Este protocolo descreve um método eficiente para sintetizar uma Nanoemulsão de um conjugado de oleico acids-platinum(II) estabilizado com um tripéptido fenilalanina-lisina-tirosina (KYF). As formas de Nanoemulsão sob condições sintéticas suaves através de auto-montagem do KYF e o conjugado.
Nós descrevemos um método para produzir uma Nanoemulsão composta de um núcleo de acids-Pt(II) oleico e um revestimento (KYF) de fenilalanina-lisina-tirosina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE encapsula Pt(II) a 10% do peso, tem um diâmetro de 107 ± 27 nm e uma carga negativa de superfície. KYF-Pt-NE é estável na água e no soro e é biologicamente ativo. A conjugação de um fluoróforo para KYF permite a síntese de uma Nanoemulsão fluorescente que é apropriado para a imagem latente biológica. A síntese da Nanoemulsão é executada em um ambiente aquoso e as formas de KYF-Pt-NE através de auto-montagem de um peptídeo KYF curto e um conjugado acids-platinum(II) oleico. A auto-montagem processo depende da temperatura da solução, a razão molar entre os substratos e a taxa de fluxo da adição de substrato. Etapas cruciais incluem mantendo a taxa ideal de agita durante a síntese, permitindo tempo suficiente para self-assembly e pre-concentrando a Nanoemulsão gradualmente em um concentrador centrífugo.
Nos últimos anos, tem havido um interesse crescente na engenharia de nanopartículas para tais aplicações biomédicas, como a entrega da droga e bioimaging1,2,3,4. A multifuncionalidade dos sistemas baseados em nanopartículas necessita frequentemente incorporando vários componentes dentro de uma formulação. Os blocos de construção que são baseados em lipídios ou polímeros muitas vezes diferem em termos de suas propriedades físico-químicas, bem como sua biocompatibilidade e biodegradabilidade, que em última análise, pode afetar a função do nanostructure1, 5,6. Biologicamente derivada de materiais, tais como proteínas e peptídeos, há muito foram reconhecidos como promissoras componentes de nanoestruturas multifuncionais devido à sua flexibilidade de sequência7,8. Peptídeos auto-montagem em arquiteturas supramoleculares altamente ordenadas, formando helicoidal fitas9,10, andaimes fibroso11,12e muitos mais, abrindo assim o caminho para a construção -híbrida biomolécula nanoestruturas usando um ascendente abordagem13.
Peptídeos têm sido explorados para aplicações em medicina e biotecnologia, especialmente para a terapia anticâncer14 e doenças cardiovasculares15 , bem como para desenvolvimento de antibióticos16,17, metabólica distúrbios de18e infecções19. Há mais de uma centena de pequenas-peptídeo terapêutica submetidos a ensaios clínicos20. Peptídeos são fáceis de modificar e rápido para sintetizar a baixo custo. Além disso, eles são biodegradáveis, que facilita muito suas aplicações biológicas e farmacêuticas21,22. O uso de peptídeos como componentes estruturais inclui a engenharia de nanopartículas responsivos, baseado em peptídeo e depósitos de hidrogel para liberação controlada23,24,25,26 , 27, baseado em peptídeo biosensores28,29,30,31ou dispositivos bio-elétrica32,33,34. Importante, nem curtos peptídeos com dois ou três resíduos de aminoácidos que incluem fenilalanina foram encontrados para guiar a auto-montagem processa35,36,37 e criar emulsões estabilizadas38 .
Drogas baseada em platina, devido a sua alta eficácia, são usadas em muitos esquemas de tratamento de câncer, tanto sozinho como em combinação com outros agentes39,40. Compostos de platina induzem danos ao DNA, formando ligações cruzadas de monoadducts e intrastrand ou interstrand. As lesões do ADN-Pt são reconhecidas pela maquinaria celular e, se não reparado, levam a apoptose celular. O mecanismo mais importante, pelo qual Pt(II) contribui para a morte de células de câncer, é a inibição da transcrição de DNA41,42. No entanto, os benefícios da terapia de platina são diminuídos pela toxicidade sistêmica de Pt(II) que provoca efeitos colaterais graves. Isto leva a baixa dosagem clínica de Pt(II)43, que muitas vezes resulta em concentrações subterapêuticas de platina, atingindo o DNA. Como consequência, a reparação do DNA que segue contribui para a sobrevivência de células de câncer e adquirir resistência Pt(II). A quimioterapia-resistência de platina é um grande problema na terapia anticâncer e a principal causa de falha de tratamento44,45.
Nós desenvolvemos um nanosystem estável que encapsula o agente Pt(II) a fim de proporcionar um efeito de blindagem na circulação sistêmica e para diminuir os efeitos colaterais Pt II-induzida. O sistema é baseado em um núcleo de oleico acids-Pt(II) estabilizado com um tripéptido KYF para formar uma Nanoemulsão (KYF-Pt-NE)46. Os blocos de construção de KYF-Pt-NE, os aminoácidos do tripeptídeo, bem como o ácido oleico, têm o estatuto de geralmente reconhecidos como seguros (GRAS) com a Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE é preparada usando um método de nanoprecipitation47. Em suma, o conjugado acids-Pt(II) oleico é dissolvido em um solvente orgânico e em seguida adicionado gota a gota à solução aquosa KYF (Figura 1) a 37 ° C. A solução é agitada por várias horas permitir a auto-montagem do KYF-Pt-ne A Nanoemulsão está concentrada em 10 kDa de concentradores centrífugos e lavada três vezes com água. A modificação química do KYF com um fluoróforo permite a síntese de fluorescente FITC-KYF-Pt-NE apropriado para a imagem latente biomedical.
Passos críticos na síntese Nanoemulsão incluem ajustando a relação molar entre os substratos, mantendo controle de taxa de fluxo e temperatura durante a adição de acids–Pt(II) oleico, proporcionando tempo suficiente para auto-montagem e purificar o produto usando um coluna de concentrador centrífugo. Estes parâmetros influenciam o tamanho e morfologia de KYF-Pt-NE; assim, é particularmente importante manter a relação molar adequada e ajustar as condições sintéticas corretamente.
<p class="jove_conten…The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos, com gratidão, apoio financeiro do Instituto Nacional de câncer, conceda SC2CA206194. Sem interesses financeiros concorrentes são declarados.
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |