Summary
El objetivo principal de este artículo es proporcionar detalles de cómo registrar el potencial de membrana (Vm) de la arteria cerebral media utilizando el método de empallamiento de microelectrodos. La arteria cerebral media canulada se equilibra para obtener tono miogénico, y la pared del vaso se empala usando microelectrodos de alta resistencia.
Abstract
El potencial de membrana (Vm) de las células musculares lisas vasculares determina el tono de los vasos y, por lo tanto, el flujo sanguíneo a un órgano. Los cambios en la expresión y función de los canales iónicos y las bombas electrogénicas que regulan el Vm en condiciones de enfermedad podrían alterar potencialmente la Vm,el tono vascular y el flujo sanguíneo. Por lo tanto, una comprensión básica de la electrofisiología y los métodos necesarios para registrar con precisión Vm en estados sanos y enfermos son esenciales. Este método permitirá modular Vm utilizando diferentes agentes farmacológicos para restaurar Vm. Aunque existen varios métodos, cada uno con sus ventajas y desventajas, este artículo proporciona protocolos para registrar Vm de vasos de resistencia cannulados como la arteria cerebral media utilizando el método de empalado de microelectrodos. Las arterias cerebrales medias pueden obtener tono miogénico en una cámara de miógrafo, y la pared del vaso se empaló utilizando microelectrodos de alta resistencia. La señal Vm se recoge a través de un electrómetro, se digitaliza y se analiza. Este método proporciona una lectura precisa del Vm de la pared de un recipiente sin dañar las células y sin cambiar la resistencia de la membrana.
Introduction
El potencial de membrana (Vm) de una célula se refiere a la diferencia relativa de carga iónica a través de la membrana plasmática y la permeabilidad relativa de la membrana a estos iones. El Vm es generado por la distribución diferencial de iones y es mantenido por canales iónicos y bombas. Los canales de iones como K+, Na+, y Clcontribuyen sustancialmente al resto de Vm. Las células musculares lisas vasculares (VSCM) expresan más de cuatro tipos diferentes de K+ canales1, dos tipos de canales Ca2+ con voltaje cerrado (VGCC)2, más de dos tipos de Cl- canales3, 4 , 5, Ca2+ canales6accionados por almacén , canales catión7 activados por estiramiento7,8y bombas electrogénicas ATPass de sodio-potasio9 en sus membranas plasmáticas, todas las cuales pueden ser implicados en la regulación de Vm.
El Vm de los VSMC depende de la presión del lumen. En recipientes no presurizados, Vm varía de -50 a -65 mV, sin embargo, en segmentos arteriales presurizados, Vm oscila entre -37 y -47 mV10. La elevación de la presión intravascular hace que los VSCM despolarizen11, disminuye el umbral de apertura del VGCC y aumenta la afluencia de calcio contribuyendo al desarrollo del tono miogénico12. Por el contrario, en los vasos pasivos o no presurizados, la hiperpolarización de la membrana, debido a la alta actividad del canal K+, evitará que el VGCC se abra, lo que resulta en una entrada limitada de calcio y una disminución del calcio intracelular, contribuyendo a tono vascular13. Por lo tanto, Vm debido a los cambios en la presión lumen parece desempeñar un papel esencial en el desarrollo del tono vascular, y tanto los canales VGCC y K+ juegan un papel crucial en la regulación de Vm.
Vm varía según el tipo de recipiente y la especie. Vm es de -54 x 1,3 mV en tiras arteriales mesentéricas superiores de conejillo de indias14, -45 x 1 mV en las arterias cerebrales medias de rata a 60 mmHg de presión lumen12,y -35 x 1 mV en arterias parénquimas de rata a 40 mmHg de presión de lúmenes15. El Vm en reposo registrado en el músculo linfático de rata sin estirar es de -48 a 2 mV16. Vm de VSMCs cerebrales es más negativo que en las arterias periféricas. En comparación, se informó que las arterias cerebrales medias felinas tienen un Vm de aproximadamente -70 mV, mientras que las arterias mesentéricas y coronarias fueron reportadas a -49 y -58 mV, respectivamente17,18. Las diferencias en el Vm entre los lechos vasculares pueden reflejar las diferencias en la expresión y función de los canales iónicos y las bombas electrogénicas de sodio-potasio.
Los aumentos y disminuciones en Vm se conocen como despolarización de membrana e hiperpolarización, respectivamente. Estas alteraciones en Vm juegan un papel central en muchos procesos fisiológicos, incluyendo gating de canal iónico, señalización celular, contracción muscular, y propagación potencial de acción. A una presión fija, muchos compuestos vasodilatadores endógenos y sintéticos que activan los canales K+ causan hiperpolarización de la membrana, lo que resulta en vasodilatación1,13. Por el contrario, la despolarización sostenida de la membrana es vital enla vasoconstricción 19 inducida por agonistas o mediada por receptores. Vm es una variable crítica que no sólo regula la afluencia Ca2+ a través de VGCC13, sino que también influye en la liberación de Ca2+ de las tiendas internas20,21 y Ca2+-sensibilidad de el aparato contractilo22.
Si bien existen varios métodos para registrar Vm de diferentes tipos de células, los datos recopilados del método de empallado de microelectrodos de los recipientes cannulados parecen ser más fisiológicos que los datos obtenidos de VSMC aislados. Cuando se registra desde VSMC aislado utilizando métodos de abrazadera de corriente, Vm se ve como hiperpolarizaciones transitorias espontáneas en VSMc24. Los VSMC aislados no están en el sincitio, y los cambios en la resistencia de la serie pueden contribuir al comportamiento oscilatorio de Vm. Por otro lado, el comportamiento oscilatorio no se observa cuando se registra Vm de vasos intactos, probablemente debido al contacto celular entre VSMCs que están en sincitio en la arteria y se suman en todo el recipiente que conduce a un Vm estable 24. Por lo tanto, la medición de Vm de recipientes presurizados utilizando la técnica estándar de empalacimiento de microelectrodos es relativamente cercana a las condiciones fisiológicas.
La grabación de Vm de los vasos cannulados podría proporcionar información vital, ya que el Vm de VSMCs que están en sincitio es uno de los principales determinantes del tono vascular y el flujo sanguíneo, y la modulación del Vm podría proporcionar una manera de dilatar o restringir los vasos sanguíneos. Por lo tanto, es esencial entender la metodología implicada en la grabación de Vm. Este artículo describe el registro intracelular de Vm de las arterias cerebrales medias cannuadas (MCA) utilizando un método de empallamiento de microelectrodos. Este protocolo describirá cómo preparar MCA, microelectrodos, configurar el electrómetro y realizar el método de empalamiento para grabar Vm. Además, se discuten los datos representativos, los problemas comunes que se encontraron al usar este método y los posibles problemas.
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Protocol
Las ratas macho fueron alojados en el Centro de Cuidado Animal de la UMMC, que está aprobado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado Animal de Laboratorio (AAALAC). Los animales tuvieron libre acceso a alimentos y agua durante todo el estudio. Los animales se mantuvieron en un ambiente controlado con una temperatura de 24oC, niveles de humedad del 60-80% y ciclos de luz/oscuridad de 12 h. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la UMMC.
1. Preparación de equipos
- Coloque un amplificador de electrometro diferencial de doble canal (consulte la Tabla de materiales)cerca de la cámara del recipiente y en la ubicación deseada.
- Conecte la salida del canal del amplificador A o B a la entrada de canal del digitalizador con un cable BNC-BNC.
- Monte la sonda en el micromanipulador y colóquela cerca del microscopio y del miógrafo. La configuración de grabación debe instalarse en una mesa sin vibraciones.
- Coloque las perillas y los interruptores en la parte frontal del amplificador en las posiciones que lo configuran para este experimento como se describe en el manual.
- Conecte el suelo del baño a la tierra del circuito del amplificador a través de un electrodo adecuado. Del mismo modo, asegúrese de que la jaula esté conectada a tierra al chasis del amplificador.
2. Preparación de Microelectrodos y Montaje
-
Utilice microelectrodos de vidrio de borosilicato (ver la Tabla de Materiales) y tire de la punta de vidrio para tener un cónico de 8-10 mm, diámetro de <1 m y resistencia de 80-120 M cuando se llena con 3 M KCl.
- Utilice un tirador estándar para lograr un cono gradual corto utilizando los siguientes ajustes: calor 650; velocidad 20; tirar 25; tiempo 250 y bucle dos veces para mayores resistencias y puntas más pequeñas. Consulte la Tabla de materiales, ya que los ajustes son específicos del instrumento.
NOTA: Los diámetros de la punta <1 m causarán un daño mínimo a la celda cuando se empala.
- Utilice un tirador estándar para lograr un cono gradual corto utilizando los siguientes ajustes: calor 650; velocidad 20; tirar 25; tiempo 250 y bucle dos veces para mayores resistencias y puntas más pequeñas. Consulte la Tabla de materiales, ya que los ajustes son específicos del instrumento.
-
Llene el microelectrodo con 3 M DeKCl utilizando una jeringa de microfibra (ver la Tabla de Materiales).
- Tire lentamente del émbolo de la jeringa de microfibra hacia arriba mientras inyecta el KCl de 3 M en el microelectrodo para permitir que el fluido se llene y para evitar la formación de burbujas de aire dentro del microelectrodo.
- Llene el microelectrodo hasta que esté lleno y asegúrese de que no haya burbujas de aire antes de colocarlo en el soporte del microelectrodo. Si hay burbujas, toque suavemente el microelectrodo con un dedo para eliminar las burbujas.
- Ejerciendo cuidado, empuje firmemente el vástago del electrodo en el soporte a través del agujero perforado. Si hay exceso de líquido, retírelo con un pañuelo de papel.
- Conecte el conjunto del soporte del electrodo a la sonda del amplificador. Realice una prueba de electrodos, ajuste el desplazamiento de entrada, verifique la configuración cero y compruebe la fuga de entrada de la sonda según el manual del amplificador.
- Mida la resistencia de los electrodos mediante una prueba de electrodos como se muestra en la Tabla1.
- Tenga en cuenta que un electrodo de trabajo muestra un desplazamiento de voltaje de CC positivo de 1 mV/M en la salida del canal. Por otro lado, si aparece una tensión grande en la salida del canal y en el medidor, esto indica un electrodo bloqueado o roto.
- Abra el software de grabación, asigne un nombre al archivo y guárdelo para su análisis futuro en un software de almacenamiento.
3. Aislamiento y cannulación de la arteria cerebral media
-
Preparar los reactivos.
- Preparar la solución de sal fisiológica (PSS) normal y baja en calcio como se describe en la Tabla2.
-
Preparen el miógrafo.
- Enjuague la cámara de miógrafo (ver la Tabla de Materiales)con agua destilada varias veces para mantenerla libre de residuos. Cargue la cámara con 5 ml de PSS normal.
- Llene ambas cánulas de vidrio con PSS normal filtrada utilizando una jeringa de 5-10 ml. Llene cuidadosamente toda la cánula y el tubo adjunto sin introducir burbujas de aire.
- Preparar dos suturas de nylon monofilamento (10-0, 0.02 mm) con medio nudo cada una usando fórceps contundentes.
- Coloque los nudos de sutura parcialmente cerrados en ambas cánulas ligeramente lejos de la punta usando fórceps de disección bajo un microscopio de disección. Más tarde estos nudos se deslizarán y se atarán cuidadosamente en los extremos arteriales canulados para asegurar el vaso.
-
Aísle y cinrara la arteria cerebral media.
- Inducir anestesia profunda en una rata Sprague Dawley mediante el uso de 2-4% de isoflurano inhalado.
- Decapitar a la rata usando guillotina bajo anestesia profunda.
- Retire cuidadosamente el cráneo con un cortador de huesos y una tijera.
- Retire el cerebro del cráneo y colóquelo en 5 ml de PSS bajo en calcio sobre hielo.
- Identificar y diseccionar un segmento no ramificado de la arteria cerebral media de rata (MCA) con un diámetro interno de 100–200 m del cerebro usando tijeras de resorte y fórceps.
- Monte el MCA en las cánulas de vidrio con fórceps finos y asegúrelo apretando las suturas en el miógrafo que contiene PSS normal.
- Cierre la cánula distal de modo que no haya flujo dentro de los MCA.
- Conecte la pipeta de entrada a un depósito que sostenga PSS para permitir el control de la presión intraluminal que se controlará con un transductor de presión en línea.
- Visualice los MCA cannulados utilizando una cámara de dispositivo acoplada por carga (consulte la Tabla de materiales)montada en un microscopio invertido y un software de imágenes.
- Establezca la longitud axial del MCA en una longitud aproximada donde no debería aparecer ni rígida ni flácida.
- Equilibrar la solución de baño con O2 (95%) y CO2 (5%) a 37 oC para proporcionar una oxigenación adecuada, temperatura y mantener el pH a 7,4.
-
Empalar (penetrar en la membrana plasmática celular) las células musculares lisas vasculares.
- Conecte el electrodo de tierra y manténgalo sumergido en el PSS del miógrafo.
- Ilumina la cámara del recipiente y mira a través del microscopio para visualizar la punta del microelectrodo en la solución de baño.
NOTA: Alternativamente, se puede visualizar el MCA y el microelectrodo en un ordenador que tiene un software de imágenes. - Utilice los controles del micromanipulador para mover la punta del microelectrodo cerca de la pared externa del vaso sanguíneo. El micromanipulador y la punta del microelectrodo deben estar en una posición estable en relación con el tejido.
NOTA: Antes de comenzar los experimentos, confirme que el voltaje de la membrana se ha estabilizado. Si la tensión medida es inestable, la conexión entre el electrodo y la célula no está sellada, lo que indica una fuga. - Comience la grabación.
- Mueva lentamente la punta del microelectrodo hacia el recipiente, apuntando hacia el centro del recipiente utilizando el curso o el control fino del micromanipulador.
NOTA: Ocasionalmente, se puede observar una pequeña desviación en la grabación cuando la punta del microelectrodo entra en contacto con una membrana de fibra muscular. - Cuando la punta se acerca al recipiente, avance el electrodo hacia adelante en un movimiento rápido utilizando el micromanipulador para empalar la membrana del músculo.
- En este punto, uno puede comenzar a observar los cambios en Vm que se están registrando. No toque el micromanipulador cuando el microelectrodo empalse la membrana de la célula.
NOTA: La diferencia de tensión entre el electrodo de grabación y de referencia disminuye de 0 mV a entre -40 mV y -75 mV dependiendo del nivel de presión intravascular u otros estímulos excitatorios o inhibitorios. Estas lecturas caracterizan la diferencia potencial transmembrana de la célula actual. - Realizar múltiples empalamientos en un solo recipiente en diferentes áreas del recipiente sin dañar los VSMCs con el fin de obtener mediciones precisas.
- Después de la grabación, utilice el manipulador para eliminar el microelectrodo en un movimiento rápido.
- Detenga la grabación y guarde los archivos de datos para su posterior análisis.
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Representative Results
El método presentado se puede utilizar de forma fiable para grabar Vm en recipientes canulados. En la Figura 1Ase presenta un breve procedimiento que describe cómo aislar la MCA del cerebro. Después de separar el cerebro del cráneo, el MCA fue diseccionado y colocado en una placa de Petri que contiene PSS de calcio bajo. Parte del tejido conectivo que se unía también se diseccionó junto con MCA usando tijeras de resorte y fórceps para evitar daños a MCA durante el aislamiento. Con cuidado, también se extirpó el tejido conectivo, y el MCA diseccionado estaba listo para transferirse al miógrafo. MCA fue montado en las cánulas y atado usando nudos de sutura en ambos extremos de las cánulas en el miógrafo. En la Figura 1Bse muestra una representación esquemática de una configuración típica del método de empalacimiento de microelectrodos. Un microelectrodo lleno de 3 M KCl se conectó al electrómetro a través de un soporte en la sonda. La salida de canal del electrómetro se conectó a un canal de entrada analógico de un digitalizador mediante un cable BNC-BNC. La salida del digitalizador se conectó aún más a un osciloscopio para visualizar la señal en el software de grabación. El suelo se establece utilizando un cable de pellet AgCl que se extendió desde el chasis del electrómetro hasta la solución de baño en el miógrafo. Finalmente, los rastros digitales se visualizaron en el software de grabación en el monitor del ordenador.
El MCA fue entonces incubado en PSS caliente recién preparado y fue presurizado a 60 mmHg. Sólo se utilizaron recipientes que ganan tono para la grabación de V m. Después de que el recipiente ganó un tono significativo, el microelectrodo fue avanzado en la pared del recipiente. El diámetro arterial y el empalamiento de la arteria se visualizaron mediante microscopía de vídeo. El impalamiento se considera exitoso cuando hay una rápida desviación a los valores negativos, Vm es estable para 30 s, y la tensión vuelve abruptamente a 0 mV al retirar el electrodo como se muestra en la Figura 212,15. Nuestros resultados sugieren que, en un MCA que se presuriza a 60 mmHg, el Vm es de -43,2 x 2,9 mV.
Después de un éxito de empalamiento y estabilización V m, los fármacos que cambian el Vm fueron perfundidos en el baño y se registraron cambios en el Vm. Usamos 20 mM de KCl para despolarizar y 20 M NS1619, un abridor sintético de canal de potasio de gran conductancia, para hiperpolarizar la membrana. Nuestros resultados sugieren que la perfusión de la cámara con KCl despolarizó la membrana en 5,8 x 0,18 mV. Por otro lado, la perfusión con NS1619 hiperpolarizó la membrana en 3,8 x 0,4 mV.
Figura 1: Ilustración del aislamiento de las arterias cerebrales medias y registro del potencial de la membrana medianteel método de empallamiento de microelectrodos. (A) Con tijeras de resorte, corte el cerebro o el tejido conectivo a lo largo de las líneas punteadas. Transfiera y monte el MCA entre las dos cánulas de vidrio y fíjelo usando suturas en la cámara de miógrafo llena de PSS. (B) Se inserta un microelectrodo lleno de 3 M KCl en el soporte y se conecta a la sonda. Los cambios en el potencial de la transmembrana viajan de la sonda a un electrómetro y al digitalizador a través de un cable BNC (el cable BNC está conectado desde la salida de canal del electrómetro y a una entrada analógica de un digitalizador). El potencial digitalizado se ve en el software de grabación en el monitor. El suelo se establece utilizando un cable de pellet AgCl conectado desde el electrometroa a la solución de baño en el miógrafo. MCA - arteria cerebral media; PSS - solución fisiológica de sal; AgCl - cloruro de plata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Registro del potencial de membrana utilizando el método de empalamiento de microelectrodos a partir de arterias cerebrales medias cannuladas. Rastro representativo de Vm. El impalamiento se considera exitoso si hay una desviación abrupta a los valores negativos en la entrada del electrodo, Vm es estable para 30 s, y el voltaje vuelve abruptamente a 0 mV al retirar el electrodo. El eje X representa el tiempo, y el eje Y representa el potencial de membrana. La línea punteada representa la línea base ajustada antes del empalamiento del recipiente. Sec segundos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Registro de cambios en el potencial de membrana utilizando el método de empalacimiento de microelectrodos cuando los vasos están expuestos a agentes vasoactivos. Vm se registró utilizando el método de empalamiento de microelectrodos a partir de arterias cerebrales medias cannuladas antes y después de la exposición a agentes vasoactivos. La traza demuestra representa (A ) despolarización en respuesta a 20 mM de Hiperpolarización KCl y (B) en respuesta a 20 M NS1619, un agonista del canal de potasio de gran conductancia. (C) Gráfico de barras de resumen de los cambios en Vm antes y después de la aplicación de KCl y NS1619. La línea punteada representa el silencio Vm. El número entre paréntesis representa el número de vasos utilizados en el estudio. Tenga en cuenta que Vm alcanzó la línea de base tan pronto como el medicamento se lava. La barra de errores representa el error estándar de la media. Sec segundos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ajustes del electrómetro para medir la resistencia de los electrodos | |
| Entrada del medidor | Canal A o B |
| Alternar posición | En |
| Rango de medidores | alternar a 200 mV |
| Electrodo | En el baño |
| Modo | Operar a la prueba de electrodo |
| Indicación del medidor | 1 mV/M |
Tabla 1: Ajustes del electrómetro para medir la resistencia del electrodo.
| Productos químicos | PSS mM de calcio bajo | PSS mM normal | Empresa | Catálogo | |
| 1 | Nacl | 119.00 | 119.00 | Sigma | S7653 |
| 2 | Kcl | 4.70 | 4.70 | Sigma | P4504 |
| 3 | MgSO4 | 1.17 | 1.17 | Sigma | M7506 |
| 4 | CaCl2 | 0.05 | 1.60 | Sigma | C3881 |
| 5 | HEPES | 5.00 | 5.00 | Sigma | H7006 |
| 6 | Glucosa | 10.00 | 10.00 | Sigma | G7021 |
| 7 | NaH2PO4 | 1.18 | 1.18 | Sigma | S0751 |
| 8 | NaHCO3 | 18.00 | 18.00 | Sigma | S5761 |
| pH: 7,4 | pH: 7,4 |
Tabla 2: Reactivos utilizados en la preparación de baja solución de calcio y sal fisiológica normal.
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Discussion
Este artículo proporciona los pasos necesarios sobre cómo utilizar un método de empalamiento de microelectrodos nítidos para registrar Vm desde la preparación de un recipiente cannulado. Este método es ampliamente utilizado, y ofrece grabaciones consistentes y de alta calidad de Vm que responden a una amplia gama de preguntas experimentales.
Algunas consideraciones críticas y pasos de solución de problemas se describen aquí para garantizar el éxito del método. La calidad del microelectrodo (su nitidez y resistencia) y el proceso celularque penetra influyen en la estabilidad y precisión de V m. Si la señal se desvía continuamente o está por encima o por debajo del rango de grabación del amplificador, lo más probable es que el electrodo esté bloqueado o que la punta esté rota. Si el empalamiento es sólo parcial, insuficiente o daña la célula, el potencial registrado vuelve a 0 mV resultando en una señal inestable o ninguna señal. En algunos casos, el contenido de la célula también puede bloquear el electrodo de muy alta resistencia. Todos estos problemas se pueden superar simplemente reemplazando el electrodo por uno nuevo.
Para un empalamiento exitoso, uno debe asegurarse de que la resistencia total de la membrana celular es inalterada, y el potencial de membrana medido es estable sin fugas entre el electrodo y la membrana. Es fundamental que el electrodo esté avanzado hacia la célula mediante un micromanipulador estable. Cuando se avanza a unos pocos micrómetros de la célula, el potencial de la punta cambiará resultando en una ligera desviación en la tensión detectada. Para evitar dañar la punta del electrodo o el estiramiento de la membrana celular, se requiere un rápido avance del electrodo. El empalamiento exitoso se caracteriza por una rápida caída en el potencial de la membrana seguida de una estabilización alrededor del potencial de reposo de la membrana. Si la lectura potencial fluctúa, es posible que la punta del electrodo haya interrumpido la membrana causando que el sodio se filtre en la célula y que el potasio se escape de la célula, lo que resulta en una despolarización progresiva. Otro problema en este método es que los potenciales de unión y los potenciales de punta de electrodo pueden agregar un artefacto innecesario a la grabación V m. Los potenciales de unión se producen cuando los diferentes conductores entran en contacto. Existen dos tipos diferentes de potenciales de unión, líquido-metal y líquido-líquido. Las uniones líquido-metálicas se forman cuando la punta de la sonda entra en contacto con el electrolito en el micropipeta. Las uniones líquido-líquido, también llamadas potencial de unión líquida, se producen cuando dos soluciones de diferentes concentraciones entran en contacto. La difusión de los iones entre las soluciones contribuye al desarrollo del potencial. Además, las propiedades de la punta del electrodo de vidrio que interactúa n.o de líquido pueden generar potencialidades en la punta. Para minimizar la unión, así como los potenciales de la punta, poner a cero el potencial medido en el baño podría reducir el sesgo no deseado. Durante el empalamiento, no se puede descartar la posibilidad de que el músculo endotelial, en lugar de suave, Vm podría ser inadvertidamente muestreado en algunos experimentos. Sin embargo, los estudios indican que las capas de endotelio y VSMC están acopladas eléctricamente en pequeñas arterias y exhiben respuestas Vm similares23.
En última instancia, tres pasos en este proceso son críticos para lograr grabaciones exitosas. En primer lugar, los buques deben estar adecuadamente preparados, asegurándose de que no se dañen en el proceso. En segundo lugar, los microelectrodos deben extraerse a las propiedades eléctricas adecuadas. Por último, el empalamiento rápido de la membrana sin romper la punta es crucial para obtener resultados precisos. El investigador debe entender la electrofisiología, cómo crear microelectrodos viables y cómo configurar y utilizar un electrómetro.
A pesar de su importancia, este método tiene varias limitaciones. En primer lugar, el costo agregado para adquirir todo el equipo es alto ($30-40,000). En segundo lugar, se necesitan recipientes frescos para todos estos experimentos; por lo tanto, un animal es eutanasiado para cada experimento, lo que se suma al costo total. En tercer lugar, la disección de las arterias cerebrales, la cannulación de los vasos es tediosa, costosa y tiene una curva de aprendizaje. En cuarto lugar, la preparación de microelectrodos, empalamiento y grabación vm requiere una comprensión profunda de la electrofisiología. Por último, para establecer esta configuración en el laboratorio se requiere personal dedicado, tiempo y esfuerzo.
Vm es una propiedad electrofisiológica esencial que determina el tono vascular y por lo tanto el flujo sanguíneo a un órgano. Vm podría ser alterado por varias sustancias químicas vasoactivas que se liberan de las neuronas, endotelio y componentes de la sangre. Mientras que los vasoconstrictores despolarizan la membrana, los dilatadores hiperpolarizan la membrana. Varias proteínas incluyendo K+ canales, VGCC, potasio sódico ATPase, Ca2 + ATPase, Cl- canales, canales operados en tienda y stretch regulan el Vm. Las alteraciones en cualquiera de estas proteínas en condiciones de la enfermedad podrían alterar potencialmente vm y, por lo tanto, el tono vascular y el flujo sanguíneo. El método de empalacimiento de microelectrodos es útil para registrar el descanso, así como los cambios en Vm en respuesta a vasoconstrictores y dilatadores. Por lo tanto, este método podría ser utilizado de forma fiable para entender normal y alterado Vm asociado con la enfermedad, y puede ser útil en el desarrollo de agentes farmacológicos diseñados para modular Vm,tono vascular y flujo sanguíneo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Programa de Investigación de Apoyo Intramural (IRSP) de la UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) otorgada a Mallikarjuna R. Pabbidi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
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