Summary
Här presenterar vi ett protokoll för en roman gap junction kommunikationen analysen avsedd för high-throughput screening av gap junction-modulerande kemikalier för läkemedelsutveckling och toxikologisk bedömning.
Abstract
Gap-junctions (GJs) är cellmembranet kanaler som tillåter diffusionshastighet för molekyler som är mindre än 1 kDa mellan angränsande celler. Som de har fysiologiska och patologiska roller, finns det behov av high-throughput screening (HTS) analyser för att identifiera GJ modulatorer i drug discovery och toxikologiska analyser. En roman jodid-gul fluorescerande protein-gap junction-kommunikationen (I-YFP-GJIC)-analysen uppfyller detta behov. Det är en cell-baserad analys inklusive acceptor och givare celler som är konstruerade för att stabilt express en gul fluorescerande protein (YFP) variant, vars fluorescens är känsligt släckas av jodid, eller SLC26A4, en jodid transportören, respektive. När jodid tillsätts en blandad kultur av de två celltyper, de ange donatorcellerna via SLC26A4 transportören och diffusa till intilliggande acceptor celler via GJs där de släcka YFP fluorescensen. YFP fluorescens mäts väl av brunn i en kinetic läge. YFP släcka priset återspeglar GJ aktivitet. Analysen är tillförlitlig och snabb nog att användas för HTS. Protokollet för jag-YFP-GJIC analysen använder LN215 cellerna, mänskliga glioma celler, beskrivs.
Introduction
Gap-junctions (GJs) fungerar som intercellulära kanaler tillåta spridningen av små molekyler av < 1 kDa som näringsämnen, metaboliter och signalmolekyler mellan angränsande celler. Junktional element inkluderar en hemichannel eller connexon i varje cell och varje connexon utgör sex connexins (Cxs)1. GJs och Cxs har använts i toxikologiska analyser av cancerframkallande ämnen som polycykliska aromatiska kolväten (PAH), som är GJ-hämmare2,3,4. Störd GJIC har associerats med nongenotoxic carcinogenes5,6. Som potentiella terapeutiska mål, har GJ engagemang rapporterats i vissa subtyper av anfall7,8, skydd från hjärt och hjärna ischemi/reperfusion skada9, migrän med aura10, läkemedelsinducerad leverskada6,11och12för sårläkning. High-throughput screening (HTS) analyser krävs att identifiera GJ-modulerande kemikalier eller antikroppar för läkemedelsutveckling, för toxikologiska analyser, och identifiera nya cellulära regulatorer av GJ aktivitet. HTS-analyser kan också användas för att undersöka struktur-aktivitetssamband GJ modulatorer2,13,14,15.
Vissa GJIC analyser innehåller färgämne överföring eller dual patch clamp tekniker. Lucifer gul CH (LY) och calcein acetoximetyl ester (calcein-AM) har använts i dye-överföring analyser. Celler är inte genomsläppliga för LY, som introduceras av Mikroskop, skrapa lastning eller elektroporation. En gång inne i cellen, LY sprider sig till närliggande celler via GJs och GJ aktivitet har analyserats av omfattningen av de LY migration16. Calcein-AM analyser innebära brukar gap-fluorescens återhämtning efter fotoblekning17,18. Calcein-AM är ett cell-diffusionskoefficient färgämne som konverteras intracellulärt till ogenomtränglig calcein genom en inneboende esteras. Analysen kräver en confocal Mikroskop för att iaktta överföringen av calcein-AM i en cell från de omgivande efter laser fotoblekning. Om det finns funktionella GJs calcein-AM i intilliggande celler träder photobleached cellerna och fluorescensen återvinns. GJ aktivitet har analyserats av omfattningen av fluorescens återhämtning av photobleached celler. Dye-överföring analyser är mödosam och tidskrävande eller har låg känslighet. Dubbla patch fastspänning är en Elektrofysiologisk metod som mäter Junktional konduktans. Det är relativt känslig, med ett direkt beroende av konduktans antalet öppna GJs19; emellertid, det är tekniskt krävande, tidskrävande och dyra20. Jag-YFP-GJIC analysen har utvecklats för användning i HTS.
Figur 1 illustrerar komponenter och steg i jag-YFP GJIC analysen, som utnyttjar acceptor celler som uttrycker en jodid-känsliga YFP variant försedd med H148Q och I152L (YFPQL) och givare celler som uttrycker en jodid transportör (SLC26A4)21 . De två mutationer som bärs av YFPQL tillåta snabbkylning av fluorescens av jodid22. Jodider läggs och till co odlade acceptor donatorcellerna; de anger inte acceptor cellerna, men tas upp av SLC26A4 transportörerna närvarande på donatorcellerna. Jodider i donatorcellerna diffunderar genom fungerande GJs i intilliggande acceptor celler där de släcka YFPQL fluorescensen. Om GJs är stängda eller blockeras av hämmare, ange jodid inte acceptor cellerna för att släcka fluorescensen. YFPQL släcka priset återspeglar GJ aktivitet. Jag-YFP GJIC analysförfarandet är varken tidskrävande som komplicerade. Den är kompatibel med HTS och kan användas för att testa effekterna av ett stort antal föreningar på GJ aktivitet i en relativt kort period. Det kräver endast acceptor och givare celler och två balanserade salt lösningar. Protokollet beskrivs nedan bygger på LN215 celler vars stora Cx är Cx4321. Den LN215-YFPQL -receptorn och LN215-jag− donatorcellerna genererades av transduktion med lentiviruses uttrycker YFPQL eller SLC26A421,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generering av lentiviruses uttrycker YFPQL och SLC26A4
- Växa HEK293T mänskliga embryonala njurceller till 80% confluency på 100 mm kultur plattor. Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin är det odlingssubstrat som används i hela protokollet för att upprätthålla HEK293T och andra celler som nämns nedan.
- Kappa 6-väl kultur plattor genom att lägga 2 mL 0,005% av steril poly-L-lysin (PLL) lösning till varje brunn för 10 min. Aspirera PLL lösningen och skölj ytan två gånger med 2 mL sterilt vatten.
- Tvätta HEK293T celler med 10 mL av fosfat buffrad saltlösning (PBS) och behandla de cell enskiktslager i varje 100 mm skålen med 2 mL 0,25% trypsin-EDTA lösning vid 37 ° C i 3 min. Tillsätt 5 mL odlingsmedium och resuspendera cellerna.
- Räkna cellerna i en hemocytometer och justera densiteten av cellsuspensionen till 250 000 celler/mL i odlingsmedium och lägga till 500.000 celler i 2 mL odlingsmedium varje lysin-belagda väl av 6 brunnar. Inkubera cellerna i en fuktad 5% CO2/95% luft atmosfär vid 37 ° C under 24 h och sedan ersätta odlingssubstratet med DMEM utan penicillin eller streptomycin.
- I en 1,5 mL tub, späd 20 µL av transfection reagens med 500 µL av DMEM utan serum eller antibiotika. Blanda försiktigt genom pipettering och låt stå i rumstemperatur i 5 min.
- Samtidigt Pipettera 250 µL av DMEM i var och en av två 1,5 mL rör och sedan lägga till 1500 ng pLVX-EIP-YFPQL eller pLenti6P-SLC26A4, 1225 ng av psPAX2 och 375 ng av pMD2.G till varje. De två lentiviral plasmidsna har varit tidigare beskrivna21. Tillsätt 250 µL utspädda transfection reagensmedel till varje plasmid-röret, blanda försiktigt och inkubera i 20 min i rumstemperatur.
- Efter 20 min, tillsätt 500 µL transfection reagens och plasmid komplex i 1,5 mL rör droppvis i varje kultur plattan väl i steg 1.4 och blanda genom att vagga plattan fram och tillbaka. Inkubera cellerna vid 37 ° C i en CO2 inkubator för 12 h.
- Ersätta mediet med 2,5 mL färsk medium och inkubera i en ytterligare 48 h. Sedan placera kultur plattan på is för 5 min att hålla luftkonditionerade mediet som innehåller lentivirus kyld för att upprätthålla smittsamhet.
- Skörd i mediet som innehåller lentiviruses och överföra till 15 mL koniska rör. Centrifugera vid 3 000 x g vid 4 ° C för 3 min och sedan ta bort flytande HEK293T celler från supernatanten genom filtrering på 0,4 µm.
- Lagra i mediet som innehåller lentiviruses vid 4 ° C för användning inom 2 dagar. För senare användning, lagra 200 µL portioner vid −80 ° C.
2. generering av LN215-YFPQL och LN215-jag− celler av lentiviral transduktion
- Odla LN215 cellerna i 100 mm kultur plattor till 80% confluency i DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) 100 U/mL penicillin, och 100 µg/mL streptomycin som beskrivs ovan.
Obs: Om jag-YFP-GJIC analysen utförs med hjälp av en annan cell, Använd lämpliga odlingssubstratet. LN215-YFPQLoch LN215-jag– celler kan tillhandahållas av stiftelsen universitet och näringsliv, Yonsei University. Vänligen kontakta motsvarande författare. - En dag innan transduktion, tvätta cellerna två gånger med 10 mL PBS, behandla med 2 mL av 0,25% trypsin-EDTA vid 37 ° C i 3 min. resuspendera cellerna i 5 mL odlingsmedium med 10 mL serologic pipett och justera densiteten till 50.000 celler/mL. Tillsätt 20 000 celler i 400 µL av media till varje brunn 24-väl kultur platta för behandling eftersom inga virus kontroll, YFPQLoch SLC26A4 celler.
- Efter 24 h inkubation vid 37 ° C, transduce två brunnar genom att ersätta odlingssubstratet med 400 µL av en 1:1 blandning av pLVX-EIP-YFPQL eller pLenti6P-SLC26A4 lentivirus och färskt odlingssubstrat som kompletteras med polybrene med en slutlig koncentration på 4 µg/mL. För inga virus kontroller, ersätta med odlingsmedium.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i 15 h, aspirera mediet som innehåller lentiviruses, lägga till färsk odlingsmedium och inkubera cellerna för en ytterligare 72 h.
Varning: För att förhindra kontaminering av lentivirus mellan brunnar, Använd nya tips eller pipetter för varje brunn när du aspirera odlingsmedium som innehåller lentivirus eller avstå från färska odlingsmedium. - Tvätta cellerna i varje väl två gånger med 0,5 mL PBS, behandla med 300 µL av trypsin-EDTA för 3 min. Omsuspendera cellerna i 2 mL odlingsmedium och plattan i sex-väl kultur plattor med 2 µg/mL puromycin.
- Odla cellerna i media som innehåller 2 µg/mL puromycin tills alla celler i kontrollen väl är döda (runda eller flytande när observerats i Mikroskop), som tar vanligtvis en vecka. Uppdatera kultur media som innehåller puromycin varannan dag under urvalsperioden. Om LN215-YFPQL eller LN215-I– kulturer blivit konfluenta innan valet har avslutats, överföring celler till 100 mm platta och fortsätta urval som i steg 2.5.
3. beredning av lösningar som behövs för analysen
- Förbereda 500 mL C-lösning (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 10 mM glukos, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2och 1 mM CaCl2) och 500 mL av jag-lösning (10 mM HEPES, 140 mM NaI, 10 mM glukos, 5 mM KCl och 1 mM CaCl2).
- Justera pH-värdet i båda lösningarna till 7,4 med 1 N NaOH, sterilisera lösningarna av filtreringar vid 0,4 µm för lagring. Förvaras vid 4 ° C i upp till 1 månad. Kontrollera pH-värdet innan du använder.
4. plätering av LN215-YFPQL och LN215-jag− celler
- Kultur LN215-YFPQL och LN215-jag− celler i 100 mm plattor separat i odlingsmedium för att nå de populationer som krävs för analysen. LN215-YFPQL och LN215-jag− celler i 40% och 80% konfluens i 100 mm plattor, respektive, är tillräckliga för en plattan med 96 brunnar analys.
- En dag innan du utför jag-YFP GJIC analysen, tvätta varje 100 mm kultur platta med 10 mL PBS. Behandla varje platta med 2 mL 0,25% trypsin-EDTA-lösning och inkubera vid 37 ° C för 5 min. resuspendera cellerna i varje platta i 4 mL odlingsmedium och överföring till 15 mL koniska rör.
- Pellet cellerna genom centrifugering vid 1 000 x g i 3 min. Kassera supernatanten och återsuspendera varje cellpelleten med 5 mL odlingsmedium. Bryta upp någon cell klumpar i enstaka celler genom pipettering upp och ned ungefär 20 gånger med 10 mL serologiska pipett.
- Räkna cellerna i en hemocytometer, och späd cellerna i odlingsmediet att göra cellsuspensioner LN215-YFPQL 80 000 celler/ml och LN215-jag− på 160 000 celler/mL.
- Blanda 7 mL LN215-YFPQL och 7 mL LN215-jag− cellsuspensioner i en reservoar. Tillsätt 100 µL av blandningen till varje brunn 96 brunnar cell kultur platta med hjälp av en flerkanalspipett.
Obs: För att lägga till 100 µL av blandningen i varje brunn av plattan med 96 brunnar cell, behövs ca 10 mL blandad cellsuspension. Det är rekommenderat att göra mer cellsuspension än behövs. - Inkubera cellerna i tilluften 5% CO2/95% luft vid 37 ° C under 24 h. Den LN215-YFPQL och LN215-jag−cellkultur bör vara 100% konfluenta när analysen utförs.
5. genomför jag-YFP GJIC analysen
Obs: Använd fluorescens Mikroskop med 20 x förstoring, och en god Jordbrukarsed filtret för att kontrollera 96 brunnar plattorna att det finns inga klumpar av LN215-YFPQL eller LN215-SLC26A4 celler och att cellkulturer är fullt konfluenta och väl distribuerade före genomför analysen.
- Minst 30 min innan du gör analysen, slå på en mikroplattan och Ställ till 37 ° C.
- Tvätta slangen av en automatiserad injektor med 3 mL 70% etanol, 3 mL destillerat vatten och sedan 3 mL lösning med en flödeshastighet av 300 µL/s.
- Värma den C - och jag-lösningar till 37 ° C i vattenbadet.
Obs: 100 µL av varje lösning krävs för varje brunn plattan med 96 brunnar, cirka 10 mL av varje lösning krävs för varje analys. Ytterligare 10 mL av jag-lösningen som behövs för grundning varje platta (totalt 20 mL) och ytterligare 25 mL av C-lösningen som behövs för att tvätta varje platta (totalt 35 mL). - Aspirera odlingsmedium eller vänd på plattan för att tömma det; knacka ut kvarstående medel.
Obs: Kvarstående fetala bovint serum i tillväxt medier orsakar bakgrund fluorescens och en nedgång i analysens kvalitet. - Tillsätt 200 µL av C-lösning till varje brunn från en reservoar med hjälp av en flerkanalspipett. Aspirera C-lösningen eller vänd på plattan för att tömma och peka ut kvarvarande lösning.
- Tillsätt 50 µL µL C-lösning, 1 µL av 2,5 mM kemiska lager (se tabell 1) eller dimetylsulfoxid (DMSO) som ett fordon och sedan 50 µL µL C-lösning till varje brunn med en flerkanalspipett.
Obs: De flesta reagens i ett kemiskt bibliotek löses i DMSO och upp till 1% (v/v) är tillåtet i de flesta cellbaserade analyser24. DMSO har en högre densitet än vatten, tenderar reagenser upplöst i DMSO att gå ner till botten när de läggs till kultur plattan brunnar, som stör de assay lösningarna koncentrationer. Detta kan kringgås genom att lägga till 50 µL av C-lösning, reagenser i DMSO och 50 µL C - lösning i ordning. De senaste 50 µL av C-lösning är för blandning. - Inkubera cellerna vid 37 ° C i luften, inte i 5% CO2. Inkubationstiden kan ändras, men 10 min är normalt tillräcklig för jonkanal modulatorer att agera.
- Ställ in programmet microplate reader att injicera 100 µL av jag-lösning till varje brunn på 1 under ruvningen, s och mäta fluorescensen för 10 s 0,4 s mellanrum. Ställ in läsaren att läsa fluorescens från botten. Den rekommendera injektion-hastigheten är 135 µL/s. Set excitation våglängden till 485 nm och Läs utsläpp på 520 nm.
Obs: Detaljerade inställningar för microplate reader program är följande.- Klicka på knappen Hantera protokoll .
- Klicka på knappen ny . Välj Fluorescensintensiteten i mätning Metodavsnittet och Bra läge i behandlingen mode-sektionen. Klicka sedan på knappen OK . Ny flik visas.
- I menyn Grundegenskaper , ange excitation våglängden till 485 nm och utsläpp på 520 nm. Välj den Nedre fiberoptiska att läsa fluorescens från botten. Ange mätning starttid vara ”0 s”, antalet intervaller vara ”25”, antalet blinkningar per brunn, och intervallet vara ”20” och intervalltid att vara ”0,4 s”.
- I menyn Layout Rita region av plattan för att läsas.
- I Koncentrationer/volymer/Shacking menyn, ange mikroplattan läsaren att injicera 100 µL av jag-lösning till varje brunn med 135 µL/s injektion hastighet.
Obs: Undvik injektion snabbare eftersom de kan resultera i avskildhet av celler. - I menyn injektion tid Ange starttiden injektion vara 1 s. Klicka sedan på Starta mätningen -knappen.
- Efter inkubation, placera 96 brunnar plattorna i microplate reader och starta mätningen genom att klicka på Starta mätningen -knappen igen.
6. beräkning av GJIC aktivitet
- Beräkna procentsatserna för YFPQL snabbkylning och GJIC aktivitet som23
YFPQL kylning (%) =
GJIC aktivitet (%) =
Obs: I princip GJIC verksamhet bör beräknas utifrån skillnaden mellan procentsatserna för YFP fluorescens i brunnar med acceptor och givare celler och motsvarande acceptor-cell endast brunnar. Men som LN215-YFPQL celler visar försumbar YFP snabbkylning av jodid efter 10 s, vi tar inte den bakgrund YFP snabbkylning hänsyn när de utför HTS med hjälp av LN215-YFPQL och LN215-jag– celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tjugonio 96 brunnar kultur plattor användes till skärm 2 320 kemikalier för att identifiera roman GJIC modulatorer av jag-YFP GJIC analys med hjälp av LN215-YFPQL och LN215-jag− celler. De resultat som erhålls med en representativ platta visas i figur 2. Procentandelen av YFP fluorescens i varje brunn visas som en linje graf i figur 2A och procentandelen av GJIC aktivitet i varje brunn visas i stapeldiagrammet i figur 2B. Negativa och positiva kontrollerna och de 80 kemikalier som screenades visas i tabell 1. Varje var väl behandlad med 25 µM av en förening för 10 min. terbinafin helt inhiberad GJIC och homosalate hämmade cirka 50% av GJIC. Terbinafin bekräftades som en GJ-hämmare. Dess dos-respons, reversibilitet och andra experimentella resultat har varit publicerad någon annanstans23.
Figur 1 : Komponenter och steg i jag-YFP GJIC analysen (A), den gula och mörka gul pentagoner representerar acceptorn celler som uttrycker YFPQL före och efter kylning. De svarta femhörningar är givare celler som uttrycker SLC26A4. De blå staplarna är GJs och de röda staplarna är SLC26A4 transportörer. De rosa cirklarna är Jodider. När GJs är öppna (övre panel), Jodider passera SLC26A4 och ange cellen givare. Jodider migrera till intilliggande acceptor celler via GJs. Jodider quench YFP fluorescensen av acceptor cellerna. Om GJs är stängda (nedre panelen), Jodider in donatorcellerna kan inte flytta till de angränsande acceptor cellerna och finns kvar endast i donatorcellerna. YFP fluorescensen av acceptor cellerna minskas inte avsevärt efter tillägg av Jodider (B) faskontrast och fluorescerande bilder erhålls när man gör ett jag-YFP-GJIC test. När acceptor och donatorcellerna var klädd i förhållandet 1:1, observerades YFPQL snabbkylning 1 min efter Jodider lades (övre panel). När endast acceptor celler var förgylld, ledde jodid behandling för 1 min inte till betydande YFPQL snabbkylning21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representant HTS resultat med jag-YFP-GJIC analys (A) suspensioner av 1:2 blandningar av LN215-YFPQL och LN215-jag− celler var klädd och inkuberas i 24 h, som beskrivs i avsnitt 4-protokollet. Cellerna var sedan tvättas och behandlade med fordon eller kemikalier som i protokollet avsnitt 5. Alla kemikalier analyserades som 25 µM prover från 2,5 mM stamlösningar i DMSO i 10 min. Varje innehöll väl 1 µL DMSO och 100 µL av C-lösning. Första och sista raderna av plattan tilldelades till negativa (vehikel) och positiva (carbenoxolon) kontroller. De återstående 80 brunnarna användes till skärmen kemikalier som förtecknas i tabell 1. Efter behandling genomfördes jag-YFP-GJIC analysen väl-av-väl som i protokollet avsnitt 5. Procentandelen av YFP fluorescens i varje brunn vid varje tidpunkt var normaliserade värde på 2 s och plottas mot tiden. Linjerna i figuren representerar förändringar i YFP fluorescens i varje brunn. YFP fluorescensen i de flesta väl 10 s varierade från 70% till 80%. Terbinafin och homosalate var potentiella hits för GJ-hämmare (B), stapeldiagrammet visar procent GJIC aktiviteten av varje av de 96 brunnarna. Procent GJIC aktiviteten beräknades som visas i protokollet steg 6.1 och ritade i stapeldiagrammet mot väl siffrorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Väl No. | Ställning | Kemiska | Väl No. | Ställning | Kemiska |
| 1 | A01 | DMSO | 49 | E01 | DMSO |
| 2 | A02 | difloxacin hydroklorid | 50 | E02 | propofol |
| 3 | A03 | betametason linalil | 51 | E03 | oleandomycin fosfat |
| 4 | A04 | erytromycin | 52 | E04 | Mianserin hydroklorid |
| 5 | A05 | cyproheptadin hydroklorid | 53 | E05 | valsartan |
| 6 | A06 | liotyronin | 54 | E06 | salsalate |
| 7 | A07 | teofyllin | 55 | E07 | hydrokortison |
| 8 | A08 | tolnaftate | 56 | E08 | rifaximin |
| 9 | A09 | trimethobenzamide hydrochloride | 57 | E09 | adrenolone hydrochloride |
| 10 | A10 | cefamandole nafate | 58 | E10 | imiquimod |
| 11 | A11 | dimetylfumarat | 59 | E11 | Nonoxynol-9 |
| 12 | A12 | CBX | 60 | E12 | CBX |
| 13 | B01 | DMSO | 61 | F01 | DMSO |
| 14 | B02 | Piracetam | 62 | F02 | ranolazin |
| 15 | B03 | glukonolakton | 63 | F03 | danthron |
| 16 | B04 | azlocillin natrium | 64 | F04 | acedapsone |
| 17 | B05 | kolinklorid | 65 | F05 | Atomoxetine hydrochloride |
| 18 | B06 | atorvastatin kalcium | 66 | F06 | desoxycorticosterone acetat |
| 19 | B07 | oxyphencyclimine hydrochloride | 67 | F07 | Tramadol hydrochloride |
| 20 | B08 | propafenon hydroklorid | 68 | F08 | terbinafin hydroklorid |
| 21 | B09 | flukonazol | 69 | F09 | topiramat |
| 22 | B10 | lovastatin | 70 | F10 | gemifloxacin mesylate |
| 23 | B11 | bleomycin (bleomycin b2 visas) | 71 | F11 | pravastatinnatrium |
| 24 | B12 | CBX | 72 | F12 | CBX |
| 25 | C01 | DMSO | 73 | G01 | DMSO |
| 26 | C02 | acesulfamkalium | 74 | G02 | levalbuterol hydrochloride |
| 27 | C03 | teniposide | 75 | G03 | metforminhydroklorid |
| 28 | C04 | garvsyra | 76 | G04 | Pregabalin |
| 29 | C05 | karprofen | 77 | G05 | topotecanhydroklorid |
| 30 | C06 | hydroxiklorokin sulfat | 78 | G06 | phenoxybenzamine hydrochloride |
| 31 | C07 | pentoxifyllin | 79 | G07 | Arekolin hydrobromid |
| 32 | C08 | mepivacaine hydrochloride | 80 | G08 | mepartricin |
| 33 | C09 | nilutamide | 81 | G09 | pantoprazol |
| 34 | C10 | aminolevulinsyra syra hydroklorid | 82 | G10 | loperamid hydroklorid |
| 35 | C11 | Aniracetam | 83 | G11 | Galderma |
| 36 | C12 | CBX | 84 | G12 | CBX |
| 37 | D01 | DMSO | 85 | H01 | DMSO |
| 38 | D02 | metaxalone | 86 | H02 | levodopa |
| 39 | D03 | chloroguanide hydrochloride | 87 | H03 | ethisterone |
| 40 | D04 | klaritromycin | 88 | H04 | enrofloxacin |
| 41 | D05 | modaline sulfat | 89 | H05 | Spartein sulfat |
| 42 | D06 | protirelin | 90 | H06 | testosteron propionate |
| 43 | D07 | teobromin | 91 | H07 | pyridostigminbromid metylbromid |
| 44 | D08 | rosiglitazonmaleat | 92 | H08 | enilconazol sulfat |
| 45 | D09 | Losartan | 93 | H09 | betametason natriumfosfat |
| 46 | D10 | homosalate | 94 | H10 | azaserine |
| 47 | D11 | salicylanilide | 95 | H11 | acrisorcin |
| 48 | D12 | CBX | 96 | H12 | CBX |
Tabell 1. Förteckning över kemikalier som screening i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jag-YFP-GJIC analysen kan användas för HTS eftersom det är robust, snabb och billig. En HTS analysmetod anses robust om Z'-faktor är över 0,525. Se Zhang et al. en beskrivning av den statistiska analysen används för att bedöma lämpligheten hos HTS analyser25. När LN215 celler användes, Z'-faktorn var > 0,5 utan någon assay optimering. Om andra celltyper som används i analysen och dess Z'-faktorn är < 0.5, robustheten kan förbättras genom att utvidga den assay tid21. LN215 och HOS, mänskliga osteosarkom celler, celler behöver endast 10 s att få en Z'-faktor > 0,521. Analysen kräver endast acceptor och givare celler, jag-lösningen och C-lösningen. Det behövs ingen ytterligare reagens, såsom LY och calcein-AM. En annan fördel med denna GJIC analys är att den mäter den totala GJIC aktiviteten av cellerna i en enda brunn, vilket resulterar i låg mellan-väl variabilitet. I Mikroskop, gap-fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) och dual patch clamp analyser, kan en cell i området analyseras märkbart påverka mätningen. Även om skrapa lastning analyser utvärdera GJIC över ett relativt stort område, kan det skrapning-Ladda tillvägagångssättet införa betydande variabilitet26.
De kritiska steg för lyckad beteende jag-YFP-GJIC analysens är följande. PH av C - och jag-lösningarna måste justeras till 7,4 före varje användning. YFPQL fluorescens påverkas starkt av pH samt av halogenider22. En pH skillnaden mellan de två lösningarna kan leda till avvikande förändring i YFP fluorescens efter tillägg av jag-lösningen. Givare och acceptor cellerna måste särskiljas helt före plätering. Klumpar av givaren eller acceptor celler störa analysen. Sammanflödet av blandad kultur bör vara 100% att maximera bildandet av GJs mellan celler. Förhållandet mellan acceptor till donatorcellerna påverkar också assay resultaten som beskrivs av Lee et al. 21. som endast acceptor celler har YFP fluorescens, de arrangemang av acceptor och givare celler och kan enkelt kontrolleras med fluorescens Mikroskop innan du utför analysen. Det är viktigt att tvätta samtidig kulturen med C-lösning att ta bort kvarvarande medel innan behandling med fordon eller kemikalier. Kvarstående serum eller fenolrött från odlingssubstratet kan vara en källa till bakgrunden fluorescens eller en oönskad fluorescens törstsläckare, respektive. De kan således avbryter jag-YFP-GJIC analysen. Tillväxtfaktorer finns i FBS kan också hämma GJIC27. Å andra kan serum svält så småningom leda apoptos28, som också kan påskyndas genom kemisk behandling. Vår erfarenhet var acceptor och givare cellerna frisk efter behandling av skärmad mest kemikalier vid 25 µM i C-lösning utan serum i 10 min. Vissa kemikalier var inte giftig även efter behandling för 4 h. Som kemiska toxicitet varierar, bör villkora av cellerna kontrolleras noggrant när behandling under längre perioder krävs. Om cellerna inte är hälsosamt, en uppenbar minskning av YFP fluorescens som inträffar inom 1 s efter införandet av jag-lösningen kan leda från cell avlossning. Som kan bekräftas genom mikroskopisk observation av de involverade väl.
Cellerna som används i jag-YFP-GJIC analysen bör uppfylla flera krav. De bör uttrycka GJs endogenously eller förmås att formuläret GJs. Kanaler som består av Cx43 är nästan lika genomsläpplig Atom katjoner och anjoner29, kan Jodider migrera genom kanaler i jag-YFP GJIC i LN215 celler. Om Cx kanalerna i cellerna i intresse har låg jodid permeabilitet men fritt tillåta spridningen av Ca2 +, eventuellt inte jag-YFP-GJIC analysen. Avsaknad av jodid upptag aktivitet är ett krav. De celler som uttrycker funktionella anjon kanaler och upptag jodid snabbt är inte lämpliga för denna analys. Cellernas tillväxt är ett annat krav. Acceptor och givare celler genereras av transduktion av lentiviruses uttrycker YFPQL eller SLC26A4 och urval med puromycin för minst 1 vecka19. Celler som växer långsamt eller har begränsad tillväxt såsom primära hepatocyter lämpar sig inte för denna analys. Vidhäftning av celler på ytan av den plastiska kultur-ware är också viktigt. Celler som inte klibbar fast, såsom HEK293 celler, är enkelt fristående vid införandet av jag-lösningen. Detta kan lösas genom beläggning 96 brunnar med PLL före plätering. Men beläggning plattor är ett jobbigt steg och undvika dessa typer av celler rekommenderas. Primära celler som astrocyter, hepatocyter och keratinocyter är i princip toxikologiskt, fysiologiskt, och farmakologiskt mer relevanta än cancerceller som gliom, hepatom och basala cell carcinom celler. Men gör deras begränsad tillväxt dem olämpliga för analysen. Framtida framsteg i cellodling som gör att tillväxten av primära celler som uppfyller ovanstående krav för längre perioder, skulle bredda de toxikologiska, fysiologiska och farmakologiska bedömningarna som möjligt med denna analys.
Jag-YFP GJIC analysen kan användas inte bara för HTS, utan också för att fastställa huruvida en celltyp endogenously uttrycker funktionella GJs. Om cellerna inte har GJs, YFPQL släcka hastigheten hos cocultured acceptor och donatorcellerna skulle inte vara annorlunda än den observerade när endast acceptor celler var klädd. Om det fanns en signifikant skillnad i släcka priserna, då uttrycka de ursprungliga cellerna funktionella GJs. Som skillnaden tenderar att öka med tiden som visas i figur 2A, har denna analys en större känslighet för upptäcka svaga GJIC aktivitet än skrapa-lastning eller gap-FRAP analyser. Kursen tidsdata, dos-responssamband och bedöma reversibiliteten av GJ modulatorer kan erhållas med jag-YFP-GJIC assay23,30. Genom att inducera ett uttryck för en Cx sevärdheter i celler saknar funktionell GJs och sedan generera acceptorer och givare, kan jag-YFP specifika Cx-GJIC analyser vara etablerade23. Denna analys gör det således möjligt att fastställa IC50 värden av en kemikalie på en viss typ av Cx.
Som de flesta HTS-analyser, kan jag-YFP-GJIC analysen producera falska positiva resultat som följd av förändringar i SLC26A4, YFPQLeller cellulära jodid permeabilitet. Som falska GJ hämning kan bero på hämning av SLC26A4 eller Desensibilisering av YFPQL jodid, bör varje potentiell GJ-hämmare testas använder celler som coexpress YFPQL och SLC26A4. Om en potentiell GJ-hämmare är en SLC26A4-blockerare eller en YFP desensitizer, dämpas YFP snabbkylning. En sann GJ-hämmare påverkar däremot inte YFP snabbkylning. Elektrofysiologiska metoder eller renat YFPQL kan diskriminera mellan SLC26A4-blockerare och YFP desensitizers. GJ aktivatorer som medvetandegöra YFP till jodid eller öka jodid permeabilitet via anjon kanaler, Cx hemichannels, eller ospecifik toxiska effekter kommer också att ge falskt positiva resultat. Det bör fastställas huruvida potentiella GJ aktivatorer förbättra YFP kylning när endast acceptor celler är klädd. Om en kemikalie väcker intresse YFPQL eller ökar jodid permeabilitet, kommer sedan det öka YFPQL kylning i cellodlingar acceptor utan givare. De två typerna av falska GJ aktivatorer kan särskiljas i andra GJ analyser, såsom skrapa lastning eller FRAP eller använda renat YFPQL protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av den grundläggande vetenskap forskningsprogrammet genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av undervisningsministeriet (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, och 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
- Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K.
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D.
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
