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用于表征复杂天然有机物混合物的单吞吐量互补高分辨率分析技术

doi: 10.3791/59035 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

该协议描述了互补分析和组学技术的单一吞吐量, 最终形成了不同生态系统中天然有机物和微生物蛋白质组学的完全配对特征。这种方法可以进行强有力的比较, 以确定代谢途径和转化, 这对于描述温室气体的产生和预测对环境变化的反应十分重要。

Abstract

天然有机物 (nom) 是由数千种有机化合物组成的高度复杂的混合物, 历史上证明很难表征。然而, 为了了解由 nom 分解而产生的温室气体 (二氧化碳 [co2] 和甲烷 [ch4]) 生产的热力学和动力学控制, 该分子水平的特性与微生物结合在一起蛋白质组分析是必要的。此外, 气候和环境变化预计将扰乱自然生态系统, 有可能破坏复杂的相互作用, 影响有机物质底物的供应和进行转变的微生物。要预测环境变化影响的方向和大小, 就必须对有机物、微生物蛋白质组学以及有机物分解的途径和转化进行详细的分子描述。本文介绍了通过直接注射傅里叶变换离子回旋共振质谱法 (fticr-ms)、气相色谱质谱 (gc-ms) 对单个样品进行综合代谢物表征的方法学吞吐量,核磁共振 (nmr) 光谱、液相色谱质谱 (lc-ms) 和蛋白质组学分析。这种方法产生了一个完全配对的数据集, 提高了推断有机物分解路径、由此产生的 co2 和 ch4 产率及其对环境扰动的反应的统计信心。在此基础上, 我们提出了将该方法应用于从泥炭地采集的 nom 样本的结果;但是, 该协议适用于任何 nom 样品 (例如泥炭、森林土壤、海洋沉积物)。

Introduction

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在全球范围内, 湿地估计含有 529 pg 的碳 (c), 主要是埋在泥炭矿床1中的有机 c。目前, 这类泥炭地起到了净 c 汇的作用, 仅在北美有 29 tg c-1。然而, 排水、火灾、干旱和温度升高等环境干扰可以通过增加有机物分解来抵消这种 c 汇,从而通过温室气体 (二氧化碳 [co2] 和甲烷 [ch4]) 生产1,2。如果温度升高或干燥机条件刺激微生物更快地分解 c, 气候变化可能会导致 c 损失。另外, 较高的温度和空气二氧化碳浓度可能会刺激初级生产, 以将更多的 co2 作为有机碳 (oc) 来固存.然后将 oc 分解为 co2 和 ch4 的程度和速度取决于电子供体基板、电子受体的可用性以及介导转型。在许多情况下, 这些机制的特点并不好, 因此它们对环境扰动的反应没有得到很好的限制, 气候变化对泥炭地生态系统碳平衡的净结果仍然不清楚。

天然有机物 (nom) 的复杂性使得即使是识别 nom 混合物中存在的有机化合物也变得困难。最近的进展大大提高了我们对传统上被视为顽抗的腐殖质或黄腐化合物化合物的特性的能力, 3,4,5。我们现在了解到, 这些化合物中的许多实际上是微生物可用的, 如果一个合适的终端电子受体 (tea) 可用6,7, 可能会被分解。计算化合物的碳 (nosc) 的名义氧化状态为预测分解潜力和所需的 tea 的能量产率提供了一个指标。然而, 它需要分子水平的表征的有机物 7.nosc通过以下等式7计算: nosc =-(-z + 4 (#C) + (#H)-3 (#O) + 5 (#P)-2 (#S))/(#C)) + 4, 其中 z 为净电荷。nosc 与热力学驱动力8相关, 其中具有较高的 nosc 的化合物更容易降解, 而具有较低的 nosc 的化合物需要越来越高的能量 tea 才能减少。nosc 小于-2 的化合物需要高能量产生的 tea, 如 o2、硝酸盐或锰iv, 并且不能通过通常发生的较低的能量产生的 tea (如fe iii或 thatif7) 而降解.这是一个重要的考虑因素, 在湿地的水淹缺氧条件下发现, 那里的 o2和其他高能量产生的 tea 很少9 , 因此, 在这些条件下, 低 nosc 化合物的降解是热力学上的限制。环境扰动可以通过影响 o2 (最有能量的电子受体) 的水文变化、有机基板的变化和初级可获得的电子受体来影响生态系统的热力学状态生产, 并在较小的范围内由温度。湿地系统中温度影响的一个重要例子是在同质乙酰发生 (二氧化碳和 h2产生的醋酸盐) 和氢养能力甲烷生成 (, co2 和 h2 的 ch4生产)。在低温下, 同种异体的表现似乎略受欢迎, 而温度较高则有利于ch4生产10。这种温度效应可能对生态系统对气候变化的反应产生重要影响, 因为 ch4 是一种比 co2-11 得多的温室气体, 因此增加了ch4的产量, 而牺牲了在温度较高的情况下, 二氧化碳可能会对气候变暖产生积极的反馈。

泥炭地通过天然有机质的微生物呼吸产生全球大量的 co2 和 ch46.有机碳基板的 nosc 决定了生产的 co:ch4的相对比例, 这是一个关键参数, 因为 ch4的辐射强迫高于co211,但也因为建模工作已确定该比率为估计泥炭地12中 c 通量的关键参数。在没有二氧化碳以外的终端电子受体的情况下, 电子天平可以看出 nosc > 0 的有机 c 基板会产生 co2:ch 4 >1, 有机 c 与 nosc= 0 产生 co2 和 ch 4 .在等摩尔比和有机 c 与 nosc < 1 将产生 co2:ch 4 < 1 13.oc 在自然生态系统中的分解是由微生物介导的, 因此, 即使特定化合物的降解在热力学上是可行的, 它也受到微生物酶活性的内在限制, 在缺氧条件下, 也受到热力学驱动力 (nosc)7。到目前为止, 充分表征有机物一直是一项挑战, 因为存在的化合物的多样性需要不同的互补技术来表征其特性。最近的进展弥补了这一差距;使用一套分析技术, 我们可以分析大量的有机化合物提供分子水平的表征, 并在某些情况下量化, 从小质代谢物, 如葡萄糖到800大多杂环。以前, 这样的大型复杂分子会被简单地描述为木质素样或单宁样, 并被认为是顽抗的。分子级表征, 然而, 允许计算 nosc, 即使这些大的复杂分子。这些 nosc 值与热力学驱动力呈线性关系, 可以评估可分解的有机物的质量, 这在许多情况下表明, 这些复杂的分子实际上可能是微生物的即使在湿地普遍存在的缺氧条件下也可以降解。

由于引入 o2可以分解几乎所有自然观测到的 nosc 值的有机物, 因此我们关注的是有机物和微生物蛋白质组学的变化, 这些变化很可能是湿地的主要驱动因素 (,有限的 o2) 系统。然而, 我们将要讨论的所有技术都可以应用于来自任何生态系统的有机物。通常, 基于光学和荧光分析的批量测量被用来评估有机物质量3,14。然而, 当使用这样的批量测量时, 由于大量的分子被归类为腐殖质或富维生物等泛型术语, 因此会丢失精细的细节。这些类别的定义没有受到很好的限制, 事实上, 由于研究的不同, 不可能进行比较, 这些定义可能会有所不同。此外, 体积测量没有提供计算控制系统的热力学所需的分子细节, 因此无法真正评估有机物质量15

其它技术, 如傅里叶变换离子回旋共振质谱 (fticr-ms)、核磁共振 (nmr) 光谱、气相色谱质谱 (gc-ms) 和液相色谱质谱 (lc-ms))提供这样的分子级细节。虽然这些技术中的每一种都有其自身的局限性, 但它们也带来了自己的优势, 可以用综合的方法来实现在严格的热力学意义上量化有机物质量所需的精细分子细节.gc-ms 可用于识别可能对 co2 和 ch4 生产有近端影响的关键小代谢物 ( 葡萄糖、醋酸盐等); 然而, 气相色谱-质谱联用要求对照标准进行验证, 因此仅限于数据库中已经已知的化合物, 无法识别新的化合物。此外, gc-ms 是一种半定性技术, 可以推断相对浓度的变化, 但没有提供计算 gibb 自由能量所需的实际浓度信息。最后, gc-ms 要求分子在分析之前进行衍生化, 这限制了小于 ~ 400 da 的化合物的分辨率, 而挥发性醇在干燥步骤中丢失。

一维 (1d) 1h 液态核磁共振允许对小代谢物 (包括初级小分子量代谢物和醇、醋酸、丙酮、甲酸酯、丙酮酸、琥珀酸等挥发物) 进行高度定量的表征,短链脂肪酸, 以及一系列的碳水化合物, 众所周知的缺失或妥协的 ms 为基础的方法) 和他们的浓度是特别有用的计算热力学参数。然而, 与 gc-ms 一样, 复杂混合物的一维核磁共振需要相对于数据库的标准化, 因此, 仅靠这些化合物并不容易识别, 而这些化合物在复杂的自然和不断变化的生态系统中可能很丰富。此外, 核磁共振比基于 ms 的技术灵敏度较低, 因此, 使用装有氦冷却冷探头的核磁共振系统, 定量代谢产物分析仅达到1μm 以上。一些核磁共振冷探头没有得到广泛的重视, 在较小直径 (< 3 毫米外径) 样品管16中使用时, 可以在存在四能盐浓度的情况下进行环境混合物分析.然而, 核磁共振的另一个复杂因素是, 大量的顺磁性金属和矿物 (例如, 铁和锰含量在 1-3% 以上), 在高地土壤中可以很丰富, 可以扩大光谱特征, 使核磁共振光谱的解释复杂化.使用固相萃取 (spe) 可以通过减少矿物盐和提高光谱质量来辅助解释核磁共振和基于 ms 的代谢组学方法。

直接注射的 fticr-ms 是一种高度敏感的技术, 能够从单个样本中检测到数万种代谢物, 但它不捕获关键的小代谢物, 如醋酸盐、丙酮酸和琥珀酸, 而且众所周知, 很难用于糖和其他碳水化合物17, 也不能提供定量信息。然而, 与其他技术不同的是, fticr-ms 擅长识别新化合物并将其分配为分子式, 因此可识别提供比任何其他描述技术更多分子信息的化合物数量最多的化合物。这是有用的, 因为 fticr-ms (和其他技术) 提供的分子信息可用于计算 nosc, 这与控制某些反应的可能性的热力学驱动力和它们在某些情况下的速率有关。条件7。此外, 通过将 fticr-ms 与 lc 和串联 ms 等分离技术耦合, 可以获得定量的结构信息, 弥补了该技术的一些缺点。lc-ms 可用于识别脂质类化合物和其他代谢物, 这些化合物和代谢物没有得到任何其他方法的充分表征。将 lc fticr-ms 或 lc-ms 与分数收集器耦合, 并收集特定未知的分数, 通过二维 (2d) 液态核磁共振进行结构阐明, 是识别和量化未知化合物的理想情况18 ,19。然而, 这是一个非常耗时的步骤, 可以在需要时使用。单独来看, 这些技术中的每一种都提供了不同的有机物快照, 通过集成它们, 我们可以实现比单独使用任何技术更完整的理解。

虽然热力学的考虑对一个系统中可能发生的转变设置了最终的约束, 但有机物分解是由酶活性控制反应速率的微生物介导的。因此, 要充分了解湿地对有机物分解和最终温室气体 (co2 和 ch 4) 生产的控制, 需要采用综合的组学方法来描述微生物酶的活性, 以及代谢物。在本文中, 我们介绍了一种方法, 用于从单个样本中使用顺序方法实现这种全面分析, 从而实现完全配对的分析。这种方法扩展了代谢物、蛋白质和脂质提取 (mplex) 协议, 其中蛋白质组学与 gc-ms 和 lc-ms20结合, 通过纳入代谢物定量信息来识别小的代谢物、蛋白质和脂类通过nmr 和通过fticr-ms 对较大的次生代谢物进行鉴定. 与 mplex 稍有不同, 我们从水提取开始, 然后对越来越多的非极性溶剂进行顺序萃取。所有提取都是在单个样品上进行的, 在体积有限或难以获得的情况下, 可以保存样品, 并减少通过不同样品基质 (土壤和泥炭) 中的等价物之间的变化而引入的实验误差, 或储存条件和持续时间的差异。

最后, 通过将 om 分析与微生物群落的蛋白质组学分析相结合, 我们可以建立描述有机物分解途径和转化的代谢网络。这使我们能够通过改变可用的有机基板、电子受体和微生物群落来测试关于系统扰动如何影响最终 co2 和 ch4 生产的具体假设通过酶催化剂的活性来调节反应。

该方法的总体目标是提供一个单一的吞吐量协议, 用于分析单个样本中的代谢物、脂质和微生物蛋白, 从而为构建代谢网络创建一个完全配对的数据集, 同时约束分析错误.

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Protocol

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1. 从土壤、沉积物或泥炭中顺序提取有机物

  1. 通过取心收集土壤、沉积物或泥炭, 并根据所测试的假设 (例如深度) 划分岩心。将样品存放在聚四氟乙烯涂层容器中, 并在分析前冻结在-80°c 进行储存。
    注: 此协议需要大约25毫克 c。对于泥炭 (通常为 45% c), 需要50毫克的干泥炭。根据 c 含量 (高达5克) 的不同, 矿物或森林高地土壤等低有机样品可能需要更多的样品。由于用有机溶剂萃取任何聚乙二醇 (peg) 会将其拉入提取物中, 这将在步骤2.4 期间对电离产生负面影响, 因此在收集、储存或采集过程中, 必须避免让样品在任何时候接触塑料。提取。
  2. 当准备分析样品时, 将其冷冻干燥到恒定重量, 然后在高速球磨机中使用不锈钢磨球研磨样品, 使其均匀化并分解任何集料。
    注: 此时可以暂停协议, 并且材料存储在-80°c。
  3. 使用乙醇清洗不锈钢器具, 每个干燥样品的脂肪50毫克, 进入单独的2毫升玻璃瓶。这些样品将使用一系列溶剂按顺序提取, 以便从每个样品中连续提取越来越多的非极性代谢物。在每个样品中加入1毫升的蒸馏水 (h2o), 盖上小瓶, 在振动台上摇摇2小时。
  4. 晃动后, 溶液可以在室温 (rt) 下站立 20分钟, 然后在 15, 000 x 克离心 30分钟, 并从每个上清液中保存。
    注: 这些溶液将通过直接注射注入到 fticr-ms 中。
  5. 对现在提取的水残留物进行21的 folch 提取(也称为 mprex20), 方法是重复步骤1.3 和 1.4, 取代-20°c 4:3 氯仿的1毫升: 步骤1.3 中的水的甲醇混合物。
    注意: 氯仿和甲醇都是高度易燃和有毒的。使用适当的个人防护设备 (ppe), 以避免皮肤接触, 避免明火。
  6. 通过使用分离漏斗或通过小心移液去除顶层, fticr-ms 对由此产生的两个溶剂层进行单独分析, 从而在视觉上加以区分。
    注: 含氯仿的部分将在底部, 而含甲醇的部分密度较小, 并将在顶部。
  7. 在甲醇中稀释氯仿萃取物 (步骤 1.6) 1: 1, 在甲醇中稀释水提物 (步骤 1.4) 2:1, 通过直接注射提高 fticr-ms 的电喷雾电离 (esi) 效率。
    注: 步骤1.7 中含有甲醇的部分不需要在甲醇中进一步稀释。甲醇层将通过直接注射在 ficr-ms 上运行。

2. fticr-ms 分析

  1. 通过直接向 fticr-ms 注入100μl 调谐溶液 (见材料表), 对 fticr 光谱仪进行校准, 该溶液的质量范围约为 100-1, 300, 100。
  2. 准备苏万尼河富尔维酸标准 (见材料表), 在超纯过滤水中制备1毫克ml-1溶液, 然后在甲醇中将生成的溶液稀释到 20μg ml-1.
  3. 通过将流量设置为3.μl 最小-1 的注射器泵直接将这一最终解决方案的23μl 注入到与 fticr 光谱仪耦合的 esi 源。将针压设置为 + 4.4 kv、q1 至 150 m\ z,在180°c 时设置为玻璃毛细管。使用分析软件 (见材料表) 检查生成的光谱, 以确认数据的质量。
  4. 在运行样品之前和整个取样过程中使用高效液相色谱级甲醇来监测结转情况。通过将每个提取物直接注射到通过注射器泵与 ftic 光谱仪耦合到的 esi 源, 引入 23μl, 流量为3.μl 最小-1。将针压设置为 + 4.4 kv、q1 至 150 m\ z,在180°c 时设置为玻璃毛细管。
  5. 调整每个样品或样品组的离子积累时间 (iat), 以考虑 c 浓度的变化。典型值在0.1 至0.3秒之间, 为每个样本收集144次扫描, 平均扫描, 然后使用同源 ch2 (即 14 da 分离) 系列进行内部校准。
    注: 在 fticr-ms 分析之后, 可以决定将水和甲醇提取的分数结合起来, 以简化剩余的步骤, 或者在随后的步骤中将分数分开。讨论中详细介绍了每种方法的优缺点。如果这样做, 将水和甲醇提取的馏分结合起来。
  6. 使用浓缩器进行干萃取物, 并将剩余的萃取物 (~ 1 毫升) 保存在随后的 gc-ms (水、甲醇或水 + 甲醇)、lc-ms (氯仿) 和核磁共振 (水 + 甲醇) 分析中。
    注: 此时可以暂停协议, 并且材料存储在-20°c。

3. ficr-ms 数据处理

  1. 在公式分配之前, 使用公式软件22对整个数据集的所有采样峰值列表进行对齐,以减少质量移动并标准化峰值分配。
  2. 使用公式软件22指定分子式使用大于7的信噪比, 质量测量误差 < 1 ppm, 并允许 c、h、o、n、s 和 p, 同时不包括所有其他元素。
  3. 如果为给定的质量 (频繁超过 500 da) 返回多个候选公式, 则施加与所采样材料一致的约束。例如, 在泥炭中, 典型的约束包括: 最小质量误差、最低的异质原子数 (n、s、p), 当存在时, p 必须为氧化形式 (, 公式中每个 p 原子必须至少有 4个 o 原子)。

4. 气相色谱-质谱联用化学衍生化

  1. 在 gc-ms 自动采样瓶23中制备 hplc 级已烷的空白控制样品.溶解100毫克脂肪酸甲酯 (fam:c8-c28) 混合物保留时间标准200μl 的已烷。
  2. 为保护碳基, 在吡啶中加入 20μl 30 毫克 ml-1 甲氧胺盐酸盐, 加入每一种甲醇提取物和水提取物 (如果使用, 则为甲基水提取物组合), 步骤2.6、空白和 fame 校准样品 23. 用帽子封住小瓶。
    注意: 吡啶具有剧毒和易燃性。穿适当的个人防护装备, 防止皮肤或眼睛接触, 避免明火。此外, 吡啶在 rt 处挥发, 造成有害的空气污染。只能在通风良好的地方通风的通风空间里工作。
  3. 涡旋提取物的20秒。然后, 在37°c 的离心机中孵育提取物, 在 100 x g 时孵育90分钟。
    注: 过量的碳水化合物或盐会导致代谢物在干燥后结晶。使样品变得更加结晶将有助于将结晶代谢物重组为衍生试剂。
  4. 孵育后, 在每个样品中加入 80μl n-甲基-n-(三甲基硅酰) 三氟乙酰胺, 并添加1% 的三甲基氯硅烷, 在 100倍 g 下, 在37°c 的离心机中再加入20倍的 son醇萃取物, 共 70度;
  5. 冷提取物 rt (20-24°c), 然后转移到 gc-ms 自动采样瓶中。

5. 气相色谱-质谱分析

  1. 在分析之前, 根据供应商的建议 (见材料表) 调整和校准 ms, 以确保机器正确读取 ms 数据。检查氦气体压力是否在指定的公差范围内。
  2. 在气相色谱柱上分离极性代谢物 (30 米 x0.25 mmx 0.25 微米)。将烤箱温度协议设置如下: (1) 初始温度 60°c 1分钟; (2) 坡道至 325°c, 速率为10°c 分钟-1, (3) 在325°c 保持 5分钟.
  3. 使用 gc 耦合到单个四极质谱分析萃取物. 将注入端口温度设置为恒定的250°c。在无拆分模式下注入每个衍生提取物的1μl。

6. gc-ms 数据处理

  1. 检查所有数据文件, 以确保它们被正确捕获。注意内部标准保留时间和强度方面的潜在变化, 以确认在整个分析过程中一致地捕获了数据。
  2. 如果需要, 将供应商特定的 ms 数据格式转换为常规 ms 格式。使用代谢探测器24处理原始数据文件, 根据 fame 内部标准校准保留指数。在对所有数据文件的保留时间进行对齐后, 通过将保留指数和 gc-ms 光谱与 fiehnlib 极性代谢物库25 匹配, 继续进行反卷积和最终代谢物识别。
  3. 使用光谱匹配对 nist14 gc-ms 库交叉检查剩余的未识别代谢物。单独验证标识, 以消除错误标识并减少反卷积错误。

7. 液体状态核磁共振分析

  1. 用 5 mm 2、2-二甲基-2-硅那苯-5-磺酸-d6 内部标准稀释水提取物的剩余部分 (~ 300μl) 10% (vol/vol)。或者, 将步骤1中的水和甲醇提取物结合起来, 然后在水中重新替代。然而, 通过这样做, 一些挥发性化合物可能会在冷冻干燥步骤中丢失。典型的最终样品体积在180-300μl 之间。
  2. 将混合物转移到高质量的3毫米外径 (外径) 硼硅酸盐玻璃核磁共振管中。
  3. 使用带有5毫米三谐振耐盐冷探头和冷碳前放大器的核磁共振光谱仪 (最好是至少 600 mhz) 收集光谱。
  4. 使用一维核全热效应光谱 (noesy) 预置实验收集1d1h 光谱, 实验时间为 298 k, 采集时间为 4秒, 回收延迟为 1.5 s, 复杂点为 65, 536个, 扫描5512。
  5. 收集二维 1 h-13 c 异核单量子相关 (hsqc) 和1h-1 h总相关 (tocsy) 谱, 以帮助分配代谢物和验证.
  6. 使用核磁共振分析软件 (参见材料表) 处理、分配和分析所有光谱, 以量化相对于内部标准的强度。通过将样品中的化学转移、j 耦合和强度信息与库匹配来识别代谢物。
    注: 定期制定有针对性的代谢物标准和添加代谢物, 进一步加强了图书馆。此时可以暂停协议, 并将材料存储在-20°c。

8. lc-ms 脂质体分析

  1. 用200μl 甲醇将步骤2.5 期间产生的干氯仿提取物重新湿。
  2. 将每个提取物的10μl 注入使用反向相充电表面混合柱 (3.0 mmx150 mmx1.77μm 粒径) 耦合到 orbitrap 质谱仪的超高效液相色谱仪中。将包含 10 mm 醋酸铵的34分梯度 (流动相 a: 乙腈 2o (40:60); 流动相 b: 乙腈/异丙醇 (10:90), 含 10 mm 醋酸铵) 的流速设置为 250μl/min。具有更高能量碰撞离解和碰撞诱导离解的电离模式。
    注意: 乙腈是一种眼睛、皮肤和呼吸道刺激物。佩戴适当的个人防护装备。此外, 乙腈是可燃的。不允许接触氧化剂, 燃烧过程中可能会产生有毒烟雾。
  3. 将原始的 lc-mcmsms 数据文件与目标文件 (即 > 25, 000个脂类的列表) 一起上传到相关电离模式 (或负)。处理原始文件。通过检查 msms 光谱是否存在诊断离子 (如适用)、匹配片段离子 (如脂肪基链)、同位素分离、前体质量 ppm 误差和保留时间, 手动验证所产生的鉴定结果。导出结果的清单自信地识别为. tsv 文件。
    注: 此时可以暂停协议, 并将材料存储在-20°c。

9. 蛋白质组学分析

  1. 根据 mplex 协议20从步骤2.4 产生的甲醇相的剩余部分中提取蛋白质, 通过清洗提取物的20倍额外的冷 (-20°c) 甲醇的提取量。
  2. 使用 1 mL/50 毫克硅基吸附剂 (见材料表) 在水中用3毫升甲醇、2毫升0.1% 的三氟乙酸 (tfa) 对 c18 spe 柱进行调理, 然后以不超过 1 ml/min 的速度从步骤9.1 中添加提取物。
  3. 加入样品后, 用4毫升的95毫升清洗柱: 4.4:0.1 水: 乙腈: tfa, 然后允许干燥。将 1.5 ml 收集管放置在 spe 柱下, 并将样品与1毫升的80:19.9:0.1 甲醇: 水: tfa。
  4. 在真空辅助冷冻干燥机下将提取物浓缩到 100μl, 然后用双氯酸 (bca) 比色法26测量波长为 562 nm 的蛋白质浓度。
  5. 在4°c 条件下, 以 10, 000 x g 的速度离心10分钟。去除产生的上清液, 在真空下干燥剩余的颗粒 5分钟, 将水中的蛋白质颗粒重新回到每微米0.1 微克肽的最终浓度。
  6. 将二硫代三醇添加到 5 mm 的最终浓度中, 在60°c 孵育 30分钟. 用 100 mm nh4 hco 3/hco 3//8M尿素溶液稀释 10倍, 在1:50 酶蛋白质存在的情况下, 在37°c 孵育 3小时, 并在1:50 酶的情况下培养猪胰蛋白酶比。
    注: 此时协议可能会暂停, 并将材料存储在-20°c。
  7. 在 10 kpsi 和 500 nl mine-1 时,使用水流动相 (a) 中0.1% 甲酸和乙腈流动相 (b) 中0.1% 甲酸的指数梯度, 通过液相色谱分离提取物.
  8. 在线性离子陷阱 (ltq) 轨道诱捕质谱仪中, 将产生的洗脱液引入到从400-2000 m/z收集 400 - 2000 m/z 的 esi 耦合质谱仪中, 在 100, 000 分辨率下, 以 100, 000 分辨率。
  9. 使用 mzML 频或蛋白质向导将 raw 光谱文件转换为 mzml 格式, 接受所有默认参数。使用通用数据库搜索工具 msgfplus 搜索产生的蛋白质组, 以搜索从相关化子组组装基因组预测的蛋白质序列的目标蛋白质数据库。
  10. 附加常见的污染物 (例如, 胰蛋白酶, 角蛋白, 白蛋白), 并删除所有完全重复的蛋白质序列, 以改善肽到质量谱匹配统计。评估生成的 msgf 光谱概率分数, 以确定哪种肽与质量谱匹配是最好的。使用 msgfplus 中的 q 值将整个数据堆筛选为1% 的假发现率 (fdr)。

10. 代谢组学分析与代谢网络建设

  1. 将步骤3、6、7和8中确定的所有代谢物分子式编译为样本中存在的代谢物的单个数据库。将这些代谢物与第9步中确定的酶委员会 (ec) 或 kegg 正畸 (ko) 数量的酶结合起来。根据 kegg27数据库、代谢途径部分搜索此组合数据集。
  2. 手动评估结果, 以确定最可能的途径, 并集成到代谢模型中。

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Representative Results

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我们执行了所述的互补分析协议, 并在美国明尼苏达州的云杉和泥炭地响应 (spring) 现场的 s1 沼泽中进行了泥炭与深度的比较。这些结果与瑞典北部的永久冻土沼泽沼泽和芬的结果进行了比较, 以显示位点在代谢物和酶活性方面的差异。我们在蛋白质组学分析中发现了3312酶。对酶活性的深度分析表明, 在 spring 沼泽中, 酶的数量在15厘米至45厘米之间急剧下降 (图 1)。

虽然蛋白质组学的结果表明哪些蛋白质被表达, 但代谢数据显示哪些反应实际上正在发生。总体而言, 我们从 fticr-ms、nmr、gc-ms 和 lc-ms 分析的组合中, 确定了所有泥炭样品中的 67 040 代谢物 (包括脂质)。其中, 我们能够为 15, 385 种化合物分配分子式 (图 2)。综合代谢数据跨越一系列氧化状态、质量和复合类。

这通常是可视化的通过使用 van kreveen 图, 其中已确定的公式的原子 hc比比绘制为对照其原子 oc比度 28。我们在典型的2d 格式中增加了一个维度, 通过对表示单个公式的符号进行颜色编码来描述 nosc (图 3图 4)。随着 spring 沼泽深度的增加, fticr-ms 确定的大型次生代谢物总数增加, 特别是在高度浓缩 (van kre洗钱地块左下角) 和氢化配方 (图 1) 中 (图 4)).在同一深度, 气相色谱-质谱联用和脂质体所识别的高能小型化合物数量有所减少 (图 5)。这可能表明, 脂质和小代谢物在到达更深的深度之前就会在表面泥炭中消耗, 或者深泥炭的分解率比表面的分解速度更快, 从而迅速消耗向下的平底化合物。区分这两个相互竞争的假设需要对站点上的 c 循环进行过程级的理解。只有将代谢组学和蛋白质组学数据集结合起来, 才能获得这样的过程级理解。我们通过对照 kegg 数据库对组合的 fticr-ms、gc-ms、lc-ms 和 nmr 鉴定代谢物进行交叉验证来实现这一目标。在这样做的过程中, 我们发现我们确定的化合物参与了常见的代谢途径, 如三羧酸 (tca) 周期、糖酵解和糖代谢。由于单个代谢物可以参与多种途径的确认与酶增加我们的信心, 在分配路径 (图 6)。

通过这次测绘, 我们发现了蔗糖和淀粉代谢的证据, 在表面泥炭, 而在更深的丙酮酸和其他发酵产品建立起来 (图 6)。这些结果与第一种假设一致, 即糖和其他高能代谢物在泥炭表面退化, 并且没有到达更深的泥炭深度。如图 5所示, 在表面泥炭中消耗糖 (nosc = 0) 和氨基酸 (0 < nsc < 1), 而脂质 (-2 < nosc <-1) 似乎随着深度积累而积累。这与基于 nosc 值的预期是, 较高的 nosc 化合物更容易降解, 而较低的 nosc 化合物则在地下泥炭的高厌氧 (技术限制) 条件下持续存在。这种方法还成功地区分了不同环境中的土壤类型。例如, 北方泥炭地的土壤有机质似乎与永久冻土泥炭地以及永久冻土地区内的沼泽中的土壤有机质不同。这些结果与先前的一项研究一致, 该研究表明, 这些生境29在场地地球化学方面存在差异, 这表明场地地球化学对地下 c 的微生物降解有很大影响。

Figure 1
图 1: 蛋白质组学分析表明, 酶数量具有较强的深度分层.条形图表示平均值, 误差条表示丰度的一个标准偏差。这表明微生物在泥炭表面最为活跃。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 每种技术在每个生境的表面泥炭 (< 30 厘米) 以及从 spring 沼泽中发现的中泥炭 (45 厘米) 和深泥炭 (87 厘米) 中确定的化合物数量.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: van kreaveen 图 (每个被确定的分子式的原子 hc比re)用于表面 (15 厘米) spring 沼泽深度, 以显示每种技术所特有的化合物的覆盖范围.fticr-ms 使我们能够识别最大数量的化合物 (小圆圈), 而 gc-ms (三角形) 有利于区分和识别糖 (h c = 2 和 o c = 1)。核磁共振 (方谱) 提供了关于高能重要化合物的定量信息, 如糖、氨基酸、丙酮酸。lc-ms (钻石) 提供有关脂质的信息。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: van kreaveen 图 (每个被确定的分子式的原子 hsic o), 用于深 (87 厘米) spring 沼泽深度, 以显示每种技术所特有的化合物的覆盖范围.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 确定的不同化学类别的相对比例 通过不同深度的各种技术.条形图为每个深度的平均值±一个标准偏差。绘制的类包括氨基酸, 磷脂 (cer)、甘油磷胆碱 (pc)、磷酸乙酯 (pe)、二乙酰氯三烯类化合物 (dgtsa)、二酰基甘油 (dg)、三酰基甘油 (tg) 和糖。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6* 将结果结合起来, 建立一个代谢网络.由核磁共振 (a) 和 gc-ms (b) 鉴定的代谢物的深度分布, 以及显示在 spring 沼泽中确定的选定数量的转化的简化代谢图 (c)。绿色盒子表示随着深度的增加而减少的代谢物, 棕色盒子表示随着深度的增加而增加的代谢物。绿色连接箭头表示在我们的数据集中识别的酶, 这些酶介导了指示的变换 (在箭头旁边指示的酶 ec 数字)。灰色连接箭头表示我们的数据集中没有识别酶的转化。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

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用于表征代谢物和蛋白质组的单吞吐量、全耦合分析流提供了对 c 循环在复杂生态系统中发生的途径的洞察。土壤和泥炭是异质矩阵, 因此, 这种方法的关键步骤之一发生在最早的步骤, 以确保启动泥炭或土壤材料是高度均匀的。最好是研磨样品和聚集体可以降低提取效率。对于 c 含量低、矿物含量高的聚集土壤和土壤来说, 这是一个特别的问题, 可能需要使用不锈钢球磨床进行充分的均质化。由于实验地点内土壤和泥炭的空间异质性可能很高, 因此强烈建议进行生物复制。

这种方法利用三种溶剂: 水、甲醇和氯仿, 它们会影响可能提取的化合物的类型。原则上, 这种顺序萃取方法应将覆盖广泛极性范围的化合物溶解。然而, 这些溶剂并没有优化用于提取有机矿物配合物或高度稳定的配合物。如果这些化合物是感兴趣的, 更苛刻的溶剂, 如强酸和碱是首选, 但更苛刻的提取过程可能会改变样品的化学。在提取序列结束时加入此类溶剂可能会最大限度地减少这种影响。此外, 氯仿还会通过溶解细胞膜脂质来激活临床上重要的土壤和泥炭细菌和病毒病原体, 以及其他致病生物制剂。因此, 将氯仿纳入提取协议将减少对来自世界不同地区的病原体可能感染的样本进行生物学研究所涉及的风险。如果对提取后的微生物细胞、碎片或颗粒物存在顾虑, 建议通过0.2μm 玻璃纤维过滤器对提取物进行过滤。

为了简化过程, 水和甲醇提取物可以结合在一起, 在步骤4.1 中进行 gc-ms 分析。然而, 由于 esi 源的电离效率问题, 这些提取物必须保持分离, 以便进行 fticr-ms 分析。在 gc-ms 上运行组合提取物的好处是, 将发现更多的代谢物 (涵盖更大范围的极性)。在这一点上, 结合提取物的缺点是, 在有机物的微生物处理中, 主要的代谢物之一是甲醇。甲醇的痕迹将始终留在组合样品中, 即使在干燥之后, 因此, 如果甲醇是感兴趣的代谢物, 水提取物必须单独运行。在没有分析物的情况下进行良好的控制也将有助于识别样品中的潜在污染。

在为核磁共振分析准备提取物的步骤7.1 中, 如 gc-ms 分析中, 可以单独使用水提取物, 也可以使用水和甲醇联合提取物。这样做的缺点与上一段列举的缺点相似。将甲醇和水提取物结合在一起的优点是, 将发现一些溶解在甲醇组分中的极性较低的代谢物。然而, 由于冷冻干燥步骤, 会丢失更多的挥发性化合物。如果挥发性脂肪酸的量化是实验的关键组成部分, 这是一个特别的缺点。

在这个鉴定蛋白质组学的过程中, 只搜索完全的胰蛋白酶肽, 从而漏掉内源肽酶活性和源性片段。另一方面, 氧化蛋氨酸可被视为肽候选的翻译后修饰, 因为这种修饰通常发生在取样处理和处理过程中。使用多肽洗脱区域对酶进行定量是可以做到的, 但这是在本项目的范围之外。

近年来在分析 nom 和微生物参数方面取得的许多进展为了解有机 c 循环提供了丰富的技术。通过将这些技术合并到一个简化的协议中, 我们对正在发生的过程有了新的认识。将蛋白质组学分析与代谢分析相结合, 提供了令人信服的佐证, 证明一种反应实际上正在发生。仅代谢分析是有限的, 因为它告诉我们哪些代谢物在不同地点之间的比较或治疗效果后的浓度较高或较低, 但无法识别这些变化的原因。例如, 我们在沼泽中确定了含糖深度下降的情况, 但在没有进一步信息的情况下, 尚不清楚深度下降是由于深度下降是由于深度泥炭的缓慢还是快速降解。蛋白质组和深度酶表达的下降分析使我们能够拒绝第二个假设。相反, 我们的结果与表面泥炭的快速糖降解是一致的, 它将输入限制在更深的深度。这些特殊的见解只有在所有技术都被同时考虑的情况下才有可能, 因为每一种技术都提供了一个独特的, 但关键的部分的 c 循环难题.

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们要感谢 j. p. chanton、j. e. kostka 和 m. m. kulton 协助收集泥炭样品。这项工作的一部分是在生物和环境研究办公室赞助的 doe 科学办公室用户设施----环境分子科学实验室进行的。pnnl 由 battelle 根据 de-ac05-76r01830 合同为指定经营实体运营。这项工作得到了美国能源部、科学办公室和生物与环境研究办公室的支持 (赠款: de-ac05-00or22725、de-sc0004632、desc0010580、de-sc0012088 和 de-sc0014416)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methoxyamine hydrochloride Sigma Aldrich 226904 derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe  Bruker instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) Agilent AG19091S-433 instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) ThermoFisher instrumentation
2 mL glass vials VWR International 46610-722 sample vials
autosampler vials VWR International 97055-324; 9467671 sample vials
Chloroform VWR International JT9174-3 solvent
Ethanol VWR International BDH67002.400 solvent
methanol VWR International BDH85681.400 solvent
pyridine VWR International BDH67007.400 solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 Sigma Aldrich 178837 standard
C8-C24 fatty acid methyl ester Sigma Aldrich CRM18918 standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide Sigma Aldrich 24589-78-4 standard
Suwanee River Fulvic Acid standard International Humic Substances Society 2S101F standard
trimethylchlorosilane Sigma Aldrich 89595 standard
Tuning Solution Agilent
FTICR-MS analysis software Bruker Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software Pacific Northwest National Laboratory Formularity available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS Agilent Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent Phenomenex (Torrance, CA) Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 VWR International KT897820-0008 NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer  Varian Inova Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3 Chenomx Chenomx NMR Suite NMR software
ultra-performance liquid chromatograph  waters Aquity UPLC H  liquid chromatograph 
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer  ThermoFisher Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer 

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References

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用于表征复杂天然有机物混合物的单吞吐量互补高分辨率分析技术
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