Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

doi: 10.3791/59079 Published: March 23, 2020

Summary

نحن نقدم طريقة لتنقية والكشف وتحديد الببتيدات diGly التي تنشأ من البروتينات في كل مكان من عينات بيولوجية معقدة. الطريقة المعروضة قابلة للاستنساخ وقوية وتتفوق على الأساليب المنشورة فيما يتعلق بمستوى عمق تحليل كل يوم.

Abstract

التعديل بعد التحويل ية للبروتينات بواسطة البروتين الصغير في كلمكانفيا تشارك في العديد من الأحداث الخلوية. بعد الهضم الtryptic من البروتينات في كل مكان، يمكن استخدام الببتيدات مع بقايا diglycine مترافقة مع مجموعة أمينية إبسيلون من الليسين ('K-а-diglycine' أو ببساطة 'diGly') لتتبع موقع التعديل الأصلي. وقد أدى التنقية المناعية الفعالة من الببتيدات diGly جنبا إلى جنب مع الكشف الحساس عن طريق قياس الطيف الكتلي إلى زيادة كبيرة في عدد مواقع التعامي التي تم تحديدها حتى الآن. لقد قمنا بإجراء العديد من التحسينات على سير العمل هذا ، بما في ذلك تجزئة المرحلة العكسية عالية في عدم الاتصال بـ pH من الببتيدات قبل إجراء الإثراء ، وإدراج إعدادات تجزئة الببتيد الأكثر تقدمًا في متعدد القطب لتوجيه الأيون. أيضا، تنظيف أكثر كفاءة من العينة باستخدام المكونات القائمة على مرشح من أجل الاحتفاظ حبات الأجسام المضادة يؤدي إلى مزيد من التحديد للببتيدات diGly. هذه التحسينات تؤدي إلى الكشف الروتيني لأكثر من 23،000 الببتيدات diGly من خلايا سرطان عنق الرحم البشرية (هيلا) التحلل على تثبيط البروتينفي الخلية. نظهر فعالية هذه الاستراتيجية للتحليل المتعمق لمحات كليوموكلوتينوم من عدة أنواع مختلفة من الخلايا وفي عينات الجسم الحي، مثل أنسجة الدماغ. تقدم هذه الدراسة إضافة أصلية إلى صندوق الأدوات لتحليل انتشار البروتين للكشف عن كل يوم في كل مكان خلوي عميق.

Introduction

اقتران ubiquitin إلى البروتينات علامات عليها لتدهور من قبل proteasome وهي عملية حاسمة في البروتوستاس. مجموعة C-المحطة الكاربوكسيلي من ubiquitin يشكل رابطة isopeptide مع مجموعة ليسين من البروتين المستهدف1,2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إرفاق ubiquitin بوحدات ubiquitin الأخرى ، مما يؤدي إلى تشكيل هياكل بوليوبيكوتين متجانسة (أي K48 أو K11) أو متفرعة (أي غير متجانسة أو مختلطة) هياكل البوليوبيكوتين1،3. الوظيفة الأكثر شهرة من ubiquitin هو دوره في تدهور بروتياسومي، بوساطة polyubiquitin K48 المرتبطة. ومع ذلك ، فقد أصبح من الواضح أن كل من أحادية ، وكذلك polyubiquitination تلعب أيضا أدوارا في العديد من العمليات التي هي مستقلة عن تدهور من قبل proteasome. على سبيل المثال، سلاسل K63 المرتبطة لها أدوار غير مُنُهِية في الاتجار داخل الخلايا، وتدهور الليسوسومي، وإشارات الكيناز، واستجابة تلف الحمض النووي,5. الأنواع الستة الأخرى الروابط هي أقل وفرة وأدوارها لا تزال غامضة إلى حد كبير، على الرغم من أن المؤشرات الأولى حول وظائفها في الخلية بدأت تظهر، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى تطوير أدوات جديدة لتمكين الكشف عن الروابط الخاصة6,7.

أصبح قياس الطيف الكتلي أداة لا غنى عنها لتحليل البروتينات وفي الوقت الحاضر يمكن تحديد الآلاف من البروتينات المختلفة من أي مصدر بيولوجي تقريبًا في تجربة واحدة. يتم تقديم طبقة إضافية من التعقيد عن طريق التعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) من البروتينات (على سبيل المثال، الفوسفور، الميثيل، الأسيتيل، وubiquitination) التي يمكن أن تعدل نشاط البروتين. كما أصبح التحديد الواسع النطاق للبروتينات الحاملة لـ PTM ممكناً بسبب التطورات في مجال قياس الطيف الكتلي. إن قياس الببتيدات المنخفض نسبياً والحامل لـ PTMs مقارنة بنظيراتها غير المعدلة يمثل تحدياً تقنياً، وخطوات الإثراء البيوكيميائية ضرورية بشكل عام قبل تحليل قياس الطيف الكتلي. وعلى مدى العقدين الماضيين، تم تطوير عدة أساليب تخصيب محددة مختلفة لتحليل تدابير التخصيب المتعددة الجوانب.

بسبب الأدوار المتعددة الأوجه للبروتين في كل مكان في الخلية ، هناك طلب كبير على تطوير الطرق التحليلية للكشف عن مواقع التعامي على البروتينات8. وقد أدى تطبيق أساليب الطيف الشامل إلى انفجار عدد المواقع المحددة في كل مكان في ذبابة الفاكهة والفأر والإنسان والخميرة البروتينات9،10،1111،12،13،14. وقد تم تقديم خطوة رئيسية من خلال تطوير استراتيجيات الإثراء القائمة على الترسيب المناعي على مستوى الببتيد باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد زخارف بقايا K-а-GG (يشار إليها أيضًا باسم "diglycine" أو "diGly"). يتم إنتاج هذه الببتيدات diGly عند هضم البروتينات في كل مكان باستخدام التربسين كما البروتياز15,16.

هنا ، نقدم سير عمل محسن لإثراء الببتيدات diGly باستخدام الببتيدات المناعية والكشف اللاحق عن طريق قياس الطيف الكتلي Orbitrap. باستخدام مزيج من عدة تعديلات على سير العمل الحالي ، وخاصة في إعداد العينة ومراحل قياس الطيف الكتلي ، يمكننا الآن تحديد أكثر من 23000 ببتيد diGly بشكل روتيني من عينة واحدة من خلايا HeLa تعامل مع بروتيجسوم مثبط و ~ 10،000 من خلايا هيلا غير المعالجة. لقد طبقنا هذا البروتوكول على الليسات من كل من تسمية النظائر غير المسماة ومستقرة مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (SILAC) المسماة خلايا هيلا وكذلك إلى عينات داخلية مثل أنسجة الدماغ.

يقدم سير العمل هذا إضافة قيمة إلى ذخيرة أدوات لتحليل مواقع الكلى من أجل الكشف عن الكلوتينيوم العميق. يصف البروتوكول التالي كافة خطوات سير العمل بالتفصيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها على جميع الأساليب الموصوفة هنا التابعة لإيراسموس إم سي.

1. إعداد عينة

  1. الخلايا المثقفة
    1. حدد خط الخلية ذات الاهتمام (على سبيل المثال، HeLa أو خلايا العظام [U2OS] الخلايا) وتنمو الخلايا في جلبكو الحد الأدنى النسر المتوسطة (DMEM) تكملها حرارة 10٪ مصل البقر الجنين المنشط (FBS) و 100 وحدة / مل البنسلين / العقديات.
    2. لتجارب البروتيوميات الكمية، الخلايا الثقافية في DMEM تفتقر إلى أرجينين وليسين. يجب أن تستكمل المتوسطة مع 10٪ مصل البقري الجنيني dialyzed (FBS), 100 وحدة / مل البنسلين / العقديات, وألانين الجلوتامين. جعل نوعين من وسائل الإعلام عن طريق إضافة إما الليسين التقليدية وأرجينين ('الضوء' المتوسطة) أو ليسين-8(13C6; 15N2)وأرجينين-10(13C6; 15N4)('الثقيلة' المتوسطة)، على التوالي.
    3. دفعات الاستزراع من الخلايا في المتوسط الخفيف (أي غير المسمى) والمتوسطة الثقيلة (أي المسمى، SILAC) لمدة ست مرات على الأقل قبل التوسع والعلاج للتأكد من أن جميع البروتينات في الثقافة المتوسطة الثقيلة تحمل نظائر مستقرة ثقيلة تحتوي على الأحماض الأمينية.
    4. علاج الخلايا لمدة 8 ساعة مع 10 ميكرومتر من bortezomib مثبط البروتينأو ما يعادل حجم DMSO كعلاج وهمي. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وفصلها باستخدام 1٪ التربسين / EDTA، وبيليه الخلايا.
    5. ليس بيليه الخلية من واحد 150 سم2 لوحة الثقافة لكل حالة اختبارها في 2 مل من الجليد الباردة 50 mM تريس-HCl (درجة الحموضة = 8.2) مع 0.5% ديوكشولات الصوديوم (DOC). يغلي lysate في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة وسونيكات لمدة 10 دقيقة (وضع "H" لسونيكاتور المدرجة في جدول المواد)في 4 درجة مئوية. نحن لا ننصح باستخدام مثبطات deubiquitinase مثل N-ethylmaleimide (NEM), لأن هذا قد إدخال تعديلات البروتين غير المرغوب فيها التي يمكن أن تعقد التعرف على الببتيد.
  2. في الأنسجة الدماغ الماوس على الجسم الحي
    1. عند استخدام في أنسجة الجسم الحي، lyse الأنسجة في عازلة الجليد الباردة التي تحتوي على 100 mM تريس-HCl (درجة الحموضة = 8.5)، 12 mM الصوديوم DOC، و 12 mm الصوديوم ن-lauroylsarcosinate17. Sonicate lysate لمدة 10 دقيقة (وضع "H" لsonicator المدرجة في جدول المواد)في 4 درجة مئوية وتغلي lysate لمدة 5 دقيقة في 95 درجة مئوية.
  3. كمية إجمالي كمية البروتين باستخدام امتصاص اللون BCA مجموعة فحص البروتين. يجب أن تكون الكمية الإجمالية للبروتين على الأقل عدة ملليغرام لناجحة diGly الببتيد المناعيال (الملكية الفكرية). بالنسبة لتجارب SILAC، تخلط البروتينات الخفيفة والثقيلة في نسبة 1:1 استنادًا إلى إجمالي كمية البروتين.
  4. تقليل جميع البروتينات باستخدام 5 mM 1,4-dithiothreitol لمدة 30 دقيقة في 50 درجة مئوية وalkylate ثم لهم مع iodoacetamide 10 mM لمدة 15 دقيقة في الظلام. إجراء هضم البروتين مع ليس-C (1:200 نسبة إنزيم إلى الركيزة) لمدة 4 ساعات تليها الهضم بين عشية وضحاها مع التربسين (1:50 نسبة الإنزيم إلى الركيزة) في 30 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. إضافة حمض ثلاثي الفلورواسيك (TFA) إلى العينة المهضومة إلى تركيز نهائي قدره 0.5٪ والطرد المركزي للعينة عند 10,000 × ز لمدة 10 دقيقة من أجل تسريع وإزالة جميع المنظفات. جمع supernatant التي تحتوي على الببتيدات للكسر اللاحقة.

2. تجزئة الببتيد دون اتصال

  1. استخدام درجة الحموضة العالية في المرحلة العكسية (RP) C18 الكروماتوغرافيا مع مادة المرحلة الثابتة البوليمرية (300 Å, 50 μM; انظر جدول المواد)محملة في خرطوشة عمود فارغة لكسر الببتيدات التربكية. يجب تعديل حجم السرير المرحلة الثابتة إلى كمية هضم البروتين لتكون مجزأة. إعداد فارغة 6 مل خرطوشة العمود (انظر جدول المواد)مليئة 0.5 غرام من المواد المرحلة الثابتة ل ~ 10 ملغ من هضم البروتين. يجب أن يكون هضم البروتين إلى نسبة المرحلة الثابتة حوالي 1:50 (ث / ث).
  2. قم بتحميل الببتيدات على العمود المعد واغسل العمود بحوالي 10 مجلدات عمود بنسبة 0.1٪ TFA، متبوعاً بحوالي 10 مجلدات عمود من H2O.
  3. يلخ الببتيدات إلى ثلاثة كسور مع 10 أحجام عمود من 10 mm ammonium formate الحل (pH = 10) مع 7٪، 13.5٪، و 50٪ الأسيتونتريل (AcN)، على التوالي. Lyophilize جميع الكسور إلى اكتمال.
  4. استخدام الأجسام المضادة في كل مكان (K-а-GG) مترافقة مع البروتين A حبات agarose للإثراء المناعي من الببتيدات diGly. لأن المبلغ الدقيق للجسم المضاد لكل دفعة من الخرز هو معلومات الملكية وليس الكشف عنها من قبل الشركة المصنعة، فمن المستحسن استخدام نفس التعريف لدفعة من الخرز كما يفعل الصانع من أجل تجنب الارتباك. غسل دفعة واحدة من هذه الخرز 2x مع برنامج تلفزيوني وتقسيم الطين حبة إلى ستة كسور متساوية. انظر الشكل 1 للاطلاع على مخطط تجريبي مفصل.
  5. حل كسور الببتيد الثلاثة التي تم جمعها في الخطوة 2.3 في 1.4 مل من عازل يتكون من 50 mM MOPS، و10 mM فوسفات الصوديوم، و 50 mM NaCl (pH = 7.2)، ويدور أسفل الحطام.
  6. إضافة الناسات من الكسور إلى حبات الأجسام المضادة diGly واحتضان لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية على وحدة دوار. تدور أسفل الخرز ونقل supernatant إلى دفعة جديدة من حبات الأجسام المضادة واحتضان مرة أخرى لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية.
  7. تخزين المواد الخارقة لتحليل البروتيوم العالمي اللاحق (GP).
  8. نقل الخرز من كل كسر إلى 200 μL تلميح ماصة مجهزة قابس مرشح GF / F للاحتفاظ الخرز. ضع طرف الماصة مع الخرز في أنبوب طرد مركزي صغير بـ 1.5 مل مجهز بمحول تلميح طرد مركزي. غسل الخرز 3x مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة IAP عازلة و3x في وقت لاحق مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة milliQ H2O. تدور أسفل العمود في 200 × ز لمدة 2 دقيقة قبل كل خطوة غسل، ولكن يجب الحرص على عدم السماح العمود تشغيل الجافة. تمل الببتيدات باستخدام دورتين من 50 ميكرولتر من 0.15٪ TFA.
  9. desalt الببتيدات باستخدام تلميح المرحلة C18 (أساسا 200 μL تلميح pipette مع اثنين من الأقراص C18) وتجفيفها إلى اكتمال باستخدام الطرد المركزي فراغ.

3. نانوتدفق LC-MS/MS

  1. إجراء تجارب LC-MS/MS على مطياف كتلة حساسة إلى جانب نظام LC تدفق نانو.
  2. استخدم عمودًا داخليًا مربّعًا بطول 50 سمًا مع قطر داخلي بطول 75 ميكرومتر ًا محشوًا براتنج CSH130 (3.5 ميكرومتر، 130 Å) وزل الببتيدات بتدرج 2-28٪ (AcN، 0.1٪ FA) على بعد 120 دقيقة عند 300 nL/min. بدلاً من ذلك، استخدم أعمدة LC المتاحة تجاريًا مع خصائص مماثلة. احتفظ بالعمود عند 50 درجة مئوية باستخدام فرن عمود، على سبيل المثال (انظر جدول المواد).
  3. إجراء تحليل قياس الطيف الكتلي.
    1. يجب تشغيل مطياف الكتلة في وضع الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA). يجب جمع أطياف كتلة MS1 بدقة عالية (على سبيل المثال، 120,000)، مع تحديد هدف التحكم الآلي في الكسب (AGC) من 4E5 ووقت حقن أقصى قدره 50 مللي ثانية في حالة مطياف كتلة Orbitrap.
    2. إجراء تحليل قياس الطيف الكتلي في وضع "أعلى كثافة أولاً". بهذه الطريقة ، يتم تحديد الأيون الأكثر كثافة أولاً للتجزئة ، ثم ثاني أعلى ، وهكذا دواليك ، باستخدام طريقة السرعة القصوى مع وقت دورة إجمالي 3 ثوانٍ. في وقت لاحق، قم بإجراء جولة ثانية من تحليل DDA MS في وضع "أدنى كثافة أولاً"، بحيث يتم تحديد الأيون الأقل كثافة أولاً، ثم ثاني أدنى، وهكذا دواليك. تضمن هذه الاستراتيجية الكشف الأمثل عن الببتيدات المنخفضة جدًا.
    3. تصفية الأيونات السلائف وفقا لولايات تهمة (2-7 التهم) وإحالة ذروة monoisotopic. استبعاد السلائف التي تم استجوابها سابقا بشكل حيوي لمدة 60 s. عزل سلائف الببتيد مع مرشح كتلة رباعية السلسلة تعيين إلى عرض 1.6 Th.
    4. جمع أطياف MS2 في فخ أيون في AGC من 7E3 مع الحد الأقصى لوقت الحقن من 50 مللي ثانية وطاقة الاصطدام HCD من 30٪.

4 - تحليل البيانات

  1. تحليل الملفات الخام الطيفية الشامل باستخدام محرك بحث مناسب مثل مجموعة برامج MaxQuant المتاحة بحرية على أساس محرك البحث أندروميدا18،19. في MaxQuant، حدد الإعدادات الافتراضية مع بعض التعديلات المشار ة أدناه. تعيين خصوصية الإنزيم لالتربسين، مع الحد الأقصى لعدد الانقسامات غاب رفعت إلى ثلاثة. تعيين ليسين مع بقايا diGly (+114.04 دا)، أكسدة الميثيونين وN-المحطة النهائية الأسيتيل كتعديلات متغيرة، وتعيين كارباميدوميثيليشن من السيستين كتعديل ثابت.
  2. إجراء عمليات البحث في قاعدة البيانات مقابل ملف FASTA يحتوي على تسلسلات البروتين التي تم تنزيلها من، على سبيل المثال، مستودع Uniprot(https://www.uniprot.org/downloads)جنبا إلى جنب مع شرك وقاعدة بيانات الملوثات الشائعة القياسية التي يتم توفيرها تلقائيا من قبل MaxQuant. تعيين معدل الاكتشاف الزائف (FDR) إلى 1٪ وتعيين الحد الأدنى للنقاط للببتيدات المعدلة (diGly) إلى 40 (القيمة الافتراضية). استبعاد الببتيدات التي تم تحديدها مع بقايا الليسين المعدلة C-terminal من مزيد من التحليل.
  3. للتحليل الكمي لملفات تجربة SILAC، قم بتعيين التعدد إلى "2" وكرر الخطوة 4.2.
  4. إجراء جميع التحليلات المصب (على سبيل المثال، الإحصاءات، تحليلات علم الأنطولوجيا الجينية) مع وحدة بيرسيوس20 من مجموعة برامج MaxQuant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البروتينات في كل مكان ترك 114.04 دا بقايا diglycine على بقايا الليسين الهدف عندما يتم هضم البروتينات مع التربسين. تم استخدام الفرق الكتلي الناجم عن هذا الزخرف ة للتعرف بشكل لا لبس فيه على موقع التعامي في تجربة قياس الطيف الكتلي. الاستراتيجية التي نصفها هنا هي طريقة حديثة لإثراء وتحديد الببتيدات diGly اللاحقة بواسطة تدفق نانوي LC-MS /MS(الشكل 1A). في هذه الدراسة ، تم استخدام كل من الخلايا المستزرعة والمواد الفية للخلايا كمصدر بيولوجي للبروتينات ، ولكن هذا البروتوكول متوافق مع أي مصدر للبروتينات. بعد الخطوات في البروتوكول يجب أن تكون واضحة لتحديد 10،000-25،000 الببتيدات diGly من 2-20 ملغ من مدخلات البروتين. لزيادة مدى انتشار البروتين في الخلايا ، يمكن إضافة مثبط بروتياسوم مثل bortezomib أو MG132 قبل بضع ساعات من حصاد الخلايا. إذا لم يتم استخدام مثبط البروتين، فإن أعداد الببتيدات المحددة diGly تميل إلى أن تكون أقل بكثير (30-40٪).

لقد أدخلنا عدة تحسينات على البروتوكولات القائمة. أولاً، يتم إجراء تقسيم خام إلى ثلاثة كسور على أساس الكروماتوغرافيا ذات المرحلة المعكوسة والelution اللاحق عند درجة الحموضة العالية لتقليل تعقيد خليط الببتيد. تظهر هذه الكسور تداخلًا منخفضًا جدًا في تحديدات الببتيد ، ويجب تحديد أعداد مماثلة من الببتيدات diGly لكل كسر(الشكل 2). وهذا يؤدي إلى أعداد كبيرة من الببتيدات diGly فريدة من نوعها التي تم تحديدها في كل من تلك الكسور. الأهم من ذلك، واحدة من الكسور (عادة الثانية) يجب أن تحتوي على K48 في كليومكتين المعدلة K48 الببتيد liFAGK (GG) QLEDGR (m/z 730.39). هذا هو إلى حد بعيد الببتيد الأكثر وفرة في الكسر المناعي ويتميز بالذروة المكثفة والواسعة في كروماتوغرام LC(الشكل 1B). هذه هي ذروة الكروماتوغرافية القياسية وإذا كانت غائبة عن الكروماتوجرام ، فمن المرجح أن يكون IP غير ناجح.

تحسن آخر هو التكيف من إجراء تحليل DDA هو متعدد القطب توجيه أيون في مطياف الكتلة. في الاستحواذ التقليدي الأعلى على البيانات N (DDA)، يتم تحديد قمم N من طيف MS1 للتجزئة. يبدأ مخطط التجزئة هذا بأعلى قمة كثافة أولاً، تليها ذروة ثاني أعلى كثافة، وما إلى ذلك. وفي مخطط تجزئة بديل، يتم اختيار الذروة الأقل كثافة أولاً، تليها ثاني أقل قمة كثافة، وما إلى ذلك. الأساس المنطقي وراء هذا الترتيب للاختيار هو أن يكون هناك ما يكفي من الوقت لتفتيت الببتيدات وفيرة منخفضة جدا كذلك. في الواقع، وجدنا أن عدد التعرفات الببتيد يزيد عندما تم الجمع بين "الأعلى الأول" و "أدنى أولا" DDA أشواط مقارنة مع تحليل LC-MS مكررة مع إعدادات DDA القياسية (أي الأعلى أولا). وللحصول على تنميط أكثر شمولاً في كل مكان، يوصى بالتالي بالجمع بين تشغيل LC-MS مع أنظمة التجزئة "أولاً الأعلى" و"الأدنى أولاً" في إجراء تحليل البيانات. يمكن لهذه الاستراتيجية "الأدنى أولاً" أن تنتج أكثر من 4000 ببتيد اتّحد من نوعه، والتي لم يتم اكتشافها عندما تم استخدام نظام DDA التقليدي فقط(الشكل 2).

وأخيرا ، يمكن للIP إضافية من flowthrough بعد IP الأول إنتاج آخر ~ 2500 الببتيدات diGly فريدة من نوعها(الشكل 2).

مقالات في الأدب على التنميط ubiquitination عادة ما تقرير حوالي 10،000 الببتيدات diGly محددة12,21. هنا ، من بين جميع الببتيدات diGly التي تم تحديدها على ثلاث شاشات بيولوجية تكرارية ، كان هناك > 9000 في جميع الشاشات الثلاث ، في حين أن أكثر من 17000 كانت موجودة في اثنين على الأقل من أصل ثلاثة يكرر(الشكل 3). عادة، بعد البروتوكول الموصوف هنا ينبغي للمرء أن يحدد > 21،000 الببتيدات diGly فريدة من نوعها من عينة بروتين 15-20 ملغ باستخدام دفعة واحدة قياسية من حبات الأجسام المضادة CST. من حيث النقاء والانتقائية يجب أن تكون النسبة بين الببتيدات المحددة diGly والببتيدات غير المعدلة دائمًا > 0.5. كان عدد هويات الببتيد diGly يعتمد بشكل كبير على كمية مواد مدخلات البروتين. تم إنتاج IP الذي يتم تنفيذه مع 1 ملغ فقط من مواد الإدخال ما يقرب من 2500 تحديد الببتيد diGly ، في حين تم إنتاج 10 ملغ من مواد مدخلات البروتين > 15000 تحديد الببتيد diGly. يسرد الجدول 1 العدد المتوقع من الببتيدات المحددة diGly لكل حالة. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الأرقام ليست سوى تقديرات وتعتمد على نوع مطياف الكتلة المستخدم. ويبين الشكل 4 التداخل بين تحديدات الببتيد diGly مع كميات منخفضة ومتوسطة وعالية من مواد الإدخال.

من أجل توضيح القيمة المضافة للتحسينات لتحليل موقع ubiquitination المذكورة أعلاه ، قمنا أيضًا بإجراء تحليل كمي في كل مكان لخلايا HeLa المسماة SILAC التي تم علاجها باستخدام bortezomib مثبط البروتين مقارنة بخلايا التحكم غير المعالجة في تصنيف مكرر لمبادلة. أكثر من النصف (أكثر من 55%) من جميع الببتيدات التي تم تحديدها في eluate على IP كانت الببتيدات diGly. تم تحديد أكثر من 19,000 ببتيد فريد من نوعه، وهو أقل قليلاً فقط مما هو عليه في عينة غير SILAC المسماة. قد يكون السبب في ذلك هو التعقيد العالي لأطياف MS1 في قياس SILAC بسبب وجود أزواج ذروة الببتيد. في تحليل SILAC لوحظت اختلافات كبيرة نسبيا بين أعداد الببتيدات diGly التي تم تحديدها حصرا في حالة إلى الأمام (أي، عالج البورتزوميب الخلايا في القناة الثقيلة، وخلايا التحكم في القناة الخفيفة) وتلك التي تم تحديدها حصريًا في الحالة العكسية (أي الخلايا المعالجة bortezomib في القناة الخفيفة، خلايا التحكم في القناة الثقيلة)، وفي هذه الحالة 1,752 مقابل 6,356(الجدول التكميلي 1). عند تشغيل برنامج MaxQuant في وضع "تعدد = 2" (أي SILAC) ذو قناتين ، تم تحديد 7555 ببتيدات diGly بكثافة صفرية في القناة الثقيلة (كلها تقريبًا تأتي في التجربة العكسية) وقيمة كثافة غير صفرية في القناة الخفيفة. وعلى النقيض من ذلك، لم يتم تحديد أي ببتيدات واحدة ذات كثافة غير صفرية في القناة الثقيلة مصحوبة بقيمة صفرية في القناة الخفيفة. عندما تم إجراء تحليل MaxQuant على مجموعة البيانات نفسها في وضع "تعدد = 1" مع moiety diGly والأحماض الأمينية المسماة مجتمعة في تعديل متغير واحد واحد ، تم تحديد العديد من المتغيرات الببتيد diGly الثقيلة ، حتى عندما لا يمكن الكشف عن نظير خفيف من هذا الببتيد. التفسير الأكثر احتمالا لهذا هو عدم قدرة البرنامج على التعامل مع تحديد الببتيدات diGly التي هي موجودة حصرا في القناة الثقيلة. ومن المرجح أن تحدث هذه الظاهرة على نطاق واسع ، لأن تثبيط البروتين سيؤدي إلى تشكيل مواقع جديدة في كل مكان. إن تحديد خانة الاختيار "إعادة القياس" في MaxQuant، والتي تم تطويرها للتعامل مع هذه القضايا وينبغي تصحيحها، تبدو غير كافية لتجنب هذه المشكلة تمامًا. ومن الواضح أن الغالبية العظمى من الببتيدات diGly يجري upregulationed أو شكلت دي نوفو على تثبيط بروتيجال، لأن أكثر من ثلثي تجمع الببتيد لديها نسب H:L من 1.5 على الأقل(الشكل 5B).

وأخيرا، طبقنا هذا الأسلوب تحليل موقع ubiquitination إلى عينة في الأنسجة في الجسم الحي. لتقييم فعالية, استخرجنا ما يقرب من 32 ملغ من البروتين من دماغ الماوس الطازج (~ 10% من وزن الأنسجة الرطبة هو البروتين). لم يتم علاج مادة الدماغ مع مثبطات البروتين أو أي كاشف آخر يمكن أن يعزز انتشار البروتين بشكل عام. من هذه العينة، تم تحديد 10,871 ببتيدات diGly فريدة من نوعها(الجدول التكميلي 2). جميع الببتيدات diGly التي تم تحديدها في هذا النسيج نشأت من مواقع محلية من الكلوفيفيفيحالة في حالة ثابتة. لم يتم فرض أي علاج لتعزيز الانتشار العالمي (على سبيل المثال، تثبيط البروتين). ولذلك فإننا نفترض أن هذه المواقع في كل مكان على الأقل تنشأ جزئيا من (بولي) في كل مكان تشارك في غير proteasome بوساطة أحداث الإشارات الخلوية، والتي هي في اتفاق مع الأفكار المقترحة في الأدب5،16،22.

وفي الختام، فإن الطريقة الموصوفة هنا تسمح بالاستكشاف المتعمق للكلواب بطريقة قابلة للاستنساخ. للحصول على لمحة عامة عن النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها مع هذا الإجراء انظر فان دير وال وآخرون23.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة تجريبية. (أ)نظرة عامة على النهج التجريبي. تم إعداد العينات، وتجريبها، وكسور إلى ثلاثة كسور باستخدام الكروماتوغرافيا عكس المرحلة مع elution درجة الحموضة العالية. تم تقسيم دفعة واحدة من الخرز المضاد للببتيد α-diGly التجارية إلى ستة كسور متساوية وتم تحميل كسور الببتيد الثلاثة بعد ذلك على ثلاثة من كسور الخرز. تم تنقية الببتيدات diGly مناعيًا ، وتوصف ، وتم جمعها ، وتم نقل التدفق في وقت لاحق إلى كسور الخرز الطازجالثلاثة المتبقية. تم تحليل الببتيدات diGly التي تم جمعها عن طريق قياس الطيف الكتلي على مطياف كتلة Lumos Orbitrap وفقًا لمخطط من مستويين يجمع بين دورة واحدة تم فيها اختيار القمم الأكثر كثافة لأول مرة لتفتيت الببتيد والدورة التالية التي تم فيها اختيار القمم الأقل كثافة أولاً. ثم تم تحليل المجموعة الكاملة من تشغيل nLC-MS/MS باستخدام MaxQuant. (ب)واحدة من الكسور يجب أن تحتوي على في جميع أجزاء K48 الخاصة المعدلة الببتيد diGly LIFAGK (GG) QLEDGR (m/z 730.39). هذا هو إلى حد بعيد الببتيد الأكثر وفرة في الكسر المناعي وتميزت بالذروة المكثفة والواسعة في الكروماتوغرام LC بين 50-55 دقيقة على تدرج 120 دقيقة. إذا كانت هذه الذروة القياسية غائبة عن الكروماتوجرام ، فمن المرجح أن يكون IP غير ناجح. وقد تم تعديل هذا الرقم من فان دير وال وآخرون23. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: أرقام الببتيدات diGly المكتشفة لكل من خطوات التحسين الثلاث. (أ)تأثير الكسر الخام قبل الترسيب المناعي. يظهر التداخل بين مجموعات الببتيد diGly المحددة في الكسور الثلاثة المنفصلة. (ب)تأثير خطوات الحضانة الأولى والثانية. (ج)نتائج نظام تجزئة الببتيد المعدل. وقد تم تعديل هذا الرقم من فان دير وال وآخرون23. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الببتيدات DiGly المكتشفة في ثلاثة يكرر البيولوجية من الخلايا المعالجة bortezomib تبين كمية التداخل بين أشواط. وقد تم تعديل هذا الرقم من فان دير وال وآخرون23. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تداخل الببتيدات المحددة من التحليلات مع منخفضة (4 ملغ)، متوسطة (10 ملغ)، وارتفاع (40 ملغ) إجمالي كميات مدخلات البروتين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الكشف عن الببتيدات diGly في الخلايا المسماة SILAC. (أ)أرقام الببتيدات المكتشفة في الظروف الأمامية والعكسية لخلايا هيلا المسماة SILAC لإعدادات التعدد 1 و 2. (ب)مبعثرة من نسب الببتيد diGly SILAC في Bortezomib (Btz) تعامل خلايا هيلا. يتم عرض الببتيدات فقط التي تم تحديدها وقياسها كميا في كل من التجارب الأمامية والعكسية. وقد تم تعديل هذا الرقم من فان دير وال وآخرون23. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حاله كمية مواد الإدخال (ملغ) العدد المتوقع من الببتيدات المحددة diGly
خلايا هيلا غير المعالجة 10 7,500
مثبط بروتياسوم يعالج خلايا هيلا 1 2,500
2 5,000
10 15,000
20 20,000
40 > 25,000
الأنسجة (دماغ الفأر) 30 > 10,000

الجدول 1: الأعداد المتوقعة من هويات الببتيد اتّحد تُحدّد ظروف مختلفة. هذه الأرقام هي تقديرات فقط وتعتمد على الإعدادات التجريبية المستخدمة.

الجدول التكميلي 1- يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).

الجدول التكميلي 2- يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تطبيق البروتوكول الموصوف هنا على عينات من مصادر بيولوجية مختلفة، مثل الخلايا المستزرعة وفي أنسجة الجسم الحي. في جميع الحالات حددنا الآلاف من الببتيدات diGly، شريطة أن يكون إجمالي كمية مدخلات البروتين 1 ملغ على الأقل. الإثراء باستخدام أجسام مضادة محددة فعالة للغاية ، بالنظر إلى أنه تم تحديد الببتيدات المنخفضة جدا ً من الخلايا بأكملها 100-150 فقط من الخلايا بأكملها إذا لم يتم تطبيق إجراءات تخصيب للبروتينات المحددة في كل مكان أو الببتيدات diGly. ومن الواضح أن قياس الطيف الكتلي الحساس شرط مسبق للحصول على أعداد كبيرة من بطاقات الهوية المعقدة. على الرغم من أننا استخدمنا بنجاح العديد من مطيافات الكتلة المختلفة ، وجدنا أن Orbitrap Tribrid Lumos هو الأكثر حساسية الذي أعطى أعلى الغلة.

يجب اختبار الكروماتوغرافيا RP غير المتصلة بالإنترنت مع elution عالية درجة الحموضة قبل تنفيذ IP. يجب أن يكون التداخل بين الكسور من حيث تحديد الببتيد منخفضًا قدر الإمكان لتجربة مثالية. بعد IP ، يجب أن يحتوي أحد الكسور على K48 المعدلة K48 الخاصة بـ البتيد البتيد LIFAGK (GG) QLEDGR (m/z 730.39). هذا هو إلى حد بعيد الببتيد الأكثر وفرة في الكسر المناعي ويتميز بالذروة المكثفة والواسعة في كروماتوغرام LC بين 50-55 دقيقة على تدرج 120 دقيقة(الشكل 1B). إذا كانت هذه الذروة القياسية غائبة عن الكروماتوجرام، فإن IP كان غير ناجح على الأرجح.

من المهم تحليل الببتيدات التربتية المنفحلة المناعية مباشرة بعد إجراء IP ، لذلك يجب الحفاظ على الوقت بين IP والتحليل إلى الحد الأدنى. خلال ذلك الوقت ، يفضل تخزين الببتيدات في قارورة زجاجية بدلاً من الأنابيب البلاستيكية. ترك الببتيدات في أنابيب بلاستيكية لفترة طويلة جدا، إما في RT أو في -20 درجة مئوية، قد يؤدي إلى هطول الأمطار من الببتيدات و / أو التمسك جدار أنبوب من البلاستيك. وهذا سيؤثر في نهاية المطاف على حساسية التحليل.

على الرغم من أن هناك تقارير في الأدب حول سوء تفسير محتمل للقنوات الأيودوستاميد كمواقع ubiquitination بسبب التحولات الكتلة 114.04 دا متطابقة24، لم نجد أي مؤشر على ذلك مع استعداداتنا من الببتيدات الترببتيك المناعي. أولاً، الآثار الجانبية لاستخدام اليودواسيتاميد (IAM) هي الحد الأدنى في أيدينا باستخدام بروتوكول الحد من الألكيلة المذكورة أعلاه. ثانياً، الأجسام المضادة محددة للببتيدات ذات بقايا الحفريات. لا ينبغي إثراء الببتيدات مع اثنين من iodoacetamide moieties covalently إلى بقايا الليسين في هذا البروتوكول. ثالثاً، غالبية الببتيدات في الكسر المناعي يتم تنظيمها على تثبيط البروتين، كما هو موضح في تجربة SILAC المذكورة أعلاه(الشكل 5). لأن تتأثر أعداد البروتينات في كل مكان نتيجة لهذا العلاج، فمن المرجح جدا أن هذه الببتيدات المتضررة هي في الواقع الببتيدات diGly الناتجة عن البروتينات في كل مكان.

وأخيراً، يمكن استخدام هذا البروتوكول بالاقتران مع استراتيجية كمية متعددة المؤشرات نشرت مؤخراً باستخدام TMT19. ومن الواضح أنه على الرغم من أن الأرقام المنشورة من الببتيد diGly أقل إلى حد ما من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول الحالي ، فإن القدرة على التحديد الكمي نسبيًا لما يصل إلى 16 عينة في وقت واحد هي ميزة كبيرة. الجمع بين هذه الأساليب سوف تسمح للباحثين لإجراء دراسات ubiquitinome الكمية على نطاق واسع في عمق كبير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

هذا العمل هو جزء من مشروع "البروتينات في العمل"، وهو برنامج للمركز الهولندي للبروتيوميات الذي تموله المنظمة الهولندية للبحث العلمي كجزء من خارطة الطريق الوطنية على نطاق واسع مرافق البحوث (المشروع رقم 184.032.201 ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithioerythritol Sigma-Aldrich D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks Supelco 66883-U product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate Sigma-Aldrich 70221
Bortezomib UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 34869
DMEM ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200 ThermoFisher
FBS Gibco
GF/F filter plug Whatman 1825-021
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125
Lysine, Arginine Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC) Wako Pure Chemicals 129-02541
NanoLC oven MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma-Aldrich L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher / Pierce 23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles Agilent Technologies PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit Cell Signaling Technologies 5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge Waters WAT036790 Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
Tris-base Sigma-Aldrich T6066
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Trypsin, TPCK Treated ThermoFisher 20233

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
  2. Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79, (1), 13-21 (1995).
  3. Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161, (2), 125-133 (2017).
  4. Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458, (7237), 461-467 (2009).
  5. Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81, (1), 203-229 (2012).
  6. Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68, (1), 233-246 (2017).
  7. Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
  8. Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21, (8), 921-926 (2003).
  9. Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11, (12), 1578-1585 (2012).
  10. Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13, (8), 1979-1992 (2014).
  11. Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59, (5), 867-881 (2015).
  12. Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (10), M111.013284 (2011).
  13. Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
  14. Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16, (8), 2848-2862 (2017).
  15. Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28, (8), 868-873 (2010).
  16. Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44, (2), 325-340 (2011).
  17. Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13, (2), 915-924 (2014).
  18. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26, (12), 1367-1372 (2008).
  19. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11, (12), 2301-2319 (2016).
  20. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13, (June), 731-740 (2016).
  21. Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3, (4), 395-403 (2016).
  22. Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8, (8), 691-696 (2011).
  23. Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
  24. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5, (6), 459-460 (2008).
الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bezstarosti, K., van der Wal, L., Demmers, J. A. A. Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e59079, doi:10.3791/59079 (2020).More

Bezstarosti, K., van der Wal, L., Demmers, J. A. A. Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e59079, doi:10.3791/59079 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter