Summary
Het primaire doel van dit artikel is om de details van hoe het membraanpotentiaal (Vm) van het midden cerebrale slagader met behulp van de microelektrode impalement methode te bieden. De gecanuleerde middelste cerebrale slagader is geëquilibreerd te krijgen myogene Toon, en het schipmuur is Impaled met behulp van hoge weerstand microelektrodes.
Abstract
Membraanpotentiaal (Vm) van vasculaire gladde spiercellen bepaalt het vaartuig Toon en dus de bloedtoevoer naar een orgaan. Veranderingen in de expressie en functie van ionenkanalen en electrogenic pompen die te reguleren Vm in ziekte omstandigheden zou kunnen veranderen vm, vasculaire Toon, en de bloedstroom. Aldus, is een basisbegrip van Elektrofysiologisch en de methodes noodzakelijk om Vm in gezonde en zieke staten nauwkeurig te registreren essentieel. Deze methode kan moduleren Vm met behulp van verschillende farmacologische middelen te herstellen vm. Hoewel er verschillende methoden, elk met zijn voor-en nadelen, dit artikel biedt protocollen voor het opnemen Vm van gecanuleerde weerstand schepen zoals het midden cerebrale slagader met behulp van de microelektrode impalement methode. Middelste cerebrale slagaders zijn toegestaan om myogene Toon te krijgen in een myograph kamer, en het schipmuur is inpaled met behulp van hoge weerstand microelektrodes. Het Vm -signaal wordt verzameld via een elektrometer, gedigitaliseerd en geanalyseerd. Deze methode zorgt voor een nauwkeurige lezing van de Vm van een vaatwand zonder beschadiging van de cellen en zonder de membraan weerstand te veranderen.
Introduction
Het membraanpotentiaal (Vm) van een cel verwijst naar het relatieve verschil van Ionische lading over het plasmamembraan en de relatieve permeabiliteit van het membraan naar deze ionen. De Vm wordt gegenereerd door de differentiële verdeling van ionen en wordt onderhouden door ionenkanalen en pompen. De ionenkanalen zoals K+, na+, en cl− dragen wezenlijk tot het rusten Vmbij. Vasculaire gladde spiercellen (VSMCs) Express meer dan vier verschillende soorten K+ kanalen1, twee soorten van voltage-gated CA2 + kanalen (VGCC)2, meer dan twee soorten cl− kanalen3, 4 , 5, op te slaan-bediend CA2 + kanalen6, Stretch-activated kation kanalen7,8, en electrogenic natrium-kalium ATPase pompen9 in hun plasmamembranen, die allemaal kunnen worden betrokken bij de regulering van Vm.
De Vm van VSMCs hangt af van lumen druk. In niet-drukvaten, Vm varieert van-50 tot-65 mv, echter, in onder druk gezette arteriële segmenten, vm varieert van-37 tot-47 MV10. Elevatie van intravasculaire druk oorzaken VSMCs te depolariseren11, vermindert de drempel voor VGCC opening, en verhoogt de calcium instroom bij te dragen tot de ontwikkeling van myogene Toon12. Integendeel, in passieve of niet-drukvaten, membraan hyperpolarisatie, als gevolg van hoge K+ kanaal activiteit, zal voorkomen dat VGCC van de opening, wat resulteert in een beperkte calcium binnenkomst en een daling van de intracellulaire calcium, bij te dragen tot minder vasculaire Toon13. Zo, Vm als gevolg van veranderingen in de lumen druk lijkt te spelen een essentiële rol in de vasculaire Toon ontwikkeling, en zowel VGCC en K+ kanalen spelen een cruciale rol in de regulering van Vm.
Vm varieert tussen Scheepstype en soort. Vm is-54 ± 1,3 mv in proefkonijn superieure mesenterica arteriële stroken14,-45 ± 1 mv in de rat midden cerebrale slagaders op 60 mmHg lumen druk12, en-35 ± 1 mv in rat parenchymale slagaders op 40 mmHg lumen druk15. De rust Vm opgenomen in ongestrekte rat lymfatische spier is-48 ± 2 MV16. Vm van cerebrale VSMCs is negatiever dan in perifere slagaders. Ter vergelijking, katachtige middelste cerebrale slagaders werden gemeld aan een Vm van ongeveer-70 mV hebben, terwijl mesenterica en kransslagaders werden gemeld te hebben-49 en-58 mv, respectievelijk17,18. Verschillen in de Vm over vasculaire bedden kunnen weerspiegelen de verschillen in de expressie en functie van ionenkanalen en electrogenic natrium-kalium pompen.
De verhogingen en de dalingen in Vm worden bedoeld als membraan depolarisatie en hyperpolarisatie, respectievelijk. Deze veranderingen in Vm spelen een centrale rol in vele fysiologische processen, met inbegrip van ionen-kanaal gating, cel signalering, spiercontractie, en actie potentiële propagatie. Bij een vaste druk, veroorzaken vele endogene en synthetische vaatverwijdende samenstellingen die K+ kanalen activeren membraan hyperpolarisatie, resulterend in vasodilatatie1,13. Omgekeerd, aanhoudende membraan depolarisatie is van vitaal belang in agonist-geïnduceerde of receptor-gemedieerde vasoconstrictie19. Vm is een kritische variabele die niet alleen reguleert CA2 + instroom door VGCC13 , maar ook van invloed op de release van CA2 + van interne winkels20,21 en CA2 +-gevoeligheid van het samentrekbaar apparaat22.
Hoewel er verschillende methoden om Vm record van verschillende soorten cellen, gegevens verzameld uit de microelektrode impalement methode van gecanuleerde schepen lijkt meer fysiologische dan de gegevens verkregen uit geïsoleerde VSMCs. Wanneer geregistreerd van geïsoleerde VSMC gebruikend huidige klem methodes, wordt Vm gezien als spontane voorbijgaande Hyperpolarizations in VSMCs24. Geïsoleerde VSMCs zijn niet in de syncytium, en de veranderingen in de reeks weerstand kan bijdragen tot de oscillerende gedrag van Vm. Aan de andere kant, oscillerende gedrag wordt niet waargenomen wanneer Vm is opgenomen van intacte schepen, waarschijnlijk te wijten aan cel-cel contact tussen VSMCs die in syncytium in de slagader en zijn gesommeerd door het hele schip leidt tot een stabiele Vm 24. aldus, is de meting van Vm van onder druk gezette schepen gebruikend standaard microelektrode impalement techniek vrij dicht bij de fysiologische voorwaarden.
Opname Vm van gecanuleerde schepen kunnen vitale informatie, aangezien vm van VSMCs die in syncytium is een van de belangrijkste determinanten van vasculaire Toon en de doorbloeding, en de modulatie van de v-m kan een manier om verwijden of vernauwen bloedvaten. Zo is het essentieel om te begrijpen van de methodologie die betrokken zijn bij de opname Vm. Dit artikel beschrijft intracellulaire opname van Vm van gecanuleerde middelste cerebrale slagaders (MCAs) met behulp van een microelektrode impalement methode. Dit protocol zal beschrijven hoe te bereiden MCAs, microelektrodes, het opzetten van de elektrometer en uitvoeren van de impalement methode om Vmrecord. Ook representatieve gegevens, gemeenschappelijke problemen die werden aangetroffen bij het gebruik van deze methode en mogelijke problemen worden besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De mannelijke ratten werden gehuisvest in de Dierenzorg faciliteit op UMMC, die is goedgekeurd door de vereniging voor de beoordeling en accreditatie van laboratoriumdieren zorg (AAALAC). Dieren hadden gedurende de hele studie vrije toegang tot voedsel en water. De dieren werden gehandhaafd in een gecontroleerde omgeving met temperatuur bij 24 ± 2 °C, vochtigheidsniveaus van 60 – 80% en 12 h lichte/donkere cycli. Alle protocollen werden goedgekeurd door de Dierenzorg en het gebruik Comite van UMMC.
1. voorbereiding van apparatuur
- Plaats een Dual Channel differentieel elektrometer versterker (Zie de tabel van materialen) dicht bij de schip kamer en op de gewenste locatie.
- Sluit de uitgang van het versterker kanaal A of B aan op de kanaal ingang van de digitizer met een BNC-BNC kabel.
- Monteer de sonde in de micro manipulator en plaats deze in de buurt van de Microscoop en de myograph. De opname-instelling moet worden geïnstalleerd op een tril vrije tafel.
- Plaats de knoppen en schakelingen op de voorkant van de versterker in posities die het configureren voor dit experiment, zoals beschreven in de handleiding.
- Sluit de bad grond aan op het circuit grond van de versterker via met een geschikte elektrode. Evenzo, ervoor te zorgen dat de kooi is geaard om het chassis van de versterker.
2. voorbereiding van de microelektrodes en assemblage
-
Gebruik borosilicaatglas glas microelektrodes (Zie de tabel van materialen) en trek de glazen tip om een 8 tot 10 mm taper, diameter van < 1 µm en weerstand van 80 tot 120 MΩ wanneer gevuld met 3 M KCl.
- Gebruik een standaard trekker om een korte geleidelijke versmalling te bereiken gebruikend de volgende montages: hitte = 650; Velocity = 20; pull = 25; tijd = 250 en lus tweemaal voor hogere weerstanden en kleinere tips. Zie de tabel van de materialen als de instellingen zijn instrument-specifiek.
Opmerking: Tip diameters < 1 µm zal leiden tot minimale schade aan de cel bij inpaled.
- Gebruik een standaard trekker om een korte geleidelijke versmalling te bereiken gebruikend de volgende montages: hitte = 650; Velocity = 20; pull = 25; tijd = 250 en lus tweemaal voor hogere weerstanden en kleinere tips. Zie de tabel van de materialen als de instellingen zijn instrument-specifiek.
-
Vul de micro electrode met een KCl van 3 M met behulp van een spuit (Zie de tabel van de materialen).
- Trek langzaam de zuiger van de microfiber spuit omhoog terwijl het injecteren van de 3 M KCl in de microelektrode om ruimte voor de vloeistof te vullen en om de vorming van luchtbellen te voorkomen in de micro electrode.
- Vul de microelektrode tot vol en zorg ervoor dat er geen luchtbellen voordat u het in de microelektrode houder. Als bubbels aanwezig zijn, tikt u zachtjes op de microelektrode met een vinger om de bubbels te verwijderen.
- De uitoefening van zorg, stevig duw de elektrode schacht in de houder door de verveelde gat. Als overtollig vocht aanwezig is, verwijder het met een tissue.
- Sluit de montage van de elektrode houder aan op de versterker sonde. Voer een elektrode test, pas de input offset, verifiëren nul instelling en controleer de sonde input lekkage volgens de versterker handleiding.
- Meet de elektrode weerstand met behulp van een elektrode test zoals aangegeven in tabel 1.
- Merk op dat een werkende elektrode geeft een positieve DC voltage verschuiving van 1 mV/MΩ op het kanaal uitgang. Aan de andere kant, als een grote spanning verschijnt op het kanaal output en op de meter, dit duidt op een geblokkeerde of gebroken elektrode.
- Open de opname software, wijs een naam aan het dossier toe en bewaar het voor toekomstige analyse in een het opslaan software.
3. isolatie en Canulatie van de middelste hersen slagader
-
Voorbereiding van de reagentia.
- Bereid de normale en lage calcium fysiologische zoutoplossing (PSS) voor, zoals beschreven in tabel 2.
-
Bereid de myograph.
- Spoel de myograph kamer (Zie de tabel van de materialen) met gedistilleerd water meerdere malen te houden vrij van puin. Laad de kamer met 5 mL normale PSS.
- Vul beide glazen canules met een gefilterde normale PSS met een spuit van 5 tot 10 mL. Vul de hele bril en de bijgevoegde slang voorzichtig in zonder luchtbellen te introduceren.
- Bereid twee monofilament nylon hechtingen (10-0, 0,02 mm) met een halve knoop elk met botte Tang.
- Plaats de gedeeltelijk gesloten hechtdraad knopen op beide canules iets weg van de tip met behulp van dissectie Tang onder een dissectie Microscoop. Later zullen deze knopen worden geschoven en zorgvuldig vastgebonden op de gecanuleerde arteriële uiteinden om het schip te beveiligen.
-
Isoleren en cannulate de middelste hersen slagader.
- Induceren diepe anesthesie in een Sprague Delombaerde rat met behulp van 2 tot 4% ingeademd Isofluraan.
- Onthoofd de rat met behulp van guillotine onder diepe anesthesie.
- Verwijder voorzichtig de schedel met behulp van een bone cutter en een schaar.
- Verwijder de hersenen van de schedel en plaats deze in 5 mL van de lage calcium PSS op ijs.
- Identificeer en ontleden uit een onvertakte segment van de rat midden cerebrale slagader (MCA) met een binnendiameter van 100-200 μm uit de hersenen met behulp van de lente schaar en Tang.
- Monteer de MCA op het glas canules met behulp van fijne Tang en veilig door het aandraaien van de hechtingen in de myograph met normale PSS.
- Sluit de distale bril af, zodat er geen stroom binnen de MCAs is.
- Sluit de instroom pipet aan op een reservoir met PSS, zodat de intraluminal druk kan worden gecontroleerd die met een in-line drukregelaar wordt bewaakt.
- Visualiseer de gecanuleerde MCAs met behulp van een charge-gekoppelde apparaat camera (Zie de tabel van materialen) gemonteerd op een omgekeerde Microscoop en een imaging software.
- Stel de axiale lengte van het MCA op een geschatte lengte waar het moet verschijnen noch stijf, noch slappe.
- Equilibrate de bad oplossing met O2 (95%) en CO2 (5%) bij 37 °C om adequate oxygenatie, temperatuur te verstrekken en pH bij 7,4 te handhaven.
-
Impale (doordring de cel plasmamembraan) de vasculaire gladde spiercellen.
- Sluit de grondelektrode en houd deze ondergedompeld in de PSS van de myograph.
- Verlicht de schip kamer en kijk door de Microscoop om het uiteinde van de microelektrode in de bad oplossing te visualiseren.
Opmerking: Als alternatief kan men visualiseren van de MCA en micro elektrode op een computer met een imaging software. - Gebruik de controles van de micromanipulator om het uiteinde van de microelektrode dicht bij de buitenmuur van het bloedvat te bewegen. De micromanipulator en het uiteinde van de microelektrode moeten in een stabiele positie in verhouding tot het weefsel zijn.
Opmerking: Voor het begin van experimenten, bevestigen dat de membraanspanning is gestabiliseerd. Als de gemeten spanning instabiel is, wordt de verbinding tussen de elektrode en de cel niet verzegeld, met vermelding van een lek. - Start de opname.
- Beweeg langzaam het uiteinde van de micro-elektrode naar het schip, strevend naar het centrum van het schip dat cursus of fijne controle van de micromanipulator gebruikt.
Opmerking: Af en toe, een kleine afbuiging in de opname kan worden waargenomen wanneer de microelektrode Tip contact op met een spiervezel membraan. - Wanneer de tip komt in de nabijheid van het schip, vooraf de elektrode naar voren in een snelle beweging met behulp van de micromanipulator om het membraan van de spier impale.
- Op dit punt kan men beginnen met het observeren van de veranderingen in Vm wordt geregistreerd. Raak de micromanipulator niet aan wanneer de microelektrode het membraan van de cel doorboort.
Opmerking: Het verschil in spanning tussen de opname-en referentie-elektrode daalt van 0 mV tot tussen-40 mV en-75 mV afhankelijk van het niveau van de intravasculaire druk of andere prikkelende of remmende stimuli. Deze lezingen kenmerken het transmembraan potentiaalverschil van de huidige cel. - Voer meerdere impales uit op een enkel schip in verschillende gebieden van het schip zonder beschadiging van VSMCs om nauwkeurige metingen te krijgen.
- Na het opnemen, gebruik maken van de manipulator om de microelektrode te verwijderen in een snelle beweging.
- Stop de opname en opslaan van gegevensbestanden voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gepresenteerde methode kan betrouwbaar worden gebruikt voor het opnemen Vm in gecanuleerde schepen. In Figuur 1awordt een korte procedure beschreven om MCA van de hersenen te isoleren. Na het scheiden van de hersenen van de schedel, werd het MCA ontleed en geplaatst in een Petri schaaltje met een laag calcium PSS. Een deel van het bindweefsel dat werd gehecht werd ook ontleed samen met MCA met behulp van de lente schaar en Tang om schade aan MCA te voorkomen tijdens het isolement. Voorzichtig, bindweefsel werd ook verwijderd, en de ontleed MCA was klaar om over te dragen aan de myograph. MCA werd gemonteerd op de canules en vastgebonden met behulp van hechting knopen aan beide uiteinden van de canules in de myograph. In Figuur 1bwordt een schematische weergave van een typische microelektrode impalement methode Setup getoond. Een microelektrode gevuld met 3 M KCl werd aangesloten op de elektrometer via een houder in de sonde. Kanaal uitgang van de elektrometer werd aangesloten op een analoog ingangskanaal van een digitizer met behulp van een BNC-BNC-kabel. Digitizer output werd verder aangesloten op een oscilloscoop om het signaal in de opname-software te visualiseren. De grond is vastgesteld met behulp van een AgCl pellet draad die werd uitgebreid van het chassis van elektrometer naar de bad-oplossing in de myograph. Ten slotte werden digitale sporen gevisualiseerd in de opname software op de computer monitor.
Het MCA werd vervolgens uitgebroed in vers bereide warme PSS en werd onder druk gezet tot 60 mmHg. Alleen schepen die Toon krijgen werden gebruikt voor Vm opname. Nadat het schip significante Toon kreeg, werd de microelektrode vooruitgegaan in de schipmuur. Arteriële diameter en inpalement van de slagader werden gevisualiseerd met behulp van video microscopie. De impalement wordt als succesvol beschouwd wanneer er een snelle afbuiging aan negatieve waarden is, is Vm stabiel voor ≥ 30 s, en de voltage terugkeert abrupt aan 0 MV na verwijdering van de elektrode zoals die in Figuur 212,15wordt getoond. Onze resultaten suggereren dat, in een MCA dat onder druk staat tot 60 mmHg, de Vm is ~-43,2 ± 2,9 mv.
Na een succesvolle inpalement en Vm stabilisatie, de geneesmiddelen die de vm veranderen waren doorbloede in het bad en veranderingen in de vm werden opgenomen. We gebruikten 20 mM KCl te depolariseren en 20 µ M NS1619, een synthetische grote geleiding kaliumkanaal opener, om het membraan te hyperpolarize. Onze resultaten suggereren dat de doorbloeding van de kamer met KCl depolariseren het membraan door ~ 5,8 ± 0,18 mV. Aan de andere kant, doorbloeding met NS1619 hyperpolarized het membraan door ~ 3,8 ± 0,4 mV.
Figuur 1: een illustratie van de isolatie van de middelste hersen slagaders en de opname van membraanpotentiaal met behulpvan microelektrode impalement methode. (A) met behulp van de lente schaar, snijd de hersenen of bindweefsel langs de stippellijnen. Breng en monteer het MCA tussen de twee glazen canules en bevestig het met behulp van hechtingen in de myograph kamer gevuld met PSS. (B) een microelektrode gevuld met 3 M KCl wordt ingebracht in de houder en is aangesloten op de sonde. Veranderingen in transmembraan potentiële reizen van de sonde naar een elektrometer en aan de digitizer via een BNC-kabel (BNC-kabel is aangesloten vanaf kanaal uitgang van elektrometer en een analoge ingang van een digitizer). Het gedigitaliseerde potentieel wordt gezien in de opname software op de monitor. De grond is vastgesteld met behulp van een AgCl pellet draad aangesloten van de elektrometer aan de bad-oplossing in de myograph. MCA = middelste hersen slagader; PSS = fysiologische zoutoplossing; AgCl = zilverchloride. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: opname van membraanpotentiaal met behulp van microelektrode impalement methode van gecanuleerde middelste cerebrale slagaders. Representatief spoor van Vm. De impalement wordt beschouwd als succesvol als er een abrupte afbuiging aan negatieve waarden op elektrode ingang is, is Vm stabiel voor ≥ 30 s, en de voltage terugkeert abrupt aan 0 MV na verwijdering van de elektrode. De X-as vertegenwoordigt de tijd en de Y-as staat voor het membraanpotentiaal. De stippellijn vertegenwoordigt de gecorrigeerde basis voor de inlichting van het schip. SEC = seconden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: opname van veranderingen in het membraanpotentiaal met behulp van microelektrode impalement methode wanneer vaartuigen worden blootgesteld aan vasoactieve agenten. Vm werd opgenomen met behulp van microelektrode impalement methode van gecanuleerde middelste cerebrale slagaders voor en na de blootstelling aan vasoactieve agenten. Sample Trace vertegenwoordigt (a) depolarisatie in reactie op 20 mm KCl en (B) hyperpolarisatie in reactie op 20 µ m NS1619 — een groot geleidings kaliumkanaal agonist. (C) Samenvattend staafdiagram van de veranderingen in Vm vóór en na toepassing van KCl en NS1619. De gestippelde lijn vertegenwoordigt het rusten Vm. Het aantal in de haakjes vertegenwoordigt het aantal schepen dat in de studie wordt gebruikt. Merk op dat Vm Baseline bereikt zodra het medicijn wordt uitgewassen. Foutbalk staat voor de standaardfout van het gemiddelde. SEC = seconden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Instellingen van elektrometer voor het meten van elektrode weerstand | |
| Meter ingang | Kanaal A of B |
| Positie knevel | Inch |
| Meter bereik | Toggle naar 200 mV |
| Elektrode | In het bad |
| Modus | Werken aan elektrode test |
| Meter indicatie | 1 mV/MΩ |
Tabel 1: instellingen van elektrometer om de elektrode weerstand te meten.
| Chemische stoffen | laag calcium PSS mM | Normale PSS mM | Bedrijf | Catalogus | |
| 1 | Nacl | 119,00 | 119,00 | Sigma | S7653 |
| 2 | Kcl | 4,70 | 4,70 | Sigma | P4504 |
| 3 | MgSO4 | 1,17 | 1,17 | Sigma | M7506 |
| 4 | CaCl2 | 0,05 | 1,60 | Sigma | C3881 |
| 5 | HEPES | 5,00 | 5,00 | Sigma | H7006 |
| 6 | Glucose | 10,00 | 10,00 | Sigma | G7021 |
| 7 | NaH2po4 | 1,18 | 1,18 | Sigma | S0751 |
| 8 | NaHCO3 | 18,00 | 18,00 | Sigma | S5761 |
| pH: 7,4 | pH: 7,4 |
Tabel 2: reagentia gebruikt bij de bereiding van lage calcium en normale fysiologische zoutoplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel bevat de nodige stappen op het gebruik van een scherpe microelektrode impalement methode om Vm record van een gecanuleerde schip voorbereiding. Deze methode wordt veel gebruikt, en biedt een hoge kwaliteit, consistente opnames van Vm dat antwoord op een breed scala van experimentele vragen.
Sommige kritieke overwegingen en stappen voor probleemoplossing worden hier beschreven om het succes van de methode te garanderen. De kwaliteit van de micro-elektrode (de scherpte en weerstand) en het cellulaire proces doordringt invloed op de stabiliteit en nauwkeurigheid van Vm. Als het signaal continu drijft of boven of onder het opname bereik van de versterker staat, is het zeer waarschijnlijk dat de elektrode geblokkeerd is of dat de tip kapot is. Als de inpalement is slechts gedeeltelijk, onvoldoende, of schade aan de cel, de opgenomen potentiële klimt terug naar 0 mV resulteert in een instabiel signaal of geen signaal. In sommige gevallen kan de inhoud van de cel ook blokkeren de zeer hoge weerstand elektrode. Al deze problemen kunnen worden overwonnen door alleen het vervangen van de elektrode met een nieuwe.
Voor succesvolle impalement, moet men ervoor zorgen dat de totale weerstand van het celmembraan ongewijzigd is, en het gemeten membraan potentieel is stabiel zonder lekken tussen de elektrode en het membraan. Het is essentieel dat de elektrode is gevorderd naar de cel door een stabiele micromanipulator. Wanneer gevorderd om binnen een paar micrometers van de cel, de tip potentiaal zal veranderen resulteert in een lichte afbuiging in de gedetecteerde spanning. Om beschadiging van het uiteinde van de elektrode of het uitrekken van het celmembraan te voorkomen, is een snelle vooruitgang van de elektrode vereist. Succesvolle impalement wordt gekenmerkt door een snelle daling van het membraan potentieel, gevolgd door een stabilisatie rond het rust potentieel van het membraan. Als de potentiële lezing fluctueert, is het mogelijk dat het uiteinde van de elektrode heeft verstoord het membraan waardoor natrium te lekken in de cel en kalium te lekken uit de cel, wat resulteert in progressieve depolarisatie. Een ander probleem in deze methode is dat Junction potentials en elektrode Tip potentialen kan een onnodige artefact toe te voegen aan de Vm opname. Verbindingsmogelijkheden treden op wanneer verschillende geleiders in contact komen. Er zijn twee verschillende types van verbindings potentieel, vloeibaar-metaal, en vloeistof-vloeistof. Vloeibare-metalen verbindingen worden gevormd wanneer de punt van de sonde contact met de elektrolyt in de micropipet. Vloeibare-vloeibare verbindingen, ook wel Liquid Junction potentiaal, optreden wanneer twee oplossingen van verschillende concentraties in contact komen. De verspreiding van de ionen tussen de oplossingen draagt tot de ontwikkeling van het potentieel bij. Trouwens, de eigenschappen van de glazen elektrode Tip interactie met vloeistof kan genereren Tip potentials. Om de verbinding evenals uiteinde potentieel te minimaliseren, zou het nul nemen van het gemeten potentieel in het bad de ongewenste bias kunnen verminderen. Tijdens impalement, kan men niet uitsluiten dat de mogelijkheid dat endothelial, in plaats van gladde spieren, kon Vm per ongeluk worden bemonsterd in sommige experimenten. Echter, studies geven aan dat de endoteel en VSMC lagen zijn elektrisch gekoppeld in kleine arterioles en vertonen soortgelijke Vm reacties23.
Uiteindelijk zijn drie stappen in dit proces van cruciaal belang voor het bereiken van succesvolle opnames. Ten eerste moeten vaartuigen op passende wijze worden voorbereid, zodat ze niet in het proces worden beschadigd. Ten tweede, moeten de micro-elektroden aan de juiste elektro eigenschappen worden getrokken. Ten slotte, snelle inpalement van het membraan zonder het breken van de tip is van cruciaal belang voor nauwkeurige resultaten. De onderzoeker moet begrijpen elektrofysiologisch, hoe levensvatbare microelektrodes te creëren, en hoe het opzetten en gebruiken van een elektrometer.
Ondanks het belang ervan, deze methode heeft verschillende beperkingen. Ten eerste, de totale kosten voor het aanschaffen van alle apparatuur is hoog (~ $30-40000). Ten tweede zijn er verse vaartuigen nodig voor al deze experimenten; Vandaar dat een dier is euthanized voor elk experiment, toe te voegen aan de totale kosten. Derde, dissectie van cerebrale slagaders, canulatie van de schepen is vervelend, duur en heeft een leercurve. Ten vierde, de voorbereiding van microelektrodes, inpalement, en de opname Vm vereist een grondige kennis van de elektrofysiologisch. Tot slot, om vast te stellen deze set-up in het lab vereist toegewijd personeel, tijd en moeite.
Vm is een essentieel elektrofysiologische bezit dat de vasculaire Toon en zo bloedstroom aan een orgaan bepaalt. Vm zou door verscheidene vasoactieve chemische producten kunnen worden veranderd die van neuronen, endoteel en bloedcomponenten worden vrijgegeven. Terwijl vasoconstrictoren depolariseren het membraan, dilatators hyperpolarize het membraan. Verscheidene proteïnen met inbegrip van K+ kanalen, VGCC, het kalium ATPase van het natrium, CA2 + ATPase, cl- kanalen, opslag-gewerkt en de rek kanalen regelen Vm. Veranderingen in een van deze eiwitten in ziekte omstandigheden zou kunnen veranderen Vm en dus vasculaire Toon en de bloedstroom. De microelektrode impalement methode is nuttig om het rusten evenals veranderingen in Vm in antwoord op vasoconstrictoren en dilatators te registreren. Dus, deze methode kan betrouwbaar worden gebruikt om te begrijpen normale en veranderde Vm geassocieerd met ziekte, en kan nuttig zijn bij de ontwikkeling van farmacologische agentia ontworpen om te moduleren vm, vasculaire Toon en de bloedstroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd deels ondersteund door subsidies van het intramurale support Research Program (IRSP) van UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) uitgereikt aan Anna Pabbidi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
- Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
- Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
- Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
- Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
- Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
- Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
- Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
- Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
- Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
- Coca, A., Garay, R. Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , Taylor & Francis. (1993).
- Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
- Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
- Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
- Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
- Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
- Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
- Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
- Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
- Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
- Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
- Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
- Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T.
