Summary
L'obiettivo principale di questo articolo è quello difornire dettagli su come registrare il potenziale della membrana (V m) dall'arteria cerebrale media utilizzando il metodo di impalamento dei microelettrodi. L'arteria cerebrale media cannulata è equilibrata per ottenere un tono miogenico, e la parete del vaso è impalato utilizzando microelettrodi ad alta resistenza.
Abstract
Il potenzialedi membrana (V m) delle cellule muscolari limpiche vascolari determina il tono del vaso e quindi il flusso sanguigno a un organo. Cambiamenti nell'espressione e nella funzione dei canali ionici e delle pompe elettrogeniche che regolano Vm in condizioni di malattia potrebbero potenzialmente alterare Vm, tono vascolare e flusso sanguigno. Pertanto, una comprensione di base dell'elettrofisiologia e dei metodi necessari per registrare con precisione Vm in stati sani e malati sono essenziali. Questo metodo permetterà la modulazione Vm utilizzando diversi agenti farmacologici per ripristinare Vm. Anche se ci sono diversi metodi, ognuno con i suoi vantaggi e svantaggi, questo articolo fornisce protocolli per registrare Vm da vasi di resistenza cannulati come l'arteria cerebrale media utilizzando il metodo di impalamento dei microelettrodi. Le arterie cerebrali medie sono autorizzate a ottenere un tono miogenico in una camera miografica, e la parete del vaso è impalato utilizzando microelettrodi ad alta resistenza. Il segnale Vm viene raccolto attraverso un elettrometro, digitalizzato e analizzato. Questo metodo fornisce una lettura accurata del Vm di una parete del vaso senza danneggiare le cellule e senza modificare la resistenza della membrana.
Introduction
Il potenziale della membrana (Vm) di una cellula si riferisce alla differenza relativa della carica ionica attraverso la membrana plasmatica e alla relativa permeabilità della membrana a questi ioni. Il Vm è generato dalla distribuzione differenziale degli ioni ed è mantenuto da canali ionici e pompe. I canali ionicicome K,Na , e Cl, contribuiscono in modo sostanziale al Vma riposo. Le cellule muscolari limpiche (VSMC) esprimono più di quattro diversi tipi di canali K1, due tipi di canali Ca2 , gated tensione (VGCC)2, più di due tipi di CL- canali3, 4 DEL psu' , 5, canali Ca2 , gestiti in negozio6, canali di cation attivati in stretch7,8e pompe APase di sodio elettrogeni che sonito novantano9 nelle loro membrane plasmatiche, tutte coinvolti nella regolamentazione del Vm.
Il Vm di VSMC dipende dalla pressione del lume. Nei recipienti non pressurizzati, Vm varia da -50 a -65 mV, tuttavia, nei segmenti arteriosi pressurizzati, Vm varia da -37 a -47 mV10. L'elevazione della pressione intravascolare fa depolarizzare le VSMC11, diminuisce la soglia per l'apertura del VGCC e aumenta l'afflusso di calcio contribuendo allo sviluppo del tono miogenico12. Al contrario, nei vasi passivi o non pressurizzati, l'iperpolarizzazione della membrana, dovuta all'elevata attività del canale K, impedirà l'apertura del VGCC, con conseguente ingresso limitato di calcio e una diminuzione del calcio intracellulare, contribuendo a meno tono vascolare13. Così, Vm a causa di cambiamenti nella pressione del lume sembra svolgere un ruolo essenziale nello sviluppo del tono vascolare, e sia VGCC e K, canali svolgono un ruolo cruciale nella regolazione del Vm.
Vm varia tra il tipo di vaso e le specie. Vm è -54 x 1,3 mV in porcellino d'India superiore strisce arteriose mesentiche14, -451 mV nelle arterie cerebrali medie del ratto a 60 mmHg lumen pressione12, e -35 - 1 mV in ratto arterie parenchyli a 40 mmHg lumen pressione15. Il vm a riposo registrato nel muscolo linfatico del ratto non teso è -48 - 2 mV16. Vm di VSMC cerebrali è più negativo che nelle arterie periferiche. In confronto, le arterie cerebrali medie feline sono state segnalate per avere un Vm di circa -70 mV, mentre le arterie mesentiche e coronariche sono state segnalate per avere -49 e -58 mV, rispettivamente17,18. Le differenze nel Vm attraverso letti vascolari possono riflettere le differenze nell'espressione e nella funzione dei canali ionici e delle pompe elettrogeniche di sodio-potassio.
Gli aumenti e le diminuzioni in Vm sono indicati come depolarizzazione della membrana e iperpolarizzazione, rispettivamente. Queste alterazioni in Vm svolgono un ruolo centrale in molti processi fisiologici, tra cui gating ionista-canale, segnalazione cellulare, contrazione muscolare, e potenziale di propagazione dell'azione. Ad una pressione fissa, molti composti vasodilatatori endogeni e sintetici che attivano i canali K - causano l'iperpolarizzazione della membrana, con conseguente vasodilazione1,13. Al contrario, la depolarizzazione sostenuta della membrana è vitale nell'indottodagli agonisti o nell'vasoconia 19 mediata dal recettore. Vm è una variabile critica che non solo regola l'afflusso di Ca2 o attraverso VGCC13, ma influenza anche il rilascio di Ca2, dai negozi interni20,21 e Ca 2-sensibilità di l'apparato contrattile22.
Mentre ci sono diversi metodi per registrare Vm da diversi tipi di cellule, i dati raccolti dal metodo di impalamento dei microelettrodi dei vasi cannulati sembrano essere più fisiologici dei dati ottenuti da VSMC isolati. Quando viene registrato da VSMC isolato utilizzando i metodi di morsetto correnti, Vm è visto come iperpolarizzazioni transitorie spontanee in VSMC24. VsMC isolati non sono nel sinistium e le modifiche nella resistenza di serie possono contribuire al comportamento oscillatorio di Vm. D'altra parte, il comportamento oscillatorio non si osserva quando Vm è registrato da vasi intatti, probabilmente a causa del contatto cellulare-cellula tra VSMC che sono in sincronia nell'arteria e sono riassunti in tutta la nave che porta ad una stabile Vm 24.Pertanto, la misurazione di Vm da vasi pressurizzati utilizzando la tecnica standard di impalamento dei microelettrodi è relativamente vicina alle condizioni fisiologiche.
La registrazione di Vm da vasi cannulati potrebbe fornire informazioni vitali, dal momento che Vm di VSMC che sono in sinistium è uno dei principali determinanti del tono vascolare e del flusso sanguigno, e la modulazione del Vm potrebbe fornire un modo per dilatare o i vasi sanguigni. Pertanto, è essenziale comprendere la metodologia coinvolta nella registrazione di Vm. Questo articolo descrive la registrazione intracellulare di Vm da arterie cerebrali medie cannulate (MCA) utilizzando un metodo di impalamento dei microelettrodi. Questo protocollo descrive come preparare Gli ICM, i microelettrodi, impostare l'elettrometro ed eseguire il metodo di impalamento per registrare Vm. Inoltre, vengono discussi i dati rappresentativi, i problemi comuni che si sono verificati durante l'utilizzo di questo metodo e i potenziali problemi.
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Protocol
I ratti maschi sono stati alloggiati presso l'Animal Care Facility dell'UMMC, approvato dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio (AAALAC). Gli animali hanno avuto libero accesso al cibo e all'acqua durante tutto lo studio. Gli animali sono stati mantenuti in un ambiente controllato con temperatura a 24 , 2 gradi centigradi, livelli di umidità del 60-80% e cicli di luce/buio di 12 h. Tutti i protocolli sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee dell'UMMC.
1. Preparazione dell'attrezzatura
- Posizionare un amplificatore elettrometro differenziale a doppio canale (vedere il Tavolo deimateriali) vicino alla camera del vaso e nella posizione desiderata.
- Collegare l'uscita del canale a o B dell'amplificatore all'ingresso del canale del digitalizzatore con un cavo BNC-BNC.
- Montare la sonda nel micromanipolatore e posizionarla vicino al microscopio e al miografo. L'impostazione della registrazione deve essere installata su un tavolo privo di vibrazioni.
- Posizionare le manopole e gli interruttori sulla parte anteriore dell'amplificatore in posizioni che lo configurano per questo esperimento come descritto nel manuale.
- Collegare il terreno del bagno al terreno del circuito dell'amplificatore tramite un elettrodo appropriato. Allo stesso modo, assicurarsi che la gabbia sia messa a terra sul telaio dell'amplificatore.
2. Preparazione di microelettrodi e assemblaggio
-
Utilizzare microelettrodi in vetro borosilicato (vedi Il Tavolo dei Materiali) e tirare la punta di vetro per avere un cono di 8-10 mm, un diametro di <1 m e una resistenza di 80-120 Mz quando riempito con 3 M KCl.
- Utilizzare un tiratore standard per ottenere un breve cono graduale utilizzando le seguenti impostazioni: calore - 650; velocità : 20; tirare 25; 250 e loop due volte per resistenze più elevate e punte più piccole. Vedere la Tabella dei materiali poiché le impostazioni sono specifiche dello strumento.
NOT: I diametri della punta <1 m causano danni minimi alla cellula quando sono impalati.
- Utilizzare un tiratore standard per ottenere un breve cono graduale utilizzando le seguenti impostazioni: calore - 650; velocità : 20; tirare 25; 250 e loop due volte per resistenze più elevate e punte più piccole. Vedere la Tabella dei materiali poiché le impostazioni sono specifiche dello strumento.
-
Riempire il microelettrodo con 3 M KCl utilizzando una siringa in microfibra (vedi la Tabella dei Materiali).
- Tirare lentamente lo stantuffo della siringa in microfibra mentre si inietta il kCl 3 M nel microelettrodo per consentire il riempimento del fluido e per evitare la formazione di bolle d'aria all'interno del microelettrodo.
- Riempire il microelettrodo fino al massimo e assicurarsi che non vi siano bolle d'aria prima di inserirlo nel supporto del microelettrodo. Se sono presenti bolle, toccare delicatamente il microelettrodo con un dito per rimuovere le bolle.
- Esercitare la cura, spingere saldamente il gambo dell'elettrodo nel supporto attraverso il foro annoiato. Se è presente liquido in eccesso, rimuoverlo con un tessuto.
- Collegare il supporto dell'elettrodo alla sonda dell'amplificatore. Eseguire un test dell'elettrodo, regolare l'offset di ingresso, verificare l'impostazione zero e controllare la perdita di ingresso della sonda in base al manuale dell'amplificatore.
- Misurare la resistenza agli elettrodi utilizzando un test dell'elettrodo come mostrato nella Tabella 1.
- Si noti che un elettrodo funzionante visualizza uno spostamento di tensione DC positivo di 1 mV / M, all'uscita del canale. D'altra parte, se una grande tensione appare all'uscita del canale e sul misuratore, ciò indica un elettrodo bloccato o rotto.
- Aprire il software di registrazione, assegnare un nome al file e salvarlo per analisi future in un software di memorizzazione.
3. Isolamento e cannulazione dell'arteria cerebrale di mezzo
-
Preparazione dei reagenti.
- Preparare la soluzione salina fisiologica normale e a basso calcio (PSS) come descritto nella tabella 2.
-
Prepara il miografo.
- Sciacquare la camera del miografo (vedi la tabella deimateriali) con acqua distillata più volte per mantenerla libera dai detriti. Caricare la camera con 5 mL di PSS normale.
- Riempire entrambe le cannule di vetro con PSS normale filtrato utilizzando una siringa da 5-10 mL. Riempire con cura l'intera cannula e il tubo allegato senza introdurre bolle d'aria.
- Preparare due suture di nylon monofilamento (10-0, 0,02 mm) con un mezzo nodo ciascuno con pinze smussate.
- Posizionare i nodi di sutura parzialmente chiusi su entrambe le cannule leggermente lontano dalla punta utilizzando pinze di dissezione al microscopio di dissezione. Più tardi questi nodi saranno scivolati via e legati con cura sulle estremità arteriose cannulate per fissare il vaso.
-
Isolare e cannulare l'arteria cerebrale media.
- Indurre l'anestesia profonda in un ratto Sprague Dawley utilizzando 2-4% isoflurane inalato.
- Decapitare il ratto usando ghigliottina in anestesia profonda.
- Rimuovere con attenzione il cranio con una fresa ossea e una forbice.
- Togliere il cervello dal cranio e metterlo in 5 mL di PSS a basso calcio sul ghiaccio.
- Identificare e sezionare un segmento non ramificato dell'arteria cerebrale media del ratto (MCA) con un diametro interno di 100-200 m dal cervello usando forbici e pinze a molla.
- Montare l'MCA sulle cannule di vetro con pinze sottili e fissarlo stringendo le suture nel miografo contenente PSS normale.
- Chiudere la cannula distale in modo che non ci sarà alcun flusso all'interno degli ICM.
- Collegare la pipetta di afflusso a un serbatoio che contiene PSS per consentire il controllo della pressione intraluminale che verrà monitorata con un trasduttore di pressione in linea.
- Visualizza gli MCA cannulati utilizzando una fotocamera del dispositivo accoppiata a carica (vedi la Tabella deimateriali) montata su un microscopio invertito e un software di imaging.
- Impostare la lunghezza assiale dell'MCA su una lunghezza approssimativa in cui non dovrebbe apparire né rigida né flaccida.
- La soluzione bagno con O2 (95%) e CO2 (5%) a 37 gradi centigradi per fornire un'adeguata ossigenazione, temperatura e per mantenere il pH a 7,4.
-
Impala (penetrare la membrana plasmatica cellulare) le cellule muscolari lisce vascolari.
- Collegare l'elettrodo di terra e tenerlo immerso nel PSS del miografo.
- Illuminare la camera del vaso e guardare attraverso il microscopio per visualizzare la punta del microelettrodo nella soluzione bagno.
NOT: In alternativa, si può visualizzare l'MCA e microelettrodo su un computer con un software di imaging. - Utilizzare i comandi del micromanipolatore per spostare la punta del microelettrodo vicino alla parete esterna del vaso sanguigno. Il micromanipolatore e la punta del microelettrodo devono trovarsi in una posizione stabile rispetto al tessuto.
NOT: Prima di iniziare gli esperimenti, verificare che la tensione della membrana si sia stabilizzata. Se la tensione misurata è instabile, la connessione tra l'elettrodo e la cella non è sigillata, indicando una perdita. - Iniziare la registrazione.
- Spostare lentamente la punta del microelettrodo verso la nave, puntando verso il centro della nave utilizzando il percorso o il controllo fine del micromanipolatore.
NOT: Occasionalmente, una piccola deviazione nella registrazione può essere osservata quando la punta del microelettrodo contatta una membrana della fibra muscolare. - Quando la punta arriva in prossimità della nave, far avanzare l'elettrodo in avanti in un movimento rapido utilizzando il micromanipolatore per impalare la membrana del muscolo.
- A questo punto, si può iniziare a osservare i cambiamenti in Vm in fase di registrazione. Non toccare il micromanipolatore quando il microelettrodo impalde la membrana della cellula.
NOT: La differenza di tensione tra l'elettrodo di registrazione e l'elettrodo di riferimento diminuisce da 0 mV a -40 mV e -75 mV a seconda del livello di pressione intravascolare o di altri stimoli eccitatori o inibitori. Queste letture caratterizzano la differenza potenziale transmembrana della cellula corrente. - Eseguire più impalementi su una singola nave in diverse aree della nave senza danneggiare le VSMC al fine di ottenere misurazioni accurate.
- Dopo la registrazione, utilizzare il manipolatore per rimuovere il microelettrodo in un movimento rapido.
- Interrompere la registrazione e salvare i file di dati per un'ulteriore analisi.
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Representative Results
Il metodo presentato può essere utilizzato in modo affidabile per registrare Vm in vasi cannulati. Una breve procedura che descrive come isolare MCA dal cervello è presentato in Figura 1A. Dopo aver diviso il cervello dal cranio, l'MCA è stato sezionato e posto in un piatto Petri contenente PSS a basso calcio. Parte del tessuto connettivo che è stato attaccato è stato anche sezionato insieme a MCA utilizzando forbici a molla e pinze per evitare danni a MCA durante l'isolamento. Con attenzione, anche il tessuto connettivo è stato rimosso, e l'MCA sezionato era pronto per il trasferimento al miografo. MCA è stato montato sulle cannulas e legato utilizzando nodi di sutura su entrambe le estremità delle cannule nel miografo. Nella Figura 1Bè illustrata una rappresentazione schematica dell'impostazione di un tipico metodo di impalamento dei microelettrodi. Un microelettrodo riempito con 3 M KCl è stato collegato all'elettrometro tramite un supporto nella sonda. L'uscita del canale dell'elettrometro è stata collegata a un canale di ingresso analogico di un digitalizzatore utilizzando un cavo BNC-BNC. L'uscita del digitalizzatore è stata ulteriormente collegata a un oscilloscopio per visualizzare il segnale nel software di registrazione. Il terreno è stabilito utilizzando un filo di pellet AgCl che è stato esteso dal telaio dell'elettrometro alla soluzione bagno nel miografo. Infine, le tracce digitali sono state visualizzate nel software di registrazione sul monitor del computer.
L'MCA è stato poi incubato in PSS caldo appena preparato ed è stato pressurizzato a 60 mmHg. Solo i vasi con tono di guadagno sono stati utilizzati per la registrazione Vm. Dopo che il vaso ha guadagnato un tono significativo, il microelettrodo è stato avanzato nella parete del vaso. Il diametro arterioso e l'impalamento dell'arteria sono stati visualizzati mediante microscopia video. Impalement è considerato riuscito quando c'è una rapida deviazione ai valori negativi, Vm è stabile per s 30 dollari, e la tensione ritorna bruscamente a 0 mV al momento della rimozione dell'elettrodo come mostrato Figura 212,15. I nostri risultati suggeriscono che, in un MCA che viene pressurizzato a 60 mmHg, il Vm è -43,2 - 2,9 mV.
Dopo un impalamento riuscito e la stabilizzazione a V m, i farmaci che cambiano il Vm sono stati perfusi nella vasca da bagno e sono stati registrati cambiamenti nel Vm. Abbiamo usato 20 mM KCl per depolarizzare e 20 - M NS1619, un apricanale sintetico di grande conduttura di potassio di conduttura, per iperpolarizzare la membrana. I nostri risultati suggeriscono che la perfusione della camera con KCl depolarizzato la membrana di 5,8 , 0,18 mV. D'altra parte, la perfusione con NS1619 ha iperpolarizzato la membrana di 3,8 dollari e 0,4 mV.
Figura 1: Illustrazione dell'isolamento delle arterie cerebrali medie e registrazione del potenziale della membrana utilizzandoil metodo di impalamento dei microelettrodi . (A) Utilizzando le forbici a molla, tagliare il cervello o il tessuto connettivo lungo le linee tratteggiate. Trasferire e montare l'MCA tra le due cannule di vetro e fissarlo utilizzando suture nella camera del miografo riempita con PSS. (B) Un microelettrodo riempito con 3 M KCl viene inserito nel supporto ed è collegato alla sonda. Cambiamenti nel potenziale di viaggio transmembrana dalla sonda a un elettrometro e al digitalizzatore tramite un cavo BNC (il cavo BNC è collegato dall'uscita del canale dell'elettrometro e a un ingresso analogico di un digitalizzatore). Il potenziale digitalizzato è visto nel software di registrazione sul monitor. Il terreno viene creato utilizzando un filo a pellet AgCl collegato dall'elettrometro alla soluzione vasca da bagno nel miografo. MCA - arteria cerebrale media; PSS - soluzione salina fisiologica; AgCl - cloruro d'argento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Registrazione del potenziale della membrana utilizzando il metodo di impalamento dei microelettrodi dalle arterie cerebrali medie cannulate. Traccia rappresentativa di Vm. L'impalamento è considerato riuscito se c'è una deviazione brusca ai valori negativi al momento dell'entrata dell'elettrodo, Vm è stabile per 30 s, e la tensione ritorna bruscamente a 0 mV al momento della rimozione dell'elettrodo. L'asse X rappresenta il tempo e l'asse Y rappresenta il potenziale della membrana. La linea tratteggiata rappresenta la linea di base regolata prima dell'impalamento del vaso. Sec : secondi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Registrazione dei cambiamenti nel potenziale della membrana utilizzando il metodo di impalamento dei microelettrodi quando i vasi sono esposti ad agenti vasoattivi. Vm è stato registrato utilizzando il metodo di impalamento dei microelettrodi dalle arterie cerebrali medie cannulate prima e dopo l'esposizione ad agenti vasoattivi. La traccia di esempio rappresenta la depolarizzazione (A) in risposta all'iperpolarizzazione di 20 mM KCl e (B) in risposta a 20 NS1619, un grande canone di conduttura. (C) Grafico a barre di riepilogo delle modifiche in Vm prima e dopo l'applicazione di KCl e NS1619. La linea tratteggiatarappresenta il V m. Il numero tra parentesi rappresenta il numero di vasi utilizzati nello studio. Si noti che Vm raggiunto linea di base non appena il farmaco viene lavato via. La barra di errore rappresenta l'errore standard della media. Sec : secondi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Impostazioni dell'elettrometro per misurare la resistenza agli elettrodi | |
| Ingresso misuratore | Canale A o B |
| Attiva/disattiva posizione | in |
| Gamma di misura | passare a 200 mV |
| elettrodo | Nella vasca da bagno |
| moda | Opera per il test Electrode |
| Indicazione del contatore | 1 mV/M |
Tabella 1: Impostazioni dell'elettrometro per misurare la resistenza degli elettrodi.
| Prodotti chimici | basso calcio PSS mM | PSS normale mM | azienda | Catalogo | |
| 1 : il nome del | Nacl | Ore 119.00 | Ore 119.00 | sigma m inv f inv | S7653 (informazioni in inglese) |
| 2 Il nome del sistema | Kcl | 4.70 | 4.70 | sigma m inv f inv | P4504 |
| 3 (COM del nome | MGSO4 | 1.17 (in modo non il più necessario) | 1.17 (in modo non il più necessario) | sigma m inv f inv | M7506 |
| 4 DEL psu' | CaCl2 | 0,05 (in via di sin. | 1.60 (in inglese) | sigma m inv f inv | C3881 |
| 5 Del numero 3( | HEPES | Ore ore 5.00 | Ore ore 5.00 | sigma m inv f inv | H7006 |
| 6 È possibile: | glucosio | ore 10.00 | ore 10.00 | sigma m inv f inv | G7021 |
| 7 (in questo stato | NaH2PO4 | 1.18 (in modo instato instato instato in | 1.18 (in modo instato instato instato in | sigma m inv f inv | S0751 |
| 8 (IN vio | NaHCO3 | Ore 18.00 | Ore 18.00 | sigma m inv f inv | S5761 (informazioni in inglese) |
| pH: 7,4 | pH: 7,4 |
Tabella 2: Reagenti utilizzati nella preparazione di un calcio basso e di una normale soluzione salina fisiologica.
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Discussion
Questo articolo fornisce i passaggi necessari su come utilizzare un metodo di impalamento a microelettrodo affilato per registrare Vm dalla preparazione di un vaso cannulato. Questo metodo è ampiamente utilizzato e offre registrazioni coerenti e di alta qualità di Vm che rispondono a una vasta gamma di domande sperimentali.
Alcune considerazioni critiche e procedure per la risoluzione dei problemi sono descritte di seguito per garantire l'esito positivo del metodo. La qualità del microelettrodo (la sua nitidezza e resistenza) e il processo cellulare che penetra influenzano influenzano la stabilità e la precisione di Vm. Se il segnale si sposta continuamente o è al di sopra o al di sotto dell'intervallo di registrazione dell'amplificatore, è molto probabile che l'elettrodo sia bloccato o che la punta sia rotta. Se l'impalamento è solo parziale, insufficiente o danneggia la cella, il potenziale registrato torna a 0 mV con conseguente segnale instabile o nessun segnale. In alcuni casi, il contenuto della cellula può anche bloccare l'elettrodo ad altissima resistenza. Tutti questi problemi possono essere superati semplicemente sostituendo l'elettrodo con uno nuovo.
Per un impalamento di successo, è necessario assicurarsi che la resistenza totale della membrana cellulare sia inalterata e che il potenziale di membrana misurato sia stabile senza perdite tra l'elettrodo e la membrana. È fondamentale che l'elettrodo sia avanzato verso la cellula da un micromanipolatore stabile. Quando si passa a pochi micrometri della cellula, il potenziale di punta cambierà con conseguente una leggera deflessione della tensione rilevata. Per evitare di danneggiare la punta dell'elettrodo o di allungare la membrana cellulare, è necessario un rapido avanzamento dell'elettrodo. Il successo dell'impalamento è caratterizzato da un rapido calo del potenziale della membrana seguito da una stabilizzazione intorno al potenziale di riposo della membrana. Se la potenziale lettura fluttua, è possibile che la punta dell'elettrodo abbia interrotto la membrana causando la fuoriuscita di sodio nella cellula e il potassio fuoriuscire dalla cellula, con conseguente depolarizzazione progressiva. Un altro problema in questo metodo è che i potenziali di giunzione e i potenziali di punta degli elettrodi possono aggiungere un artefatto non necessario alla registrazione V m. I potenziali di giunzione si verificano quando entrano in contatto conduttori diversi. Esistono due diversi tipi di potenziali di giunzione, liquido-metallo e liquido-liquido. Le giunzioni liquido-metallo si formano quando la punta della sonda contatta l'elettrolita nella micropipetta. Le giunzioni liquido-liquido, chiamate anche potenziale di giunzione liquida, si verificano quando entrano in contatto due soluzioni di concentrazioni variabili. La diffusione degli ioni tra le soluzioni contribuisce allo sviluppo del potenziale. Inoltre, le proprietà della punta dell'elettrodo di vetro che interagiscono con il liquido possono generare potenziali di punta. Per ridurre al minimo la giunzione e i potenziali di punta, azzerare il potenziale misurato nella vasca da bagno potrebbe ridurre la distorsione indesiderata. Durante l'impalamento, non si può escludere la possibilità che l'endoteliale, piuttosto che il muscolo liscio, Vm possa inavvertitamente essere campionata in alcuni esperimenti. Tuttavia, gli studi indicano che gli strati di endotelio e VSMC sono accoppiati elettricamente in piccole arteriole e presentano risposte VM simili23.
In definitiva, tre passaggi in questo processo sono fondamentali per ottenere registrazioni di successo. In primo luogo, le navi devono essere adeguatamente preparate, assicurandosi che non siano danneggiate nel processo. In secondo luogo, i microelettrodi devono essere tirati alle giuste proprietà elettriche. Infine, il rapido impalamento della membrana senza rompere la punta è fondamentale per risultati accurati. Lo sperimentatore deve comprendere l'elettrofisiologia, come creare microelettrodi vitali e come impostare e utilizzare un elettrometro.
Nonostante la sua importanza, questo metodo ha varie limitazioni. In primo luogo, il costo complessivo per l'acquisto di tutte le attrezzature è elevato (30-40.000 USD). In secondo luogo, sono necessari vasi freschi per tutti questi esperimenti; quindi un animale è eutanasia per ogni esperimento, aggiungendo al costo complessivo. In terzo luogo, la dissezione delle arterie cerebrali, la canonulazione dei vasi è noiosa, costosa e ha una curva di apprendimento. Quarto, la preparazione di microelettrodi, impalement, e la registrazione Vm richiede una comprensione approfondita dell'elettrofisiologia. Infine, per stabilire questo set up in laboratorio richiede personale dedicato, tempo e fatica.
Vm è una proprietà elettrofisiologica essenziale che determina il tono vascolare e quindi il flusso sanguigno a un organo. Vm potrebbe essere alterato da diverse sostanze chimiche vasoattive che vengono rilasciate da neuroni, componenti endotelio e del sangue. Mentre i vasoconstrictor depolarizzano la membrana, i dilatatori iperpolari la membrana. Diverse proteine, tra cui canali K, VGCC, al ipotassidi ATPase, Ca2, ATPase, Cl- canali, canali gestiti da negozi e stretch regolano il Vm. Le alterazioni in una di queste proteine in condizioni di malattia potrebbero potenzialmente alterare Vm e quindi il tono vascolare e il flusso sanguigno. Il metodo di impalamento dei microelettrodi è utile per registrare il riposo e i cambiamenti in Vm in risposta a vasoconstrictor e dilatatori. Quindi, questo metodo potrebbe essere utilizzato in modo affidabile per comprendere normale e alterato Vm associato alla malattia, e può essere utile nello sviluppo di agenti farmacologici progettati per modulare Vm, tono vascolare e flusso sanguigno.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalle sovvenzioni del programma di ricerca sul supporto intramurale (IRSP) dell'UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) assegnate a Mallikarjuna R. Pabbidi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
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