Summary
本文的主要目的是提供如何使用微电极浸渍法记录中脑动脉膜电位(Vm)的详细信息。可加法的中脑动脉得到平衡,以获得造血性音,使用高电阻微电极刺穿血管壁。
Abstract
血管平滑肌细胞的膜电位 (Vm) 决定血管张力,从而决定血液流向器官。在疾病条件下调节Vm的电通道和电源泵的表达和功能的变化可能会改变V m、血管张力和血流。因此,对电生理学的基本理解和准确记录Vm在健康和疾病状态的必要方法是必不可少的。这种方法将允许使用不同的药理剂调制Vm以恢复V m。虽然有几种方法,各有其优缺点,本文提供了使用微电极浸渍法记录从罐化阻力血管(如中脑动脉)的Vm的协议。中脑动脉在造血室中获得造血性,血管壁使用高电阻微电极。Vm信号通过静电计进行收集、数字化和分析。该方法提供血管壁Vm的精确读数,不损坏细胞,也无需改变膜电阻。
Introduction
细胞的膜电位(Vm)是指等离子膜中离子电荷的相对差异以及膜对这些离子的相对渗透性。Vm由离子差分分布生成,并由离子通道和泵维护。Ion通道,如K+,Na+和Cl+对休息的Vm贡献很大。血管平滑肌细胞 (VSMC) 表示四种以上不同类型的 K+通道1,两种类型的电压门控 Ca2+通道 (VGCC)2,两种以上的 Cl+通道3,4,5、储存操作的 Ca2+通道 6、拉伸激活的阳离子通道7、8 和电原钠-钾 ATPase 泵9在其等离子膜中,所有这些都可能是参与Vm的管制。
VSMC 的 Vm取决于流明压力。在非加压容器中,Vm从 -50 到 -65 mV 不等,但在加压动脉段,Vm范围为 -37 到 -47 mV10。血管内压力升高导致VSMC去极化11,降低VGCC开口的阈值,并增加钙的流入,促进肌原性音调12的发展。相反,在被动或非加压容器中,由于高K+通道活性,膜超极化会阻止VGCC打开,导致钙进入受限和细胞内钙的减少,导致血管音13.因此,Vm由于流明压力的变化似乎在血管张力发展中起着至关重要的作用,而VGCC和K+通道在Vm的调节中起着至关重要的作用。
Vm因容器类型和物种而异。Vm是 -54 × 1.3 mV 在豚鼠优越的脑动脉条14,-45 × 1 mV 在大鼠中脑动脉在 60 mmHg 流明压力12,和 -35 × 1 mV 在大鼠腹腔动脉在 40 mmHg 流明压力15.未拉伸大鼠淋巴肌肉记录的休息 Vm是 -48 × 2 mV16。脑VSMC的Vm比外周动脉更负。相比之下,据报道,猫科脑动脉的Vm约为-70 mV,而据报道,脑动脉和冠状动脉分别有-49和-58 mV,分别为17、18。血管病床Vm的差异可能反映了电通道和电基钠钾泵的表达和功能的差异。
Vm中的增减分别称为膜去极化和超极化。Vm中的这些变化在许多生理过程中起着核心作用,包括电道门控、细胞信号、肌肉收缩和运动电位传播。在固定压力下,许多激活K+通道的内源和合成血管扩张剂化合物导致膜超极化,导致血管化1,13。相反,持续膜脱极极基在激动剂诱导或受体介导的血管收缩19中至关重要。Vm是一个关键变量,它不仅通过 VGCC13调节 Ca2+流入,还影响内部存储20、21和 Ca2+的 Ca2+的释放,合同装置22。
虽然有几种方法可以记录不同细胞类型的V m,但从罐体容器的微电极浸渍法收集的数据似乎比从分离的VSMC获得的数据更具生理性。当使用电流钳位方法从隔离的VSMC中记录时,Vm在VSMC24中被视为自发瞬态超极化。隔离的VSMC不在同步体中,串联电阻的变化可能导致Vm的振荡行为。另一方面,当从完整血管记录Vm时,振荡行为是不能观察到的,这可能是由于VSMC之间的细胞接触,这些细胞在动脉中是同步的,并且在整个血管中求和,导致稳定的Vm 24.因此,使用标准微电极浸渍技术从加压容器测量V m,与生理条件相对接近。
从可分离的血管记录Vm可以提供重要信息,因为同步的VSMC的Vm是血管音调和血流的主要决定因素之一,而Vm的调制可以提供一种拉升或收缩血管。因此,了解记录 Vm所涉及的方法至关重要。本文使用微电极浸渍法描述了从可熔化中脑动脉(MCA)的Vm细胞内记录。该协议将描述如何准备MCA,微电极,设置电表,并执行记录Vm的浸渍方法。此外,还讨论了代表性数据、使用此方法时遇到的常见问题和潜在问题。
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Protocol
雄性大鼠被安置在UMMC的动物护理设施中,该设施得到实验室动物护理评估和认证协会(AAALAC)的批准。在整个研究中,动物可以免费获得食物和水。动物在受控环境中保持温度为24~2°C,湿度水平为60~80%,光/暗循环为12小时。所有协议均获得UMMC动物护理和使用委员会的批准。
1. 设备准备
- 将双通道差分仪电表放大器(参见材料表)靠近容器室和所需位置。
- 使用 BNC-BNC 电缆将放大器通道 A 或 B 的输出连接到数字化器的通道输入。
- 将探头安装在微操作器中,并将其放在显微镜和近影机附近。记录设置必须安装在无振动表上。
- 如手册中所述,将旋钮和开关放在放大器前部的位置,以配置该按钮以进行此实验。
- 使用适当的电极将浴场连接到放大器的电路接地。同样,确保保持架接地到放大器的机箱上。
2. 微电极和装配的制备
-
使用硼硅酸盐玻璃微电极(参见材料表),并拉取玻璃尖,使其具有 8~10 mm 的色粒,直径为 <1 μm,当填充 3 M KCl 时电阻为 80–120 MΩ。
- 使用标准拉拔器使用以下设置实现短的渐进分差:热 = 650;速度 = 20;拉力 = 25;时间 = 250,循环两次,产生更高的电阻和更小的尖端。有关设置是特定于仪器的,请参阅材料表。
注:尖端直径 <1 μm 在刺穿时对细胞造成的伤害最小。
- 使用标准拉拔器使用以下设置实现短的渐进分差:热 = 650;速度 = 20;拉力 = 25;时间 = 250,循环两次,产生更高的电阻和更小的尖端。有关设置是特定于仪器的,请参阅材料表。
-
使用超细纤维注射器向微电极填充 3 M KCl(参见材料表)。
- 在将 3 M KCl 注入微电极时,缓慢地将微纤维注射器的柱塞向上拉,以便留出空间让液体充满,并防止微电极内部形成气泡。
- 在将微电极放入微电极支架之前,将微电极填充至满,并确保没有气泡。如果存在气泡,用手指轻轻敲击微电极以去除气泡。
- 练习小心,通过钻孔将电极柄牢牢地推入支架。如果存在过量的液体,则用组织将其取出。
- 将电极支架组件连接到放大器探头。执行电极测试,调整输入偏移,验证零设置,并检查探头输入泄漏,根据放大器手册。
- 使用电极测试测量电极电阻,如表1所示。
- 请注意,工作电极在通道输出处显示 1 mV/MΩ 的正直流电压偏移。另一方面,如果通道输出和仪表上出现大电压,则表示电极堵塞或损坏。
- 打开录制软件,为文件指定名称,并将其保存以用于存储软件中的未来分析。
3. 中脑动脉的隔离和凝固
-
准备试剂。
- 如表2所述,制备正常和低钙生理盐溶液(PSS)。
-
准备表图。
- 用蒸馏水多次冲洗表室(见材料表),使其无碎屑。使用 5 mL 的正常 PSS 加载造型室。
- 使用 5~10 mL 注射器将两个玻璃管用过滤过的正常 PSS 填充。小心地填充整个管和连接的管,而不会引入任何气泡。
- 准备两个单丝尼龙缝合线(10-0,0.02毫米),每个用钝钳各半结。
- 使用解剖钳在解剖显微镜下将部分闭合的缝合结放在两个从尖端稍微移开的缝合管上。稍后,这些结将被滑下,并小心地绑在可成主动脉末端,以确保船舶的安全。
-
隔离和分离中脑动脉。
- 使用2⁄4%吸入的硫兰,在斯普拉格道利大鼠中诱导深层麻醉。
- 在深层麻醉下用断头台将老鼠斩首。
- 使用骨刀和剪刀小心地取出头骨。
- 从头骨中取出大脑,并将其置于 5 mL 的低钙 PSS 的冰上。
- 使用弹簧剪刀和钳子,识别和解剖大鼠中脑动脉(MCA)的未分枝部分,内径为100~200μm。
- 使用细钳将 MCA 安装到玻璃管上,并通过拧紧包含正常 PSS 的肌图中的缝合线来固定。
- 关闭远端管,以便在 MCA 内没有流量。
- 将流入移液器连接到装有 PSS 的储液罐,以便控制将用在线压力传感器监控的电内压力。
- 使用安装在倒置显微镜和成像软件上的电荷耦合设备摄像机(参见材料表)可视化可熔化 MCA。
- 将 MCA 的轴向长度设置为近似长度,使其既不应出现刚性,也不显得松弛。
- 用 O2 (95%) 平衡沐浴溶液和 CO2 (5%)在37°C下提供足够的氧合、温度,并将pH值保持在7.4。
-
血管平滑肌细胞的血管细胞(穿透细胞血浆膜)。
- 连接接地电极,使其浸入肌图的 PSS 中。
- 照亮容器室,并通过显微镜观察,使沐浴溶液中的微电极尖端可视化。
注:或者,可以在具有成像软件的计算机上可视化 MCA 和微电极。 - 使用微操作器的控制将微电极的尖端移到靠近血管外壁的地方。微操作器和微电极尖端必须处于与组织相关的稳定位置。
注:在开始实验之前,确认膜电压已稳定。如果测量的电压不稳定,则电极和电池之间的连接未密封,表示存在泄漏。 - 开始录制。
- 缓慢地将微电极的尖端移向容器,使用过程或微操作器的精细控制瞄准容器的中心。
注:有时,当微电极尖端接触肌肉纤维膜时,可能会观察到记录中的小偏转。 - 当尖端靠近血管时,使用微操作器将电极向前推进,以刺穿肌肉膜。
- 此时,可以开始观察所记录的 Vm的变化。当微电极刺穿细胞膜时,请勿触摸微操作器。
注:记录和参考电极之间的电压差从 0 mV 降至 -40 mV 和 -75 mV 之间,具体取决于血管内压力水平或其他兴奋或抑制性刺激。这些读数是当前细胞的跨膜电位差的特征。 - 在船舶不同区域对一艘船舶进行多次浸渍,而不会损坏 VSMC,以获得准确的测量。
- 录制后,使用操纵器在一次快速运动中拆下微电极。
- 停止录制并保存数据文件以供进一步分析。
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Representative Results
该方法可以可靠地用于在罐式容器中记录Vm。图1A中介绍了一个描述如何从大脑中分离MCA的简要过程。将大脑与头骨分离后,MCA被解剖出来,并放置在含有低钙PSS的培养皿中。附加的部分结缔组织也使用弹簧剪刀和钳子与 MCA 一起解剖,以防止在隔离过程中对 MCA 造成损伤。仔细,结缔组织也被移除,解剖的MCA准备转移到近影。MCA 安装在导管上,在表形图的导管两端使用缝合结进行绑。图1B显示了典型微电极防浸方法设置的示意图。装有 3 M KCl 的微电极通过探头中的支架连接到静电计。使用 BNC-BNC 电缆将静电计的通道输出连接到数字化仪的模拟输入通道。数字化器输出进一步连接到示波器,以在记录软件中可视化信号。地面使用 AgCl 颗粒线建立,该导线从静电计的机箱扩展到肌图中的沐浴解决方案。最后,在计算机显示器上的记录软件中可视化了数字轨迹。
MCA随后在新鲜制备的暖PSS中孵育,并加压至60 mmHg。只有增益音的容器用于 Vm录制。在容器获得显著音色后,微电极被推进到容器壁上。使用视频显微镜对动脉的直径和动脉的浸渍进行了可视化。当存在快速偏转到负值时,当 Vm稳定为 ±30 s 时,电压在移除电极时突然返回 0 mV,如图212、15所示,因此被视为成功。我们的结果表明,在加压为 60 mmHg 的 MCA 中,Vm为 ± -43.2 ± 2.9 mV。
在成功进行浸渍和Vm稳定后,在浴缸中注入Vm的药物和Vm的变化被记录下来。我们使用 20 mM KCl 去极化和 20 μM NS1619(一种合成大导电钾通道开路器)来使膜超极化。我们的结果表明,用KCl灌注的腔室使膜去极化±5.8 ± 0.18 mV。另一方面,用NS1619灌注使膜超极化±3.8 ±0.4 mV。
图1:中脑动脉分离图,采用微电极浸渍法记录膜电位。(A) 使用弹簧剪刀,沿着虚线切割大脑或结缔组织。在两个玻璃管之间转移和安装 MCA,并使用缝合线在充满 PSS 的肌图室中固定 MCA。(B) 一个装有 3 M KCl 的微电极插入支架,并连接到探头。通过 BNC 电缆从探头到电表和数字化仪的跨膜电位变化(BNC 电缆从电表的通道输出连接到数字化仪的模拟输入)。在显示器上的录制软件中可以看到数字化电位。地面使用 AgCl 颗粒线从电表连接到肌图中的沐浴溶液。MCA = 中脑动脉;PSS = 生理盐溶液;AgCl = 氯化银。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:利用微电极浸渍法从罐化中脑动脉记录膜电位。Vm的代表性痕迹 。如果电极进入时突然偏转到负值,Vm稳定 30 s,并且卸下电极时电压突然返回 0 mV,则认为压片成功。X 轴表示时间,Y 轴表示膜电位。虚线表示在船舶浸渍之前调整的基线。秒 = 秒。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:当血管暴露于血管活性剂时,使用微电极浸渍法记录膜电位的变化。Vm在接触血管活性剂之前和之后,使用微电极浸渍法记录在可吸入的中脑动脉。样品跟踪表示 (A) 在响应 20 mM KCl 和 (B) 超极化时响应 20 μM NS1619 的去极化 - 一种较大的导电钾通道激动剂。(C) 应用 KCl 和 NS1619 之前和之后 Vm变化的摘要条形图。虚线表示静止 Vm。括号中的数字表示研究中使用的容器数。请注意,一旦药物被洗掉,Vm就达到基线。错误栏表示平均值的标准误差。秒 = 秒。请点击此处查看此图的较大版本。
| 用于测量电极电阻的静电计设置 | |
| 仪表输入 | 通道 A 或 B |
| 位置切换 | 在 |
| 仪表范围 | 切换至 200 mV |
| 电极 | 在浴缸里 |
| 模式 | 操作到电极测试 |
| 仪表指示 | 1 mV/MΩ |
表1:用于测量电极电阻的静电计设置。
| 化学品 | 低钙 PSS mM | 正常 PSS mM | 公司 | 目录 | |
| 1 | Nacl | 119.00 | 119.00 | 西格玛 | S7653 |
| 2 | 氯化钾 | 4.70 | 4.70 | 西格玛 | P4504 |
| 3 | MgSO4 | 1.17 | 1.17 | 西格玛 | M7506 |
| 4 | CaCl2 | 0.05 | 1.60 | 西格玛 | C3881 |
| 5 | 赫佩斯 | 5.00 | 5.00 | 西格玛 | H7006 |
| 6 | 葡萄糖 | 10.00 | 10.00 | 西格玛 | G7021 |
| 7 | NaH2PO4 | 1.18 | 1.18 | 西格玛 | S0751 |
| 8 | NaHCO3 | 18.00 | 18.00 | 西格玛 | S5761 |
| pH: 7.4 | pH: 7.4 |
表2:试剂用于制备低钙和正常生理盐溶液。
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Discussion
本文提供了如何使用锋利的微电极浸渍法从罐化容器制备中记录Vm的必要步骤。该方法被广泛使用,并提供高质量、一致的Vm记录,回答广泛的实验问题。
此处介绍了一些关键注意事项和故障排除步骤,以确保该方法成功。微电极的质量(其锐度和电阻)及其穿透的细胞过程影响Vm的稳定性和精度。如果信号持续漂移或高于或低于放大器的录制范围,则极有可能电极被阻塞或尖端损坏。如果浸渍只是部分、不足或损坏细胞,则记录的潜在信号爬回 0 mV,导致信号不稳定或没有信号。在某些情况下,电池的内容物也可以阻止非常高的电阻电极。所有这些问题只需用新电极替换即可。
要成功进行防腐,必须确保细胞膜的总电阻不变,且测得的膜电位稳定,电极和膜之间没有泄漏。稳定的微操作器将电极推进到电池上,这一点至关重要。当推进到电池几微米以内时,尖端电位将发生变化,导致检测到的电压略有偏转。为了避免损坏电极尖端或细胞膜拉伸,需要快速推进电极。成功的防浸的特点是膜电位迅速下降,然后围绕膜的静息电位保持稳定。如果电位读数波动,电极尖端可能会破坏膜,导致钠泄漏到细胞中,钾从细胞中泄漏,导致逐渐去极化。此方法中的另一个问题是,结电位和电极尖端电位可能会向 Vm记录添加不必要的伪影。当不同的导体接触时,会发生接合电位。有两种不同类型的交汇电位,即液态金属和液体-液体。当探头尖端接触微移液器中的电解质时,形成液态金属结。当两种不同浓度的溶液接触时,就会发生液体-液体结点,也称为液体结电位。溶液之间的离子扩散有助于潜力的发展。此外,玻璃电极尖端与液体相互作用的特性会产生尖端电位。为了最小化交汇点和尖端电位,将测得的电位归零可减少不需要的偏置。在浸渍过程中,不能排除在一些实验中无意中取样 Vm的可能性,即内皮,而不是平滑的肌肉。然而,研究表明,内皮层和VSMC层在小动脉中电耦合,并表现出类似的Vm响应23。
最终,此过程的三个步骤对于成功录制至关重要。首先,船只必须做好适当准备,确保船只在此过程中不会损坏。第二,必须将微电极拉到正确的电气特性。最后,在不破坏尖端的情况下快速进行膜浸渍对于准确的结果至关重要。研究者必须了解电生理学,如何创建可行的微电极,以及如何设置和使用电表。
尽管这种方法很重要,但这种方法有各种局限性。首先,采购所有设备的总费用很高(30-40 000美元)。第二,所有这些实验都需要新鲜的容器;因此,动物被安乐死,每次实验,增加了总成本。第三,脑动脉的解剖,血管的血管的可分断是单调乏味的,昂贵的,并且有一个学习曲线。第四,制备微电极、浸渍和记录Vm需要透彻地了解电生理学。最后,在实验室中建立这种设置需要专门的人员、时间和精力。
Vm是一种重要的电生理特性,它决定血管张力,从而将血液流向器官。Vm可以通过从神经元、内皮和血液成分释放的几种血管活性化学物质改变。血管收缩器使膜去极化,扩张器使膜极化。几种蛋白质,包括K+通道,VGCC,ATPase钾,Ca2+ATPase,Cl通道,商店操作和拉伸通道调节V m。在疾病条件下,这些蛋白质的任何变化都可能改变Vm,从而改变血管张力和血流。微电极防浸方法可用于记录休息以及 Vm中响应血管收缩剂和扩张器的变化。因此,该方法可以可靠地用于理解与疾病相关的正常和改变的Vm,并且可用于开发用于调节V m、血管张力和血流的药理剂。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作部分得到了UMMC的校内支持研究计划(IRSP)的资助,AHA科学家发展赠款(13SDG14000006)授予了Mallikarjuna R. Pabbidi。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
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