıcaklıklarda tutulmalıdır.
Doku mikrodiseksiyon yordam Ayrıca, sadece deneysel koşullar (sıcaklık ve süre içinde örneği Tablo 1olarak enzimatik sindirim) gibi dikkatli kurulması dayanan bir kritik ama aynı zamanda üzerinde adımdır zaman alan uygulamalı eğitim. Bu yordamı uygulama ve sabır gerektirir. Işleç bölge disseke için başvurular kaybederse, stereoscope büyütme (20 x) azalan sonraki hareket karar yardımcı olacak genel bir gözlem sağlayacaktır.
Vitro adımda 48 h kurulmuştur içinde ovo süre ayrı embriyonik doku hücresel Hofstede tanıtmak için CAM içinde büyüdü doku uzun vadeli kalkınma ve dokuların heterospecific derneğin chimeric organ oluşumu destekler 5. tüp bebek doku dernekler içinde vivo manipülasyonlar bazı sınırlamalar üstesinden. Örneğin, yerel yönetim uyuşturucu veya büyüme faktörleri (boncuk kullanarak) embriyo vivo içinde aksi ulaşılmaz bölgelerde, tüp bebek bu yaklaşımı kullanarak kolayca gerçekleştirilebilir. Bu daha önce faringeal bölge5organ oluşumu sırasında yerel doku etkileşimleri taklit etmek için göstermiştir.
Explants CAM5,7,8 ' büyüyen hasat daha az zaman alıcı ve zaman chimeric embriyo3vücut duvara aşılı doku toplama yöntemlerine göre izlemek için basit bir yöntem explants. Ayrıca, CAM hücre ve dokuların kuş diğer tür ile nakledilen ve geliştirme kanser14,15' e çeşitli deneysel bağlamlarda başarıyla kullanılmıştır. Örneğin, CAM tahlil daha önce fareler içine tavuk xenografts çalışmaları16 ' uygulandı ve sık sık insan tümör hücreleri15invaziv kapasitesini sınamak için kullanılır.
Son zamanlarda, insan içine tavuk xenograft ile zarif bir çalışma tavuk embriyo test etmek ve erken insani gelişme17keşfetmek için bir model olarak geçerliliği. Gelecekte, fare ve insan gelişim çalışmaları için ek yaklaşımlar sağlayabilir dokuların türler arası ilişkisi kullanılarak burada açıklanan yöntemi keşfetmek için ilginç olacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Isabel Alcobia için el yazması, eleştirel okuma için minnettarız yapmak video anlatımı için Mário Henriques ve Vitor Proa Instituto de Histologia e Biologia Histoloji hizmetinden Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, teknik destek için. Unidade de audiovisuais (görsel-işitsel birimi), Faculdade de Paulo Caeiro ve Hugo Silva için özellikle borçlu olduğumuzu Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa olağanüstü bağlılıklarını bu video üretimi için. Lütfen Interaves ve video sistemi ile donatılmış bir stereoscope sağlamak için Leica Microsystems anıyoruz - Sociedade Agro-Pecuária, S.A bıldırcın ile katkıda bulunmak için yumurta döllenmiş. Bu eser Faculdade de tarafından desteklenen Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
