Summary
Her presenterer vi en protokoll for en roman gapet krysset intercellulære kommunikasjon analysen utformet for høy gjennomstrømming screening av gapet krysset-modulerende kjemikalier for medisiner og toksikologisk vurdering.
Abstract
Gapet veikryss (GJs) er cellemembranen kanaler at spredningen av molekyler mindre enn 1 kDa mellom tilstøtende celler. Som de har fysiologiske og patologiske roller, er det behov for høy gjennomstrømming screening (HTS) analyser å identifisere GJ modulatorer i stoffet funnet og toksikologiske analyser. En roman iodide-gul fluorescerende protein-gap krysset-intercellulære kommunikasjon (I-YFP-GJIC) analysen oppfyller dette behovet. Det er en cellebasert analysen inkludert acceptor og donor cellene som er konstruert for å uttrykke stabilt en gul fluorescerende protein (YFP)-varianten, som fluorescens er følsomt slukket iodide eller SLC26A4, en iodide transporter, henholdsvis. Når iodide legges til en blandet kultur de to celletyper, de inn donor cellene via den SLC26A4 transporter og diffuse til tilstøtende acceptor cellene via GJs hvor de slukke YFP fluorescens. YFP fluorescens måles bra ved brønnen i kinetic modus. YFP slukke hastigheten gjenspeiler GJ aktivitet. Analysen er pålitelig og rask nok til å brukes for HTS. Protokollen for jeg-YFP-GJIC analysen bruker de LN215 cellene, menneskelige glioma celler, er beskrevet.
Introduction
Gapet veikryss (GJs) fungere som intercellulære kanaler slik at spredningen av små molekyler av < 1 kDa som næringsstoffer, metabolitter og signalnettverk molekylene mellom tilstøtende celler. Junctional elementene inkludere en hemichannel eller connexon i hver celle, og hver connexon utgjør seks connexins (Cxs)1. GJs og Cxs har blitt brukt i toksikologiske analyser av kreftfremkallende stoffer som Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH), som GJ hemmere2,3,4. Forstyrret GJIC har vært forbundet med nongenotoxic kreft5,6. Som potensielle terapeutiske mål, har GJ engasjement blitt rapportert i bestemte undergrupper av beslag7,8, beskyttelse mot hjerte og hjernen iskemi/reperfusion skade9, migrene med aura10, stoff-indusert leverskade6,11og12for sårtilheling. Høy gjennomstrømming screening (HTS) analyser er nødvendig å identifisere GJ-modulerende kjemikalier eller antistoffer for narkotika funn, for toksikologiske analyser, og identifisere romanen mobilnettet regulatorer GJ aktivitet. HTS-analyser kan også brukes til å undersøke strukturen-aktivitet relasjoner GJ, modulatorer,2,,13,,14,,15.
Noen GJIC analyser inkluderer fargestoff overføring eller dobbelt oppdateringen klemme teknikker. Lucifer gule CH (LY) og calcein acetoxymethyl ester (calcein-AM) har blitt brukt i Thermo-transfer analyser. Celler er ikke permeable til LY, som er innført av microinjection, skrape lasting eller electroporation. En gang inne i cellen, LY sprenges inn i nærliggende celler via GJs og GJ aktivitet er assayed av omfanget av LY migrasjon16. Calcein-AM analyser innebære vanligvis gap-fluorescens gjenoppretting etter photobleaching17,18. Calcein-AM er en celle-permeant fargestoff som konverteres intracellulært til ugjennomtrengelige calcein med en innebygd esterase. Analysen krever AC confocal mikroskop å observere overføring av calcein-AM i en celle fra de rundt etter laser photobleaching. Hvis funksjonelle GJs, calcein-AM i tilstøtende celler går inn photobleached cellene og fluorescensen er gjenopprettet. GJ aktivitet er assayed av omfanget av fluorescens utvinning av photobleached celler. Thermo-transfer analyser er arbeidskrevende og tidkrevende eller har lav følsomhet. Dobbel oppdateringen clamping er en elektrofysiologiske metode som måler junctional konduktans. Det er relativt følsom, med en direkte avhengighet av konduktans på antall åpne GJs19; men krevende den teknisk, tidkrevende og kostbar20. Jeg-YFP-GJIC analysen ble utviklet for bruk i HTS.
Figur 1 illustrerer komponentene og trinnene av-YFP GJIC analysen, som utnytter acceptor celler uttrykke en iodide-sensitive YFP variant med H148Q og I152L (YFPQL) og giver celler uttrykke en iodide transporter (SLC26A4)21 . To mutasjoner båret av YFPQL tillate slukke av fluorescens av iodide22. Iodides legges til co kulturperler acceptor og giver celler; de angir ikke acceptor celler, men tas av SLC26A4 transportører tilstede på donor cellene. Iodides i donor cellene diffus gjennom fungerende GJs i tilstøtende acceptor celler der de slukke YFPQL fluorescens. Hvis GJs er lukket eller blokkert av hemmere, angi ikke iodide acceptor cellene for å slukke fluorescensen. YFPQL slukke hastigheten gjenspeiler GJ aktivitet. YFP GJIC analysen prosedyren er verken komplisert eller tidkrevende. Den er kompatibel med HTS kan brukes til å teste effekten av et stort antall forbindelser GJ aktivitet i en relativt kort periode. Det krever bare acceptor og donor cellene, og to balansert salt løsninger. Protokollen beskrevet nedenfor er basert på LN215 celler med store Cx er Cx4321. LN215-YFPQL reseptoren og LN215-jeg− giver celler ble generert av signaltransduksjon med lentiviruses uttrykke YFPQL eller SLC26A421,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon lentiviruses uttrykke YFPQL og SLC26A4
- Vokse HEK293T menneskelige embryonale nyreceller 80% confluency på 100 mm kultur plater. Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin er kultur medium brukt gjennom protokollen for å opprettholde HEK293T og andre celler som er nevnt nedenfor.
- Pelsen 6-brønnen plater ved å legge 2 mL 0.005% av sterile poly-L-lysine (PLL) løsning i hver brønn for 10 min. Sug opp PLL løsningen og skyll overflaten to ganger med 2 mL sterilt vann.
- Vask av HEK293T celler med 10 mL fosfat bufret saltvann (PBS) og behandle celle monolayers i hver 100 mm rett med 2 mL 0,25% trypsin-EDTA løsning på 37 ° C i 3 min. legge 5 mL kultur medium og resuspend celler.
- Telle celler i en hemocytometer og justere tettheten av cellen suspensjon til 250 000 celler/mL i kultur medium og legge til 500.000 celler i 2 mL kultur medium til hver lysin-belagt godt av 6-og plater. Inkuber cellene i en fuktet 5% CO2/95 air atmosfæren på 37 ° C i 24 timer og deretter erstatte kultur medium med DMEM uten penicillin eller streptomycin.
- I en 1,5 mL tube, fortynne 20 µL av transfection reagensen med 500 µL av DMEM uten serum- eller antibiotika. Bland forsiktig av pipettering og la stå i romtemperatur i 5 minutter.
- I mellomtiden Pipetter 250 µL av DMEM i hver av to 1,5 mL rør og deretter legge 1500 ng pLVX-EIP-YFPQL eller pLenti6P-SLC26A4, 1225 ng av psPAX2 og 375 ng av pMD2.G til hver. To lentiviral plasmider har vært beskrevet tidligere21. Legge til 250 µL av utvannet transfection reagens til hver plasmider tube, bland forsiktig og ruge for 20 min ved romtemperatur.
- Etter 20 min, legge til 500 µL av transfection reagens og plasmider komplekser i 1,5 mL rør dropwise i hver kultur plate i trinn 1.4 og blanding av rocking platen frem og tilbake. Inkuber cellene på 37 ° C i en CO2 inkubator 12 h.
- Erstatt medium med 2,5 mL av fersk medium og Inkuber en ekstra 48 h. Plass kultur plate på is 5 min å holde betinget mediet som inneholder lentivirus kjølt for å opprettholde infectivity.
- Høste mediet som inneholder lentiviruses og overføre til 15 mL konisk rør. Sentrifuge 3000 x g ved 4 ° C i 3 minutter og deretter fjerne flytende HEK293T celler fra nedbryting av filtrering på 0,4 µm.
- Lagre mediet som inneholder lentiviruses på 4 ° C for bruk innen 2 dager. For senere bruk, lagre 200 µL dele på −80 ° C.
2. generasjon av LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler av lentiviral signaltransduksjon
- Vokse LN215 celler i 100 mm kultur plater til 80% confluency i DMEM med 10% fosterets bovin serum (FBS) 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin som beskrevet ovenfor.
Merk: Hvis jeg-YFP-GJIC analysen er utført med en annen celle linje, bruke aktuelle kultur medium. LN215-YFPQLog LN215-jeg- celler kan gis av University-industrien foundation, Yonsei universitet. Kontakt tilsvarende forfatteren. - En dag før transduction, vask cellene to ganger med 10 mL PBS, behandle med 2 mL 0,25% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 3 min. Resuspend cellene i 5 mL av kultur medium med en 10 mL serologiske pipette og justere tettheten til 50 000 celler/mL. Legge til 20.000 celler i 400 µL av media i hver brønn av en 24-brønnen plate for behandling som ingen virus kontroll, YFPQLog SLC26A4 celler.
- Etter 24 timer med inkubering på 37 ° C, transduce to brønner ved å erstatte kultur medium med 400 µL av en 1:1 blanding av pLVX-EIP-YFPQL eller pLenti6P-SLC26A4 lentivirus og frisk kultur medium med polybrene i en endelig konsentrasjon av 4 µg/mL. For ingen virus kontroller, kan du erstatte med kultur medium.
- Inkuber cellene på 37 ° C 15 h, Sug opp mediet som inneholder lentiviruses, legge til frisk kultur medium og ruge celler for en ytterligere 72 h.
Advarsel: For å hindre forurensning av lentivirus mellom brønner, bruke nye tips eller Pipetter for flergangsbruk for hver brønn når du Sug opp kultur medium som inneholder lentivirus eller dispensere frisk oppblomstringen medium. - Vask cellene i hver vel to ganger med 0,5 mL PBS, behandle med 300 µL av trypsin-EDTA for 3 min. Resuspend cellene i 2 mL kultur medium og plate i seks-brønnen plater med 2 µg/mL puromycin.
- Kultur cellene i mediet som inneholder 2 µg/mL puromycin til alle celler i kontrollen godt er død (rund-formet eller flytende når observert i mikroskop), som vanligvis tar en uke. Oppdater kultur media som inneholder puromycin annenhver dag i utvalg perioden. Hvis LN215-YFPQL eller LN215-jeg- kulturer bli confluent før valget er fullført, overføre cellene til 100 mm plate og fortsette utvalg som i trinn 2.5.
3. forberedelse av løsninger som kreves for analysen
- Forberede 500 mL av C-løsning (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 10 mM glukose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2og 1 mM CaCl2) og 500 mL av jeg-løsning (10 mM HEPES, 140 mM NaI, 10 mM glukose, 5 mM KCl og 1 mM CaCl2).
- Justere pH i begge løsninger 7,4 med 1 N NaOH, sterilisere løsninger av filtrations på 0,4 µm for lagring. Lagre på 4 ° C i opptil 1 måned. Sjekke pH før du bruker.
4. plating av LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler
- Kultur LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler i 100 mm plater separat i kultur medium for å nå befolkningen kreves for analysen. LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler i 40% og 80% confluency i 100 mm plater, henholdsvis, er nok for en 96-brønns plate analysen.
- En dag før gjennomfører-YFP GJIC analysen, vask hver 100 mm kultur plate med 10 mL PBS. Behandle hver plate med 2 mL 0,25% trypsin-EDTA og ruge på 37 ° C for 5 min. Resuspend cellene i hver plate i 4 mL av kultur medium og overføre til 15 mL konisk rør.
- Pellets cellene med sentrifugering 1000 x g for 3 min. Forkast nedbryting og resuspend hver celle pellets med 5 mL kultur medium. Bryte opp noen celle klumper i enkeltceller av pipettering opp og ned ca 20 ganger med en 10 mL serologisk pipette.
- Teller cellene i en hemocytometer, og fortynne cellene i kultur mediet å gjøre cellen suspensjoner av LN215-YFPQL på 80 000 celler/mL og LN215-jeg− på 160.000 celler/mL.
- Mix 7 mL av LN215-YFPQL og 7 mL av LN215-jeg− celle suspensjoner i et reservoar. Tilsett 100 µL av blandingen hver brønn av en 96-brønns celle kultur plate med en flerkanals pipette.
Merk: For å legge til 100 µL av blandingen i hver brønn av 96-brønns celle plate, ca 10 mL av mikset-celle suspensjon er nødvendig. Det anbefales å gjøre mer celle suspensjon enn nødvendig. - Inkuber cellene i fuktet 5% CO2/95% luft ved 37 ° C i 24 timer. LN215-YFPQL og LN215-jeg−cellekultur skal være 100% confluent når analysen blir utført.
5. drive-YFP GJIC analysen
Merk: Bruk fluorescens mikroskop med 20 x forstørrelse, og et GFP-filter for å kontroller 96-brønns platene at det er ingen klumper av LN215-YFPQL eller LN215-SLC26A4 celler, og som i cellekulturer er fullt confluent og godt fordelt før gjennomføre analysen.
- Minst 30 min før du gjør analysen, slå på en microplate og sett 37 ° C.
- Vask slangen av en automatisert injektoren med 3 mL 70% etanol, 3 mL destillert vann og 3 mL-løsning på en flow rate av 300 µL/s.
- Varm C - og jeg-løsningene til 37 ° C i vannbad.
Merk: 100 µL av hver løsning er nødvendig for hver brønn av 96-brønns plate ca 10 mL av hver løsning er nødvendig for hver analysen. En ekstra 10 mL av av-løsning er nødvendig for grunning hver plate (totalt 20 mL) og en ekstra 25 mL av C-løsningen er nødvendig for vask hver plate (totalt 35 mL). - Sug opp vekstmediet eller snu platen opp ned for å tømme. Trykk ut resterende medium.
Merk: Gjenværende fosterets bovin serum i vekst media fører bakgrunn fluorescens og en nedgang i analysen kvalitet. - Legge til 200 µL av C-løsning i hver brønn fra et reservoar bruker en flerkanals pipette. Sug opp C-løsningen eller snu platen opp ned tomme og trykk ut rester løsning.
- Legge til 50 µL µL C-løsning, 1 µL av 2,5 kjemiske lager (se tabell 1) eller dimethylsulfoxide (DMSO) som et redskap, og deretter 50 µL µL C-løsning i hver brønn med en flerkanals pipette.
Merk: De fleste reagenser i en kjemisk biblioteket er oppløst i DMSO og opp til 1% (v/v) er tillatt i de fleste cellebasert analyser24. Som DMSO har en høyere tetthet enn vann, reagenser oppløst i DMSO en tendens til å gå ned til bunnen når kultur plate fordelt, som forstyrrer konsentrasjonen av analysen løsninger. Dette kan omgås ved å legge til 50 µL av C-løsning, reagenser i DMSO og 50 µL C av - løsning i rekkefølge. Den siste 50 µL av C-løsning er for miksing. - Inkuber cellene på 37 ° C i luften, ikke i 5% CO2. Inkubasjon tiden kan endres, men 10 min er vanligvis tilstrekkelig for ion-kanals modulatorer å handle.
- Under inkubasjonen, sette microplate leser programmet å injisere 100 µL av jeg-løsning i hver brønn 1 s og måler fluorescens for 10 s med 0,4 s mellomrom. Angi til leseren å lese fluorescens fra bunnen. Anbefalte injeksjon hastigheten er 135 µL/s. sett eksitasjon bølgelengden til 485 nm og lese utslipp på 520 nm.
Merk: Detaljerte innstillinger for de microplate programmene er som følger.- Klikk Behandle protokoller .
- Klikk ny . Velg Fluorescens intensiteten i måling Metodeinndelingen og Godt modus i lesing modus delen. Klikk deretter OK . Ny fane vises.
- Rullegardinmenyen Grunnleggende parametre satt eksitasjon bølgelengden til 485 nm og utslipp på 520 nm. Velg den Nederste fiberoptisk lese fluorescens fra bunnen. Angi måling starttid skal "0 s", antall intervaller skal "25", antallet blinker per brønn, og intervallet skal "20", og intervalltiden skal "0,4 s".
- Tegne regionen av platen leses i Oppsett -menyen.
- Angi microplate leseren til å sprøyte 100 µL av jeg-løsning i hver brønn med 135 µL/s injeksjon hastighet i Konsentrasjoner/volumer/Shacking -menyen.
Merk: Unngå raskere injeksjon hastigheter fordi de kan føre til avdeling av celler. - I menyen injeksjon tid sette injeksjon starttidspunktet til 1 s. Klikk knappen Start måling .
- Etter inkubasjon setter 96-brønns platene i microplate leseren og starte målingen ved å klikke Start måling knappen igjen.
6. beregning av GJIC aktivitet
- Beregne prosentverdier YFPQL slukke og GJIC aktivitet som23
YFPQL slukke (%) =
GJIC aktivitet (%) =
Merk: I prinsippet-GJIC aktivitet, skal beregnes fra forskjellen i prosenter av YFP fluorescens i brønner acceptor celler og donor cellene og den tilsvarende acceptor-cellen bare brønner. Men som LN215-YFPQL celler viser ubetydelig YFP slukke av iodide etter 10 s, vi tar ikke i bakgrunnen YFP slukke hensyn når du utfører Hjemmekinosystem som bruker LN215-YFPQL og LN215-jeg- celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tjueni 96-brønnen platene ble brukt til skjermen 2,320 kjemikalier for å identifisere romanen GJIC modulatorer-YFP GJIC analysen ved hjelp av LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler. Resultatene som oppnås med en representant plate er vist i figur 2. Andelen YFP fluorescens i hver brønn vises som en linjediagrammet i figur 2A og prosentandelen av GJIC aktivitet i hver brønn vises i stolpediagrammet i figur 2B. Negative og positive kontrollene og 80 kjemikalier som ble vist er vist i tabell 1. Hver ble også behandlet med 25 µM av et sammensatt for 10 min. Terbinafine helt hemmet GJIC og homosalate hemmet ca 50% av GJIC. Terbinafine ble bekreftet som en GJ inhibitor. Sin dose-respons, Reversibilitet og andre eksperimentelle resultatene har vært publisert andre steder,23.
Figur 1 : Komponentene og trinnene til-YFP GJIC analysen (A) gul og mørk gul Femkanter representerer acceptor celler uttrykke YFPQL før og etter slukker. De svarte Femkanter er giver celler uttrykke SLC26A4. De røde linjene er SLC26A4 transportører blå stolpene er GJs. Rosa sirklene er iodides. Når GJs er åpen (øvre panel), iodides passerer gjennom SLC26A4 og angi giveren cellen. Iodides migrere til tilstøtende acceptor celler via GJs. Iodides quench YFP fluorescens acceptor cellene. Hvis GJs er lukket (nedre panel), iodides inn donor cellene kan ikke flytte til nærliggende acceptor cellene, og beholdes i donor cellene. YFP fluorescens acceptor cellene reduseres ikke betydelig etter iodides (B) kontrast og fluorescerende bilder innhentet når jeg-YFP-GJIC analysen. Når acceptor og donor cellene var belagt i forholdet 1:1, ble YFPQL slukke observert 1 min etter iodides ble lagt (øvre panel). Når bare acceptor celler var belagt, føre iodide behandling for 1 min ikke til betydelig YFPQL slukke21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant HTS resultater ved hjelp av analysen jeg-YFP-GJIC (A) suspensjon av 1:2 blandinger av LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler var belagt og ruges i 24 h, som beskrevet i Seksjon 4-protokollen. Cellene ble deretter vasket og behandlet med kjøretøy eller kjemikalier som protokollen seksjon 5. Alle kjemikalier var assayed som 25 µM prøver fra 2,5 lager løsninger i DMSO for 10 min. Hver inneholdt også 1 µL DMSO og 100 µL av C-løsning. Første og siste radene av platen ble tilordnet negative (vehicle) og positive (carbenoxolone) styrer. Gjenværende 80 brønnene ble brukt til skjerm kjemikalier oppført i tabell 1. Etter behandling, ble jeg-YFP-GJIC analysen utført godt-av-brønnen som protokollen seksjon 5. Andelen YFP fluorescens i hver brønn ved hver gang var normalisert verdi på 2 s og plottet mot tiden. Linjene i figuren representerer endringer i YFP fluorescens i hver brønn. YFP fluorescens i de fleste godt på 10 s varierte fra 70% til 80%. Terbinafine og homosalate var potensielle treff for GJ hemmere (B) stolpediagrammet viser prosent GJIC aktiviteten til hver av 96. Prosent GJIC aktiviteten var beregnet som vist i protokollen trinn 6.1 og tegnet i stolpediagrammet mot godt tallene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Vel nei. | Posisjon | Kjemisk | Vel nei. | Posisjon | Kjemisk |
| 1 | A01 | DMSO | 49 | E01 | DMSO |
| 2 | A02 | difloxacin hydroklorid | 50 | E02 | propofol |
| 3 | A03 | Betamethasone valerate | 51 | E03 | oleandomycin fosfat |
| 4 | A04 | Erythromycin | 52 | E04 | Mianserin hydrochloride |
| 5 | A05 | cyproheptadine hydroklorid | 53 | E05 | valsartan |
| 6 | A06 | liothyronine | 54 | E06 | salsalate |
| 7 | A07 | teofyllin | 55 | E07 | Hydrocortisone |
| 8 | A08 | tolnaftate | 56 | E08 | rifaximin |
| 9 | A09 | trimethobenzamide hydroklorid | 57 | E09 | adrenolone hydroklorid |
| 10 | A10 | cefamandole nafate | 58 | E10 | Imiquimod |
| 11 | A11 | dimethyl fumarate | 59 | E11 | nonoxynol-9 |
| 12 | A12 | CBX | 60 | E12 | CBX |
| 13 | B01 | DMSO | 61 | F01 | DMSO |
| 14 | B02 | Piracetam | 62 | F02 | ranolazine |
| 15 | B03 | gluconolactone | 63 | F03 | danthron |
| 16 | B04 | azlocillin natrium | 64 | F04 | acedapsone |
| 17 | B05 | kolin klorid | 65 | F05 | Atomoksetin hydrochloride |
| 18 | B06 | Atorvastatin kalsium | 66 | F06 | desoxycorticosterone acetate |
| 19 | B07 | oxyphencyclimine hydroklorid | 67 | F07 | tramadol hydrochloride |
| 20 | B08 | propafenone hydroklorid | 68 | F08 | Terbinafine hydrochloride |
| 21 | B09 | Fluconazole | 69 | F09 | topiramat |
| 22 | B10 | Lovastatin | 70 | F10 | gemifloxacin mesylate |
| 23 | B11 | bleomycin (bleomycin b2 vises) | 71 | F11 | pravastatin natrium |
| 24 | B12 | CBX | 72 | F12 | CBX |
| 25 | C01 | DMSO | 73 | G01 | DMSO |
| 26 | C02 | acesulfame kalium | 74 | G02 | levalbuterol hydroklorid |
| 27 | C03 | teniposide | 75 | G03 | Metformin hydrochloride |
| 28 | C04 | garvesyre | 76 | G04 | Pregabalin |
| 29 | C05 | carprofen | 77 | G05 | topotecan hydroklorid |
| 30 | C06 | Hydroxychloroquine sulfate | 78 | G06 | phenoxybenzamine hydroklorid |
| 31 | C07 | pentoxifylline | 79 | G07 | arecoline hydrobromide |
| 32 | C08 | mepivacaine hydroklorid | 80 | G08 | mepartricin |
| 33 | C09 | nilutamide | 81 | G09 | Pantoprazole |
| 34 | C10 | aminolevulinic syre hydrochloride | 82 | G10 | loperamide hydroklorid |
| 35 | C11 | aniracetam | 83 | G11 | Podofilox |
| 36 | C12 | CBX | 84 | G12 | CBX |
| 37 | D01 | DMSO | 85 | H01 | DMSO |
| 38 | D02 | Metaxalone | 86 | H02 | Levodopa |
| 39 | D03 | chloroguanide hydroklorid | 87 | H03 | ethisterone |
| 40 | D04 | Clarithromycin | 88 | H04 | enrofloxacin |
| 41 | D05 | modaline sulfate | 89 | H05 | sparteine sulfate |
| 42 | D06 | protirelin | 90 | H06 | Testosteron propionate |
| 43 | D07 | theobromine | 91 | H07 | pyridostigmine bromide |
| 44 | D08 | rosiglitazon maleate | 92 | H08 | enilconazole sulfate |
| 45 | D09 | losartan | 93 | H09 | Betamethasone natrium fosfat |
| 46 | D10 | Homosalate | 94 | H10 | azaserine |
| 47 | D11 | salicylanilide | 95 | H11 | acrisorcin |
| 48 | D12 | CBX | 96 | H12 | CBX |
Tabell 1. Liste over kjemikalier vist i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jeg-YFP-GJIC analysen kan brukes for HTS fordi det er robust, rask og billig. HTS analysen anses robust hvis Z "-faktor er over 0,525. Se Zhang et al. en beskrivelse av statistisk analyse brukes til å vurdere hensiktsmessigheten av HTS søk25. Når LN215 celler ble brukt, Z "-faktor var > 0,5 uten noen analysen optimalisering. Hvis andre celletyper brukes i analysen og dens Z "-faktoren er < 0,5 robusthet kan forbedres ved å utvide analysen tid21. LN215 og HOS, menneskelige osteosarcoma celler, celler trenger bare 10 s å få en Z "-faktor > 0,521. Analysen krever bare acceptor og donor cellene, den-løsningen og C-løsningen. Ingen flere reagenser, som LY og calcein-AM er nødvendig. En annen fordel med denne GJIC analysen er at den måler den totale GJIC aktiviteten til cellene i en enkelt brønn, som resulterer i lav mellom-og variasjon. Microinjection, gap-fluorescens gjenoppretting etter photobleaching (FRAP) og doble oppdateringen klemme analyser, kan en celle i området assayed påvirke målingen. Selv om skrape lasting analyser evaluere GJIC over et relativt stort område, kan skraping lasting prosedyren innføre betydelig variasjon26.
Kritisk trinnene for vellykket gjennomføring av jeg-YFP-GJIC analysen er som følger: PH av C - og jeg-løsningene må justeres 7,4 før bruk. YFPQL fluorescens er sterkt påvirket av pH samt halides22. En pH forskjell mellom de to løsningene kan føre til aberrant endringen i YFP fluorescens etter av-løsning. Giver og acceptor cellene må bli fullstendig atskilt før plating. Klumper av donor eller acceptor forstyrre analysen. Av blandet kultur skal være 100% å maksimere dannelsen av GJs mellom celler. Forholdet mellom acceptor donor cellene påvirker også analyseresultatene som beskrevet ved Lee et al. 21. som bare acceptor celler har YFP fluorescens, forhold og ordning av acceptor og donor cellene kan enkelt kontrolleres med fluorescens mikroskop før gjennomfører analysen. Det er viktig å vaske co kulturen med C-løsning for å fjerne gjenværende medium før behandling med kjøretøy eller kjemikalier. Gjenværende serum- eller fenol rødt fra kultur medium kan være en kilde til bakgrunnen fluorescens eller en uønsket fluorescens avsluttes, henholdsvis. De kan dermed avbryte jeg-YFP-GJIC analysen. Vekstfaktorer finnes i FBS kan også hemme GJIC27. På den annen side, kan serum sult føre apoptose28, som også kan akselereres av kjemiske rengjøringsmidler. I vår erfaring var acceptor og donor cellene friske etter behandling av mest vist kjemikalier på 25 µM i C-løsning uten serum for 10 min. Noen kjemikalier var ikke giftig selv etter behandling 4 h. Som kjemiske giftighet varierer, bør cellene tilstand sjekkes når behandling for lengre perioder kreves. Hvis cellene ikke er sunt, en tydelig reduksjon på YFP fluorescens som oppstår innen 1 s etter innføringen av den-løsningen kan skyldes celle avdeling. Som kan bekreftes av mikroskopiske observasjon av den involvert også.
Cellene som brukes i jeg-YFP-GJIC analysen bør oppfylle flere krav. De bør uttrykke GJs endogenously eller bli indusert skjemaet GJs. Som kanaler består av Cx43 er nesten like permeable å Atom kasjoner og anioner29, kan iodides overføre gjennom kanalene-YFP GJIC i LN215 celler. Hvis Cx kanalene i cellene rundt har lav iodide permeabilitet, men fritt at spredningen av Ca2 +kan jeg-YFP-GJIC analysen ikke være mulig. Fravær av iodide opptak aktivitet er et krav. I celler som uttrykker funksjonelle anion kanaler og opptak iodide raskt er ikke egnet for denne analysen. Cellevekst er en annen krav. Acceptor og donor cellene er generert av Albin på lentiviruses uttrykke YFPQL eller SLC26A4 og utvalg med puromycin for minst 1 uke19. Celler som vokser sakte eller har begrenset vekst som primære hepatocytter ikke er egnet for denne analysen. Vedheft av celler på overflaten av plast kultur-ware er også viktig. Celler som ikke holder seg godt, for eksempel HEK293 celler, er lett løsrevet ved innføring av av-løsning. Dette kan overvinnes ved belegg 96-brønns plater med PLL før plating. Imidlertid belegg platene er litt kjedelig, og unngå disse typer celler anbefales. I prinsippet primære celler som astrocyttene og hepatocytter keratinocytter er toksikologisk, fysiologisk og farmakologisk mer relevant enn kreftceller som glioma, hepatoma og basal celle carcinoma celler. Men gjør deres begrenset vekst priser dem uegnet for analysen. Fremtidige fremskritt i cellekultur at veksten av primære celler som oppfyller kravene ovenfor for lengre perioder, vil utvide toksikologiske, fysiologiske og farmakologiske vurderinger mulig med denne analysen.
YFP GJIC analysen kan brukes ikke bare for HTS, men også for å avgjøre om en celle type endogenously uttrykker funksjonelle GJs. Hvis cellene ikke har GJs, YFPQL slukke hastigheten observert i cocultured acceptor giver celler ikke ville være forskjellig fra observert når bare acceptor cellene var belagt. Hvis det var en betydelig forskjell i slukke priser, så uttrykke de opprinnelige cellene funksjonelle GJs. Som forskjellen tendens til å øke med tiden som vist i figur 2A, har denne analysen en større følsomhet å oppdage svak GJIC aktivitet enn skrape lasting eller gap-FRAP analyser. Kurset tidsdata, dose-respons relasjoner og vurdere Reversibilitet av GJ modulatorer kan fås med jeg-YFP-GJIC analysen23,30. Inducing uttrykk for en Cx rundt i celler uten funksjonell GJs og deretter generere acceptors og givere, kan-YFP bestemt Cx-GJIC analyser etablerte23. Denne analysen dermed gjør det mulig å fastslå IC50 verdier av en kjemisk på en bestemt type Cx.
Som de fleste HTS analyser, kan jeg-YFP-GJIC analysen produsere falske positive resultater som følge av endringer i SLC26A4, YFPQLeller cellular iodide permeabilitet. Som falske GJ hemming kan resultere fra hemming av SLC26A4 eller foreskrevet YFPQL til iodide, bør hver potensielle GJ hemmer testes med celler som coexpress YFPQL og SLC26A4. Hvis en potensiell GJ hemmer er en SLC26A4 blokkering eller en YFP desensitizer, er YFP slukke svekket. Tvert imot, påvirker en sann GJ hemmer ikke YFP slukke. Elektrofysiologiske metoder eller renset YFPQL kan skille mellom SLC26A4 blokkere og YFP desensitizers. GJ aktivator som sensitize YFP til iodide eller øke iodide permeabilitet via anion kanaler, Cx hemichannels, eller spesifikke toksiske effekter vil også gi falske positive resultater. Det bør fastsettes om potensielle GJ aktivator forbedre YFP slukker når bare acceptor celler er belagt. Hvis en kjemisk sensitizes YFPQL eller øker iodide permeabilitet, vil så det øke YFPQL slukke i acceptor cellekulturer uten givere. De to typene falske GJ aktivator kan skilles i andre GJ analyser, for eksempel skrape lasting eller FRAP eller bruker renset YFPQL protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammet gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, og 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
- Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K.
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D.
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
