Metodo di impalamento dei microelettrodi per registrare il potenziale della membrana da un'arteria cerebrale media cannulata
Summary
L’obiettivo principale di questo articolo è quello difornire dettagli su come registrare il potenziale della membrana (V m) dall’arteria cerebrale media utilizzando il metodo di impalamento dei microelettrodi. L’arteria cerebrale media cannulata è equilibrata per ottenere un tono miogenico, e la parete del vaso è impalato utilizzando microelettrodi ad alta resistenza.
Abstract
Il potenzialedi membrana (V m) delle cellule muscolari limpiche vascolari determina il tono del vaso e quindi il flusso sanguigno a un organo. Cambiamenti nell’espressione e nella funzione dei canali ionici e delle pompe elettrogeniche che regolano Vm in condizioni di malattia potrebbero potenzialmente alterare Vm, tono vascolare e flusso sanguigno. Pertanto, una comprensione di base dell’elettrofisiologia e dei metodi necessari per registrare con precisione Vm in stati sani e malati sono essenziali. Questo metodo permetterà la modulazione Vm utilizzando diversi agenti farmacologici per ripristinare Vm. Anche se ci sono diversi metodi, ognuno con i suoi vantaggi e svantaggi, questo articolo fornisce protocolli per registrare Vm da vasi di resistenza cannulati come l’arteria cerebrale media utilizzando il metodo di impalamento dei microelettrodi. Le arterie cerebrali medie sono autorizzate a ottenere un tono miogenico in una camera miografica, e la parete del vaso è impalato utilizzando microelettrodi ad alta resistenza. Il segnale Vm viene raccolto attraverso un elettrometro, digitalizzato e analizzato. Questo metodo fornisce una lettura accurata del Vm di una parete del vaso senza danneggiare le cellule e senza modificare la resistenza della membrana.
Introduction
Il potenziale della membrana (Vm) di una cellula si riferisce alla differenza relativa della carica ionica attraverso la membrana plasmatica e alla relativa permeabilità della membrana a questi ioni. Il Vm è generato dalla distribuzione differenziale degli ioni ed è mantenuto da canali ionici e pompe. I canali ionicicome K,Na , e Cl, contribuiscono in modo sostanziale al Vma riposo. Le cellule muscolari limpiche (VSMC) esprimono più di quattro diversi tipi di canali K1, due tipi di canali Ca2 , gated tensione (VGCC)2, più di due tipi di CL– canali3, 4 DEL psu’ , 5, canali Ca2 , gestiti in negozio6, canali di cation attivati in stretch7,8e pompe APase di sodio elettrogeni che sonito novantano9 nelle loro membrane plasmatiche, tutte coinvolti nella regolamentazione del Vm.
Il Vm di VSMC dipende dalla pressione del lume. Nei recipienti non pressurizzati, Vm varia da -50 a -65 mV, tuttavia, nei segmenti arteriosi pressurizzati, Vm varia da -37 a -47 mV10. L’elevazione della pressione intravascolare fa depolarizzare le VSMC11, diminuisce la soglia per l’apertura del VGCC e aumenta l’afflusso di calcio contribuendo allo sviluppo del tono miogenico12. Al contrario, nei vasi passivi o non pressurizzati, l’iperpolarizzazione della membrana, dovuta all’elevata attività del canale K, impedirà l’apertura del VGCC, con conseguente ingresso limitato di calcio e una diminuzione del calcio intracellulare, contribuendo a meno tono vascolare13. Così, Vm a causa di cambiamenti nella pressione del lume sembra svolgere un ruolo essenziale nello sviluppo del tono vascolare, e sia VGCC e K, canali svolgono un ruolo cruciale nella regolazione del Vm.
Vm varia tra il tipo di vaso e le specie. Vm è -54 x 1,3 mV in porcellino d’India superiore strisce arteriose mesentiche14, -451 mV nelle arterie cerebrali medie del ratto a 60 mmHg lumen pressione12, e -35 – 1 mV in ratto arterie parenchyli a 40 mmHg lumen pressione15. Il vm a riposo registrato nel muscolo linfatico del ratto non teso è -48 – 2 mV16. Vm di VSMC cerebrali è più negativo che nelle arterie periferiche. In confronto, le arterie cerebrali medie feline sono state segnalate per avere un Vm di circa -70 mV, mentre le arterie mesentiche e coronariche sono state segnalate per avere -49 e -58 mV, rispettivamente17,18. Le differenze nel Vm attraverso letti vascolari possono riflettere le differenze nell’espressione e nella funzione dei canali ionici e delle pompe elettrogeniche di sodio-potassio.
Gli aumenti e le diminuzioni in Vm sono indicati come depolarizzazione della membrana e iperpolarizzazione, rispettivamente. Queste alterazioni in Vm svolgono un ruolo centrale in molti processi fisiologici, tra cui gating ionista-canale, segnalazione cellulare, contrazione muscolare, e potenziale di propagazione dell’azione. Ad una pressione fissa, molti composti vasodilatatori endogeni e sintetici che attivano i canali K – causano l’iperpolarizzazione della membrana, con conseguente vasodilazione1,13. Al contrario, la depolarizzazione sostenuta della membrana è vitale nell’indottodagli agonisti o nell’vasoconia 19 mediata dal recettore. Vm è una variabile critica che non solo regola l’afflusso di Ca2 o attraverso VGCC13, ma influenza anche il rilascio di Ca2, dai negozi interni20,21 e Ca 2–sensibilità di l’apparato contrattile22.
Mentre ci sono diversi metodi per registrare Vm da diversi tipi di cellule, i dati raccolti dal metodo di impalamento dei microelettrodi dei vasi cannulati sembrano essere più fisiologici dei dati ottenuti da VSMC isolati. Quando viene registrato da VSMC isolato utilizzando i metodi di morsetto correnti, Vm è visto come iperpolarizzazioni transitorie spontanee in VSMC24. VsMC isolati non sono nel sinistium e le modifiche nella resistenza di serie possono contribuire al comportamento oscillatorio di Vm. D’altra parte, il comportamento oscillatorio non si osserva quando Vm è registrato da vasi intatti, probabilmente a causa del contatto cellulare-cellula tra VSMC che sono in sincronia nell’arteria e sono riassunti in tutta la nave che porta ad una stabile Vm 24.Pertanto, la misurazione di Vm da vasi pressurizzati utilizzando la tecnica standard di impalamento dei microelettrodi è relativamente vicina alle condizioni fisiologiche.
La registrazione di Vm da vasi cannulati potrebbe fornire informazioni vitali, dal momento che Vm di VSMC che sono in sinistium è uno dei principali determinanti del tono vascolare e del flusso sanguigno, e la modulazione del Vm potrebbe fornire un modo per dilatare o i vasi sanguigni. Pertanto, è essenziale comprendere la metodologia coinvolta nella registrazione di Vm. Questo articolo descrive la registrazione intracellulare di Vm da arterie cerebrali medie cannulate (MCA) utilizzando un metodo di impalamento dei microelettrodi. Questo protocollo descrive come preparare Gli ICM, i microelettrodi, impostare l’elettrometro ed eseguire il metodo di impalamento per registrare Vm. Inoltre, vengono discussi i dati rappresentativi, i problemi comuni che si sono verificati durante l’utilizzo di questo metodo e i potenziali problemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo fornisce i passaggi necessari su come utilizzare un metodo di impalamento a microelettrodo affilato per registrare Vm dalla preparazione di un vaso cannulato. Questo metodo è ampiamente utilizzato e offre registrazioni coerenti e di alta qualità di Vm che rispondono a una vasta gamma di domande sperimentali.
Alcune considerazioni critiche e procedure per la risoluzione dei problemi sono descritte di seguito per garantire l’esito positivo del metodo. La q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalle sovvenzioni del programma di ricerca sul supporto intramurale (IRSP) dell’UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) assegnate a Mallikarjuna R. Pabbidi.
Materials
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
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