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Biochemistry

पेप्टाइड संवर्धन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाना

Published: March 23, 2020 doi: 10.3791/59079
Automatic Translation
1, 1, 1
1Proteomics Center, Erasmus University Medical Center

Summary

हम जटिल जैविक नमूनों से सर्वव्यापी प्रोटीन से उत्पन्न होने वाले डिग्ली पेप्टाइड्स की शुद्धि, पता लगाने और पहचान के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तुत विधि सर्वव्यापकविश्लेषण की गहराई के स्तर के संबंध में प्रकाशित तरीकों को पुन: उत्पन्न, मजबूत और बेहतर प्रदर्शन करती है।

Abstract

छोटे प्रोटीन सर्वव्यापकता द्वारा प्रोटीन का पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन कई सेलुलर घटनाओं में शामिल है। सर्वव्यापी प्रोटीन के ट्रिप्टिक पाचन के बाद, एक डिग्लिसिन अवशेष के साथ पेप्टाइड्स का उपयोग लिसिन ('K-ε-डिग्लिसिन' या बस 'डिग्ली' के एपिलिन अमीनो समूह में किया जाता है) मूल संशोधन साइट को वापस ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा संवेदनशील पता लगाने के साथ संयुक्त डिग्ली पेप्टाइड्स के कुशल इम्यूनोशुद्धि के परिणामस्वरूप आज तक पहचाने गए सर्वव्यापी स्थलों की संख्या में भारी वृद्धि हुई है। हमने इस कार्यप्रवाह में कई सुधार किए हैं, जिनमें संवर्धन प्रक्रिया से पहले पेप्टाइड्स का ऑफलाइन उच्च पीएच रिवर्स-चरण अंशीकरण और आयन राउटिंग मल्टीपोल में अधिक उन्नत पेप्टाइड विखंडन सेटिंग्स को शामिल करना शामिल है। इसके अलावा, फिल्टर-आधारित प्लग का उपयोग करके नमूने की अधिक कुशल सफाई, एंटीबॉडी मोतियों को बनाए रखने के लिए डिग्ली पेप्टाइड्स के लिए अधिक विशिष्टता में परिणाम देता है। इन सुधारों के परिणामस्वरूप कोशिका में प्रोटेको अवरोध पर मानव गर्भाशय ग्रीवा कैंसर कोशिकाओं (HeLa) कोशिका से 23,000 से अधिक डिग्ली पेप्टाइड्स का नियमित पता लगाया जाता है। हम मस्तिष्क के ऊतकों जैसे कई अलग-अलग कोशिका प्रकारों और वीवो नमूनों में सर्वव्यापकता प्रोफाइल के गहन विश्लेषण के लिए इस रणनीति की प्रभावकारिता दिखाते हैं। यह अध्ययन गहरे सेलुलर सर्वव्यापकता को उजागर करने के लिए प्रोटीन सर्वव्यापकता विश्लेषण के लिए टूलबॉक्स के लिए एक मूल अतिरिक्त प्रस्तुत करता है।

Introduction

प्रोटीन के लिए सर्वव्यापकता का संयोजन उन्हें प्रोटेसोम द्वारा गिरावट के लिए चिह्नित करता है और प्रोटेओस्टेसिस में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। सर्वव्यापकता का सी-टर्मिनल कार्बोसिल समूह लक्ष्य प्रोटीन1,2के लाइसिन ε-अमीनो समूह के साथ एक आइसोपेप्टाइड बांड बनाता है। इसके अलावा, सर्वव्यापी अन्य सर्वव्यापी मॉड्यूल से जुड़ा हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सजातीय (यानी, के48 या के11) या शाखाओं में बंटी (यानी, विषम या मिश्रित) पॉलीयूबिकिन संरचनाएं1,,3। सर्वव्यापकता का सबसे प्रसिद्ध कार्य प्रोटेसोमल क्षरण में इसकी भूमिका है, जो K48-जुड़े पॉलीयूक्विटिन द्वारा मध्यस्थता की गई है। हालांकि, यह स्पष्ट हो गया है कि मोनो के साथ-साथ पॉलीयूब्किटिनेशन दोनों भी कई प्रक्रियाओं में भूमिकानिभाते हैं जो प्रोटेसोम द्वारा गिरावट से स्वतंत्र हैं। उदाहरण के लिए, K63 से जुड़ी जंजीरों में इंट्रासेलर तस्करी, lysosomal क्षरण, काइनेज सिग्नलिंग और डीएनए क्षति प्रतिक्रिया4,,5में अडिग्रेडेटिव भूमिकाएं होती हैं । अन्य छह लिंकेज प्रकार कम प्रचुर मात्रा में हैं और उनकी भूमिकाएं अभी भी काफी हद तक रहस्यपूर्ण हैं, हालांकि सेल में उनके कार्यों के बारे में पहले संकेत उभर रहे हैं, मुख्यतः लिंकेज-विशिष्ट पहचान6,,7को सक्षम करने के लिए उपन्यास उपकरणों के विकास के कारण।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटेम विश्लेषण के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन गया है और आजकल लगभग किसी भी जैविक स्रोत से हजारों विभिन्न प्रोटीन ों की पहचान एक ही प्रयोग में की जा सकती है। जटिलता की एक अतिरिक्त परत प्रोटीन (जैसे, फॉस्फोरिलाइजेशन, मिथाइलेशन, एसीटिलेशन, और सर्वव्यापकता) के पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएमएस) द्वारा प्रस्तुत की जाती है जो प्रोटीन गतिविधि को मिला सकती है। बड़े पैमाने पर पीटीएम-असर प्रोटीन की पहचान भी बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री क्षेत्र में विकास से संभव हो पाया है । अपने असंशोधित समकक्षों की तुलना में पीटीएमएस वाले पेप्टाइड्स की अपेक्षाकृत कम स्टोइचियोमेट्री एक तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करती है और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहले जैव रासायनिक संवर्धन कदम आम तौर पर आवश्यक होते हैं। पिछले दो दशकों में पीटीएमएस के विश्लेषण के लिए कई अलग-अलग विशिष्ट संवर्धन विधियां विकसित की गई हैं।

कोशिका में प्रोटीन सर्वव्यापकता की बहुआयामी भूमिकाओं के कारण, प्रोटीन8पर सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाने के लिए विश्लेषणात्मक तरीकों के विकास की काफी मांग है। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक तरीकों के अनुप्रयोग के कारण फल मक्खी, माउस, मानव और खमीर प्रोटीन9, 10,,11,,12,,13,,14में पहचाने गए सर्वव्यापकता स्थलों की संख्या में विस्फोट हुआ है ।10 कश्मीर-ε-GG अवशेष आकृति के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करपेटाइड स्तर पर इम्यूनोप्रिसिप्रिशन आधारित संवर्धन रणनीतियों के विकास द्वारा एक बड़ा कदम प्रस्तुत किया गया था (जिसे 'डिग्लिसिन' या 'डिग्ली' भी कहा जाता है)। ये डिग्ली पेप्टाइड्स ऑप्सिन का उपयोग करके सर्वव्यापी प्रोटीन के पाचन पर उत्पन्न होते हैं , जो15,16 को प्रोटीज के रूप में उपयोगकरतेहैं ।

यहां, हम ऑर्बिटरैप मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा इम्यूनोशुद्धि और बाद में पता लगाने का उपयोग करके डिग्ली पेप्टाइड्स के लिए समृद्ध करने के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं। विशेष रूप से नमूना तैयारी और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री चरणों में मौजूदा वर्कफ़्लो के कई संशोधनों के संयोजन का उपयोग करके, अब हम नियमित रूप से प्रोटेसोम के साथ इलाज किए गए वाघेला कोशिकाओं के एक नमूने से 23,000 से अधिक डिग्ली पेप्टाइड्स की पहचान कर सकते हैं अवरोधक और अनुपचारित हेला कोशिकाओं से ~ 10,000। हमने सेल कल्चर (SILAC) में अमीनो एसिड के साथ अवेलेबल और स्थिर आइसोटोप लेबलिंग दोनों से लाइसेट्स के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू किया है, साथ ही मस्तिष्क के ऊतकों जैसे एंडोजेनस नमूनों के लिए भी।

यह कार्यप्रवाह सर्वव्यापी साइटों के विश्लेषण के लिए उपकरणों के प्रदर्शनों की सूची के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त प्रस्तुत करता है ताकि गहरी सर्वव्यापकता को उजागर किया जा सके। निम्नलिखित प्रोटोकॉल कार्यप्रवाह के सभी चरणों का विस्तार से वर्णन करता है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को इरासमस एमसी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (ईडीसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. नमूना तैयारी

  1. सुसंस्कृत कोशिकाएं
    1. ब्याज की एक सेल लाइन का चयन करें (जैसे, HeLa या ऑस्टियोसारकोमा [U2OS] कोशिकाओं) और Dulbecco ंयूनतम ईगल माध्यम (DMEM) में कोशिकाओं को विकसित 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और १०० इकाइयों/mL penicillin/streptomycin के साथ पूरक ।
    2. मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स प्रयोगों के लिए, डीएमईएम में संस्कृति कोशिकाओं में आर्जिनिन और लिसिन की कमी है। माध्यम 10% dialyzed भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), १०० इकाइयों/mL पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और alanine-ग्लूटामाइन के साथ पूरक किया जाना चाहिए । या तो पारंपरिक lysine और arginine (' लाइट ' मध्यम) या lysine-8(13सी6)जोड़कर दो प्रकार के मीडिया बनाओ; 15एन2)और आर्जिनिन-10 (13सी6; 15एन4)('भारी' मध्यम), क्रमशः।
    3. प्रकाश माध्यम में कोशिकाओं के संस्कृति बैचों (यानी, अवेलेबल) और भारी माध्यम (यानी, लेबल, SILAC) विस्तार और उपचार से पहले कम से छह दोहरीकरण के लिए सुनिश्चित करें कि भारी मध्यम संस्कृति में सभी प्रोटीन भारी स्थिर आइसोटोप युक्त के साथ लेबल कर रहे है बनाने के लिए अमीनो एसिड।
    4. 8 एच के लिए कोशिकाओं को प्रोटेसोम अवरोधक बोर्टेजोमिब के 10 माइक्रोन या मॉक ट्रीटमेंट के रूप में डीएमएसओ की समकक्ष मात्रा के साथ इलाज करें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, उन्हें 1% ट्राइप्सिन/EDTA का उपयोग करके अलग करें, और कोशिकाओं को गोली दें।
    5. Lyse एक 150 सेमी2 संस्कृति प्लेट प्रति स्थिति से सेल गोली 0.5% सोडियम deoxycholate (डॉक्टर) के साथ बर्फ ठंड 50 मीटर Tris-HCl (पीएच = 8.2) के 2 मिलीएल में परीक्षण किया। लाइसेट को 5 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें और 10 मिन (सामग्रीकी तालिका में सूचीबद्ध सोनिकेटर के लिए "एच" स्थापित करना) 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। हम एन-एथिलमैमिड (एनीएम) जैसे संकोची अवरोधकों के उपयोग की सिफारिश नहीं करते हैं, क्योंकि इससे अवांछित प्रोटीन संशोधन लागू हो सकते हैं जो पेप्टाइड पहचान को जटिल बना सकते हैं।
  2. वीवो माउस मस्तिष्क ऊतक में
    1. वीवो टिश्यू में उपयोग करते समय, ऊतक को बर्फ-ठंडा बफर में ले जहाँ जिसमें 100 मीटर ट्रिस-एचसीएल (पीएच = 8.5), 12 एमएम सोडियम डीओसी और 12 एम एम सोडियम एन-लॉरोइलसारकोसिनेट17शामिल हैं। 10 मिन के लिए lysate (सामग्री की मेजमें सूचीबद्ध सोनिकेटर के लिए "एच" की स्थापना) 4 डिग्री सेल्सियस पर और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए lysate फोड़ा।
  3. एक रंगीन अवशोषित बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग कर कुल प्रोटीन राशि की मात्रा की मात्रा का पता लगाया । प्रोटीन की कुल मात्रा एक सफल डिग्ली पेप्टाइड इम्यूनोप्रिसिप्रिएशन (आईपी) के लिए कम से कम कई मिलीग्राम होनी चाहिए। SILAC प्रयोगों के लिए कुल प्रोटीन राशि के आधार पर एक 1:1 अनुपात में प्रकाश और भारी लेबल प्रोटीन मिश्रण ।
  4. 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए 5 एमएम 1,4-डिथियोथ्रेइटॉल का उपयोग करके सभी प्रोटीन को कम करें और बाद में उन्हें अंधेरे में 15 min के लिए 10 mm iodoacetamide के साथ alkylateकरें। 4 एच के लिए Lys-C (1:200 एंजाइम-टू-सब्सट्रेट अनुपात) के साथ प्रोटीन पाचन करें और इसके बाद 30 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान (आरटी) पर ट्राइप्सिन (1:50 एंजाइम-टू-सब्सट्रेट अनुपात) के साथ रात भर पाचन करें।
  5. पचाने वाले नमूने में ट्राइफ्लोरोसेटिक एसिड (टीएफए) को 0.5% की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और सभी डिटर्जेंट को कम करने और हटाने के लिए 10 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर नमूना अपकेंद्री करें। बाद के अंशके लिए पेप्टाइड्स युक्त अधिनेत लीजिए।

2. ऑफलाइन पेप्टाइड आंशिकता

  1. पॉलीमेरिक स्थिर चरण सामग्री (300 Å, 50 μM) के साथ उच्च पीएच रिवर्स-चरण (आरपी) सी18 क्रोममेटोग्राफी का उपयोग करें; ट्रिप्स की तालिकादेखें) ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स को आंशिक करने के लिए एक खाली कॉलम कारतूस में भरी हुई है। स्थिर चरण बिस्तर के आकार को आंशिक रूप से प्रोटीन डाइजेस्ट की मात्रा में समायोजित किया जाना चाहिए। ~ 10 मिलीग्राम प्रोटीन डाइजेस्ट के लिए 0.5 ग्राम स्थिर चरण सामग्री से भरा एक खाली 6 मिलीग्राम कॉलम कारतूस (सामग्रीकी तालिका देखें) तैयार करें। स्थिर चरण अनुपात को पचाने वाला प्रोटीन लगभग 1:50 (w/w) होना चाहिए।
  2. पेप्टाइड्स को तैयार कॉलम पर लोड करें और कॉलम को 0.1% टीएफए के लगभग 10 कॉलम वॉल्यूम के साथ धोएं, इसके बाद एच2ओ के लगभग 10 कॉलम वॉल्यूम हैं।
  3. पेप्टाइड्स को क्रमशः 7%, 13.5%, और 50% एसीटोनिट्रिल (एएसएन) के साथ 10 एमएम अमोनियम फोरमेट समाधान (पीएच = 10) के 10 कॉलम वॉल्यूम के साथ तीन अंशों में एलॉट करें। पूर्णता के लिए सभी अंशों को लियोफिलाइज करें।
  4. यूबीक्विटिन अवशेष आकृति (K-ε-GG) एंटीबॉडी प्रोटीन के लिए संयुग्मित का उपयोग करें, जो डिग्ली पेप्टाइड्स के इम्यूनोएनमोरिचमेंट के लिए प्रोटीन ए अगारोज मोतियों के लिए संयुग्मित है। क्योंकि मोतियों के प्रति बैच एंटीबॉडी की सही मात्रा मालिकाना जानकारी है और निर्माता द्वारा खुलासा नहीं किया गया है, इसलिए भ्रम से बचने के लिए निर्माता के रूप में मोतियों के एक बैच के लिए एक ही परिभाषा का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इन मोतियों के एक बैच 2x को पीबीएस के साथ धोएं और मनका घोल को छह बराबर अंशों में विभाजित करें। विस्तृत प्रायोगिक योजना के लिए चित्रा 1 देखें।
  5. 50 एमएम एमओपीएस, 10 एम सोडियम फॉस्फेट, और 50 एम एम एनएसीएल (पीएच = 7.2) से बना बफर के 1.4 मिलील में चरण 2.3 में एकत्र किए गए तीन पेप्टाइड अंशों को भंग करें, और मलबे को स्पिन करें।
  6. एक रोटेटर यूनिट पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए डिग्ली एंटीबॉडी मोतियों में अंशों के सुपरनेट जोड़ें और इनक्यूबेट करें। मोतियों को नीचे स्पिन करें और सुपरनेटेंट को एंटीबॉडी मोतियों के नए बैच में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए फिर से इनक्यूबेट करें।
  7. बाद के वैश्विक प्रोटेम (जीपी) विश्लेषण के लिए सुपरनेटेंट स्टोर करें।
  8. मोतियों को बनाए रखने के लिए एफएफ/एफ फिल्टर प्लग से लैस 200 माइक्रोन पिपेट टिप में हर अंश से मोतियों को स्थानांतरित करें। एक अपकेंद्रित्र टिप एडाप्टर से लैस एक 1.5 mL माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में मोतियों के साथ पिपेट टिप रखो। बर्फ के 200 μL के साथ मोती 3x धोने ठंडा आईएपी बफर और बाद में बर्फ के 200 μL के साथ 3x-ठंडा मिलीक्यू एच2ओ हर धोने के कदम से पहले 2 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कॉलम नीचे स्पिन, लेकिन सावधान रहना चाहिए कि कॉलम सूखी चलाने के लिए नहीं है । 0.15% टीएफए के 50 माइक्रोन के 2 चक्रों का उपयोग करपेप्टाइड्स को एल्यूट करें।
  9. C18 चरण टिप (मूलतः दो C18 डिस्क के साथ एक 200 μL पिपेट टिप) का उपयोग करपेप्टाइड्स को डिसाल्ट करें और वैक्यूम सेंट्रलियूजेशन का उपयोग करके पूर्णता के लिए उन्हें सुखा लें।

3. नैनोफ्लो एलसी-एमएस/एमएस

  1. नैनोफ्लो एलसी सिस्टम के साथ एक संवेदनशील मास स्पेक्ट्रोमीटर पर एलसी-एमएस/एमएस प्रयोग करें ।
  2. CSH130 राल (3.5 μm, 130 Å) के साथ पैक 75 माइक्रोन इनर व्यास के साथ एक इन-हाउस पैक 50 सेमी रिवर्स-फेज कॉलम का उपयोग करें और 300 nL/min पर 120 min पर 2−28% (AcN, 0.1% एफए) के ढाल के साथ पेप्टाइड्स को एल्यूट करें। कॉलम ओवन का उपयोग करके कॉलम को 50 डिग्री सेल्सियस पर रखें, उदाहरण के लिए (सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करें।
    1. मास स्पेक्ट्रोमीटर डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) मोड में संचालित किया जाना चाहिए। MS1 मास स्पेक्ट्रा उच्च संकल्प (जैसे, 120,000) पर एकत्र किया जाना चाहिए, एक स्वचालित लाभ नियंत्रण (एजीसी) लक्ष्य 4E5 की स्थापना और ऑर्बिटरैप मास स्पेक्ट्रोमीटर के मामले में 50 एमएस का अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ।
    2. पहले "उच्चतम तीव्रता पहले" मोड में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करें। इस तरह, सबसे तीव्र आयन को विखंडन के लिए पहले चुना जाता है, फिर दूसरा सबसे अधिक, और आगे, 3 एस के कुल चक्र समय के साथ शीर्ष गति विधि का उपयोग करके। इसके बाद, "सबसे कम तीव्रता पहले" मोड में डीडीए एमएस विश्लेषण का दूसरा दौर करें, ताकि सबसे कम तीव्र आयन पहले चुना जाए, फिर दूसरा सबसे कम, और आगे। यह रणनीति बहुत कम अपन्डेंसी पेप्टाइड्स का इष्टतम पता लगाना सुनिश्चित करती है।
    3. अग्रदूत आयनों को उनके आवेश राज्यों (2-7 शुल्क) और मोनोसोटोपिक पीक असाइनमेंट के अनुसार फ़िल्टर करें। पहले से पूछताछ की अग्रदूत ों को 60 एस के लिए गतिशील रूप से बाहर करें। 1.6 th की चौड़ाई के लिए एक क्वाड्रपोल मास फिल्टर के साथ पेप्टाइड अग्रदूत को अलग करें।
    4. 50 एमएस और एचसीडी टकराव ऊर्जा के अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ 7E3 के एजीसी में आयन जाल में MS2 स्पेक्ट्रा ले लीजिए 30%।

4. डेटा विश्लेषण

  1. एंड्रोमेडा सर्च इंजन18,19पर आधारित स्वतंत्र रूप से उपलब्ध मैक्सक्वांट सॉफ्टवेयर सुइट जैसे उपयुक्त खोज इंजन का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री कच्ची फाइलों का विश्लेषण करें । MaxQuant में, नीचे दिए गए कुछ अनुकूलनों के साथ डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का चयन करें। ट्राइप्सिन के लिए एंजाइम विशिष्टता सेट करें, जिसमें अधिकतम चूक क्लीवेज तीन तक उठाए गए हैं। एक डिग्ली अवशेष (+114.04 डीए) के साथ लाइसिन सेट करें, मेथिओनीन और एन-टर्मिनल एसीटिलेशन का ऑक्सीकरण चर संशोधनों के रूप में, और एक निश्चित संशोधन के रूप में साइस्टीन के कार्बामिडोमथाइलेशन सेट करें।
  2. उदाहरण के लिए, यूनिप्रोट भंडार(https://www.uniprot.org/downloads)को एक डिकोय और एक मानक सामान्य संदूषक डेटाबेस के साथ संयुक्त रूप से प्राप्त करने वाली फास्टा फ़ाइल के खिलाफ डेटाबेस खोजकरें जो स्वचालित रूप से MaxQuant द्वारा प्रदान किया जाता है। झूठी खोज दर (एफडीआर) को 1% तक सेट करें और संशोधित (डिग्ली) पेप्टाइड्स के लिए न्यूनतम स्कोर 40 (डिफ़ॉल्ट मूल्य) निर्धारित करें। सी-टर्मिनल डिग्ली संशोधित लाइसिन अवशेषों के साथ पहचाने गए पेप्टाइड्स को आगे के विश्लेषण से बाहर करें।
  3. SILAC प्रयोग फ़ाइलों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, गुणा को "2" और दोहराने के लिए चरण 4.2 सेट करें।
  4. मैक्सक्वांट सॉफ्टवेयर सुइट के पर्सियस मॉड्यूल20 के साथ सभी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (जैसे, सांख्यिकी, जीन ऑन्टोलॉजी विश्लेषण) करें।

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Representative Results

सर्वव्यापी प्रोटीन लक्ष्य लाइसिन अवशेषों पर एक ११४.०४ दा diglycine अवशेष छोड़ जब प्रोटीन ट्राइप्सिन के साथ पचा रहे हैं । इस आकृति के कारण बड़े पैमाने पर अंतर का उपयोग एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोग में सर्वव्यापीकरण की साइट को स्पष्ट रूप से पहचानने के लिए किया गया था। हम यहां जिस रणनीति का वर्णन करते हैं, वह नैनोफ्लो एलसी-एमएस/एमएस(चित्रा 1ए)द्वारा डिग्ली पेप्टाइड्स के संवर्धन और बाद में पहचान के लिए एक अत्याधुनिक विधि है । इस अध्ययन में, सुसंस्कृत कोशिकाओं और वीवो सामग्री दोनों को प्रोटीन के जैविक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया था, लेकिन यह प्रोटोकॉल प्रोटीन के किसी भी स्रोत के साथ संगत है। प्रोटोकॉल में चरणों के बाद 2-20 मिलीग्राम प्रोटीन इनपुट से 10,000-25,000 डिग्ली पेप्टाइड्स की पहचान करना सीधा होना चाहिए। कोशिकाओं में प्रोटीन सर्वव्यापकता की सीमा बढ़ाने के लिए, कोशिकाओं की कटाई से कुछ घंटे पहले बोर्टेजोमिब या MG132 जैसे प्रोटेकोक अवरोधक को जोड़ा जा सकता है। यदि कोई प्रोटेसोम अवरोधक का उपयोग नहीं किया गया था, तो पहचाने गए डिग्ली पेप्टाइड्स की संख्या काफी कम (30-40%) थी।

हमने मौजूदा प्रोटोकॉल में कई सुधार किए । सबसे पहले, पेप्टाइड मिश्रण की जटिलता को कम करने के लिए रिवर्स-चरण क्रोमेटोग्राफी और बाद में उच्च पीएच पर एल्यूशन के आधार पर तीन अंशों में कच्चे रंग का अंशीकरण किया जाता है। ये अंश पेप्टाइड पहचान में बहुत कम ओवरलैप दिखाते हैं, और डिग्ली पेप्टाइड्स की तुलनीय संख्या प्रति अंश(चित्रा 2)की पहचान की जानी चाहिए। इसके परिणामस्वरूप उन अंशों में से प्रत्येक में पहचाने गए अद्वितीय डिग्ली पेप्टाइड्स की उच्च संख्या होती है। महत्वपूर्ण बात, अंशों में से एक (आमतौर पर दूसरा) में सर्वव्यापकता का अपना K48 संशोधित ट्रिप्टिक डिग्ली पेप्टाइड लिफाजी (जीजी) QLEDGR (m/z 730.39) शामिल होना चाहिए। यह इम्यूनोप्रिसिपेटेड अंश में अब तक का सबसे प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड है और एलसी क्रोमेटोग्राम(चित्रा 1बी)में तीव्र और व्यापक चोटी की विशेषता है। यह एक बेंचमार्क क्रोमेटोग्राफिक पीक है और यदि यह क्रोमेटोग्राम से अनुपस्थित है तो आईपी सबसे अधिक असफल रहा।

एक और सुधार डीडीए विश्लेषण प्रक्रिया का अनुकूलन है जो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर में आयन राउटिंग मल्टीपोल है। पारंपरिक शीर्ष एन डेटा पर निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) में, MS1 स्पेक्ट्रम से एन चोटियों विखंडन के लिए चुना जाता है । यह विखंडन योजना सबसे अधिक तीव्रता शिखर पहले के साथ शुरू होती है, इसके बाद दूसरी उच्चतम तीव्रता की चोटी, और इसी तरह । एक वैकल्पिक विखंडन योजना में, सबसे कम तीव्र चोटी का चयन पहले किया जाता है, इसके बाद दूसरा सबसे कम तीव्र चोटी आदि होता है। चयन के इस आदेश के पीछे तर्क यह है कि बहुत कम प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड्स को भी खंडित करने के लिए पर्याप्त समय हो। वास्तव में, हमने पाया कि पेप्टाइड पहचान की संख्या बढ़ जाती है जब "सबसे अधिक पहले" और "सबसे कम पहले" डीडीए रन मानक डीडीए सेटिंग्स (यानी, सबसे पहले) के साथ एक डुप्लिकेट एलसी-एमएस विश्लेषण की तुलना में संयुक्त थे। अधिक व्यापक सर्वव्यापक सर्वव्यापकता प्रोफाइलिंग के लिए, इसलिए डेटा विश्लेषण प्रक्रिया में एलसी-एमएस रन को "उच्चतम पहले" और "सबसे कम पहले" विखंडन व्यवस्थाओं के साथ संयोजित करने की सिफारिश की जाती है। यह "सबसे कम पहली" रणनीति अतिरिक्त 4,000 अद्वितीय डिग्ली पेप्टाइड्स से अधिक उत्पादन कर सकती है, जिसका पता तब नहीं चला जब केवल पारंपरिक डीडीए शासन का उपयोग किया गया था(चित्रा 2)।

अंत में, पहले आईपी के बाद प्रवाह के अतिरिक्त आईपी एक और ~ 2,500 अद्वितीय डिग्ली पेप्टाइड्स(चित्रा 2)का उत्पादन कर सकते हैं।

सर्वव्यापकता प्रोफाइलिंग पर साहित्य में लेख आम तौर पर लगभग 10,000 पहचाने गए डिग्ली पेप्टाइड्स12,21की रिपोर्ट करते हैं . यहां, तीन जैविक प्रतिकृति स्क्रीन पर पहचाने गए सभी डिग्ली पेप्टाइड्स में से, और जीटी;9,000 तीनों में मौजूद थे, जबकि और 17,000 तीन प्रतिकृतियों में से कम से कम दो में मौजूद थे(चित्रा 3)। आमतौर पर, यहां वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सीएसटी एंटीबॉडी मोतियों के एक मानक बैच का उपयोग करके एक 15-20 मिलीग्राम प्रोटीन नमूने से 21,000 अद्वितीय डिग्ली पेप्टाइड्स की पहचान करनी चाहिए। शुद्धता और चयनात्मकता के संदर्भ में पहचाने गए डिग्ली पेप्टाइड्स और असंशोधित पेप्टाइड्स के बीच अनुपात हमेशा और 0.5 होना चाहिए। डिग्ली पेप्टाइड पहचान की संख्या प्रोटीन इनपुट सामग्री की मात्रा पर अत्यधिक निर्भर थी। केवल 1 मिलीग्राम इनपुट सामग्री के साथ किया गया आईपी लगभग 2,500 डिग्ली पेप्टाइड पहचान का उत्पादन करता है, जबकि 10 मिलीग्राम प्रोटीन इनपुट सामग्री और gt;15,000 डिग्ली पेप्टाइड पहचान के साथ उत्पादित किया गया था। तालिका 1 प्रत्येक स्थिति के लिए पहचाने गए डिग्ली पेप्टाइड्स की अपेक्षित संख्या को सूचीबद्ध करती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ये संख्याएं केवल अनुमान हैं और उपयोग किए जाने वाले द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के प्रकार पर निर्भर करती हैं। चित्रा 4 कम, मध्यम, और इनपुट सामग्री की उच्च मात्रा के साथ डिग्ली पेप्टाइड पहचान के बीच ओवरलैप दिखाता है।

ऊपर वर्णित सर्वव्यापी साइट विश्लेषण के लिए सुधार के अतिरिक्त मूल्य को समझाने के लिए, हमने सिलाक लेबल वाले वाला कोशिकाओं का मात्रात्मक सर्वव्यापी विश्लेषण भी किया जो डुप्लीकेट लेबल स्वैप assay में अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में प्रोटेसोम अवरोधक बोर्टेजोमिब के साथ व्यवहार किया गया था। आधे से अधिक (>55%) आईपी पर एल्यूट में सभी पहचाने गए पेप्टाइड्स में से डिग्ली पेप्टाइड्स थे। 19,000 से अधिक अद्वितीय डिग्ली पेप्टाइड्स की पहचान की गई थी, जो गैर-सिलाक लेबल वाले नमूने की तुलना में केवल थोड़ा कम है। इसका कारण पेप्टाइड पीक जोड़े की उपस्थिति के कारण एक सिलाक परख में MS1 स्पेक्ट्रा की उच्च जटिलता हो सकती है। SILAC विश्लेषण में डिग्ली पेप्टाइड्स की संख्या के बीच अपेक्षाकृत बड़े अंतर देखे गए थे जिन्हें विशेष रूप से आगे की स्थिति में पहचाना गया था (यानी, भारी चैनल में बोर्टेजोमिब ने कोशिकाओं का इलाज किया, प्रकाश चैनल में कोशिकाओं को नियंत्रित किया) और विशेष रूप से रिवर्स कंडीशन में पहचाने गए (यानी, बोर्टेजोमिब ने लाइट चैनल में कोशिकाओं का इलाज किया, भारी चैनल में कोशिकाओं को नियंत्रित किया), इस मामले में 1,752 बनाम 6,356(पूरक तालिका 1)। "बहुलता = 2" (यानी, दो चैनल एसवाईएलएसी) मोड में MaxQuant सॉफ्टवेयर का संचालन करते समय, भारी चैनल (लगभग सभी रिवर्स प्रयोग में आने वाले) और प्रकाश चैनल में एक गैर-शून्य तीव्रता मूल्य में शून्य तीव्रता के साथ 7,555 डिग्ली पेप्टाइड्स की पहचान की गई थी। इसके विपरीत, हल्के चैनल में शून्य तीव्रता मूल्य के साथ भारी चैनल में गैर-शून्य तीव्रता मूल्य के साथ कोई भी डिग्ली पेप्टाइड्स की पहचान नहीं की गई थी। जब एक ही डेटा सेट पर एक MaxQuant विश्लेषण "बहुलता = 1" मोड में किया गया था जिसमें डिग्ली मोईटी और लेबल वाले अमीनो एसिड को एक ही चर संशोधन में संयुक्त किया गया था, तो कई भारी डिग्ली पेप्टाइड वेरिएंट की पहचान की गई थी, भले ही उस पेप्टाइड के किसी प्रकाश समकक्ष का पता नहीं लगाया जा सके। इसके लिए सबसे अधिक संभावना स्पष्टीकरण सॉफ्टवेयर की अक्षमता है जो विशेष रूप से भारी चैनल में मौजूद डिग्ली पेप्टाइड्स की पहचान से निपटने में है। यह घटना बड़े पैमाने पर होने की संभावना है, क्योंकि प्रोटेसोम का अवरोध उपन्यास सर्वव्यापकता साइटों के गठन को ट्रिगर करेगा। MaxQuant में "requantify" विकल्प चेक बॉक्स टिक, जो इन मुद्दों से निपटने के लिए विकसित किया गया था और इसके लिए सही करना चाहिए, इस मुद्दे से बचने के लिए पूरी तरह से अपर्याप्त लगता है । जाहिर है, डिग्ली पेप्टाइड्स के सुदूर बहुमत को अपरेच किया जा रहा है या प्रोटेसोम अवरोध पर डी नोवो का गठन किया जा रहा है, क्योंकि पेप्टाइड पूल के दो तिहाई से अधिक में कम से कम 1.5(चित्रा 5बी)के एच: एल अनुपात हैं।

अंत में, हमने इस सर्वव्यापकता साइट विश्लेषण विधि को वीवो ऊतक नमूने में लागू किया। प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए, हमने ताजा माउस मस्तिष्क से लगभग 32 मिलीग्राम प्रोटीन निकाला (गीले ऊतक वजन का ~ 10% प्रोटीन है)। मस्तिष्क सामग्री को प्रोटेसोम अवरोधकों या किसी अन्य अभिकर्ता के साथ इलाज नहीं किया गया था जो समग्र प्रोटीन सर्वव्यापकता को बढ़ावा दे सकता है। इस नमूने से 10,871 अद्वितीय डिग्ली पेप्टाइड्स(सप्लीमेंट्री टेबल 2)की पहचान की गई। इस ऊतक में पहचाने गए सभी डिग्ली पेप्टाइड्स एक स्थिर-राज्य की स्थिति में सर्वव्यापी की गहरी साइटों से उत्पन्न हुए। वैश्विक सर्वव्यापकता (उदाहरण के लिए, प्रोटेसोम अवरोध) को बढ़ावा देने के लिए कोई उपचार नहीं लगाया गया था। इसलिए हम परिकल्पना करते हैं कि ये सर्वव्यापकता साइटें कम से कम आंशिक रूप से उत्पन्न होती हैं (पॉली) सर्वव्यापीकरण जो गैर-प्रोटेयक मध्यस्थता सेलुलर सिग्नलिंग घटनाओं में शामिल है, जो साहित्य5,,16,,22में प्रस्तावित विचारों के साथ समझौते में है।

निष्कर्ष में, यहां वर्णित विधि एक पुन: उत्पन्न तरीके से सर्वव्यापकता की गहराई से खोज के लिए अनुमति देता है। इस प्रक्रिया के साथ प्राप्त विशिष्ट परिणामों के अवलोकन के लिए वैन डेर वाल एट अल23देखें।

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक अवलोकन। (क)प्रायोगिक दृष्टिकोण का अवलोकन। नमूने तैयार किए गए, ट्रिपसिनकिया, और उच्च पीएच elution के साथ रिवर्स चरण क्रोमेटोग्राफी का उपयोग कर तीन अंशों में आंशिक । वाणिज्यिक α-diGly पेप्टाइड एंटीबॉडी मोतियों का एक बैच छह बराबर अंशों में विभाजित किया गया था और तीन पेप्टाइड अंश ों को फिर मनका अंशों में से तीन पर लोड किया गया था। डिग्ली पेप्टाइड्स को इम्यूनोप्यूरीफाइड, एल्यूट और एकत्र किया गया था, और प्रवाह के माध्यम से बाद में तीन शेष ताजा मोतियों के अंशों में स्थानांतरित कर दिया गया था। एकत्र किए गए डिग्ली पेप्टाइड्स का विश्लेषण एक लुमोस ऑर्बिटरैप मास स्पेक्ट्रोमीटर पर मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा एक चक्र के संयोजन वाली दो स्तरीय योजना के अनुसार किया गया था जिसमें सबसे तीव्र चोटियों को पहले पेप्टाइड विखंडन के लिए चुना गया था और अगले चक्र जिसमें सबसे कम तीव्र चोटियों को पहले चुना गया था। इसके बाद मैक्सक्वांट का इस्तेमाल करते हुए एनएलसी-एमएस/एमएस रन का पूरा सेट विश्लेषण किया गया । (ख)एक अंश में सर्वव्यापकता का अपना K48 संशोधित ट्राइप्टिक डिग्ली पेप्टाइड लिफाक (जीजी) QLEDGR (m/z 730.39) होना चाहिए। यह इम्यूनोप्रीसिपेटेड अंश में अब तक का सबसे प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड है और 120 मिनट के ढाल पर 50-55 मिनट के बीच एलसी क्रोमेटोग्राम में तीव्र और व्यापक चोटी की विशेषता थी। यदि यह बेंचमार्क पीक क्रोमेटोग्राम से अनुपस्थित है तो आईपी सबसे अधिक असफल रहा। इस आंकड़े को वान डेर वाल एट अल23से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: तीन सुधार चरणों में से प्रत्येक के लिए गिग्ली पेप्टाइड्स की संख्या का पता चला। (क)इम्यूनोप्रिसिप्रिशन से पहले क्रूड के आंशिकता का प्रभाव । तीन अलग-अलग अंशों में पहचानी गई डिग्ली पेप्टाइड आबादी के बीच ओवरलैप दिखाया गया है। (ख)पहली और दूसरी ऊष्मायन चरणों का प्रभाव। (ग)समायोजित पेप्टाइड विखंडन व्यवस्था के परिणाम। इस आंकड़े को वान डेर वाल एट अल23से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पिग्ली पेप्टाइड्स का पता चला बोरटेजोमिब की तीन जैविक प्रतिकृति में पता चला कि रनों के बीच ओवरलैप की मात्रा दिखाते हुए कोशिकाओं का इलाज किया जाता है। इस आंकड़े को वान डेर वाल एट अल23से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कम (4 मिलीग्राम), मध्यम (10 मिलीग्राम), और उच्च (40 मिलीग्राम) कुल प्रोटीन इनपुट मात्रा के साथ विश्लेषण से पहचाने गए डिग्ली पेप्टाइड्स का ओवरलैप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: SILAC लेबल कोशिकाओं में डिग्ली पेप्टाइड्स का पता लगाना। (A)एसवाईएलएसी लेबल वाले वाला कोशिकाओं की अग्रजातीय तांडव में पता लगाए गए पेप्टाइड्स की संख्या 1 और 2 । (ख)बोर्टेजोमिब (Btz) में डिग्ली पेप्टाइड सिलाक अनुपात के स्कैटरप्लॉट ने वाला कोशिकाओं का इलाज किया । केवल पेप्टाइड्स जिन्हें आगे और रिवर्स दोनों प्रयोगों में पहचाना और निर्धारित किया गया था, दिखाए गए हैं। इस आंकड़े को वान डेर वाल एट अल23से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हालत इनपुट सामग्री की मात्रा (मिलीग्राम) पहचानकी गई डिग्ली पेप्टाइड्स की संभावित संख्या
अनुपचारित हेला कोशिकाएं 10 7,500
प्रोटेसोम अवरोधक ने हेला कोशिकाओं का इलाज किया 1 2,500
2 5,000
10 15,000
20 20,000
40 25,000
ऊतक (माउस मस्तिष्क) 30 10,000

तालिका 1: विभिन्न स्थितियों के लिए डिग्ली पेप्टाइड पहचान की अपेक्षित संख्या। ये संख्याएं केवल अनुमान हैं और उपयोग की जाने वाली प्रायोगिक सेटिंग्स पर निर्भर करती हैं।

अनुपूरक तालिका 1। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न जैविक स्रोतों, जैसे सुसंस्कृत कोशिकाओं और वीवो ऊतक में नमूनों पर लागू किया गया था । सभी मामलों में हमने हजारों डिग्ली पेप्टाइड्स की पहचान की, बशर्ते कि कुल प्रोटीन इनपुट राशि कम से कम 1 मिलीग्राम थी। विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके संवर्धन अत्यधिक कुशल है, यह देखते हुए कि यदि सर्वव्यापी प्रोटीन या डिग्ली पेप्टाइड्स के लिए कोई संवर्धन प्रक्रिया लागू नहीं की गई तो केवल सबसे कम 100-150 बहुत कम प्रचुर मात्रा में डिग्गी पेप्टाइड्स की पहचान पूरे सेल लाइसेट्स से की गई थी। जाहिर है, संवेदनशील जन स्पेक्ट्रोमेट्री डिग्ली पहचान की उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए एक शर्त है । यद्यपि हमने कई अलग-अलग द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर का सफलतापूर्वक उपयोग किया है, हमने ऑर्बिटरैप ट्रिब्रिड लुमोस को सबसे संवेदनशील पाया जिसने उच्चतम पैदावार दी।

आईपी किए जाने से पहले हाई पीएच एल्यूशन के साथ ऑफलाइन आरपी क्रोमेटोग्राफी की जांच की जानी चाहिए। पेप्टाइड पहचान के संदर्भ में अंशों के बीच ओवरलैप एक इष्टतम प्रयोग के लिए जितना संभव हो उतना कम होना चाहिए। आईपी के बाद, अंशों में से एक में सर्वव्यापकता का अपना K48 संशोधित ट्राइप्टिक डिग्ली पेप्टाइड लिफाक (जीजी) QLEDGR (m/z 730.39) शामिल होना चाहिए। यह इम्यूनोप्रीसिपेटेड अंश में अब तक का सबसे प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड है और 120 मिनट के ढाल(चित्रा 1बी)पर 50-55 मिनट के बीच एलसी क्रोमेटोग्राम में तीव्र और व्यापक चोटी की विशेषता है। यदि यह बेंचमार्क पीक क्रोमेटोग्राम से अनुपस्थित है, तो आईपी सबसे अधिक असफल होने की संभावना थी।

आईपी प्रक्रिया के तुरंत बाद इम्यूनोप्रिसिपेटेड डिग्ली ट्रिप्टिस्टिक पेप्टाइड्स का विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है, इसलिए आईपी और विश्लेषण के बीच का समय न्यूनतम रखा जाना चाहिए। उस समय के दौरान, पेप्टाइड्स को अधिमानतः प्लास्टिक ट्यूबों के बजाय कांच की शीशी में संग्रहित किया जाना चाहिए। बहुत लंबे समय के लिए प्लास्टिक ट्यूबों में पेप्टाइड्स छोड़ना, या तो आरटी पर या-20 डिग्री सेल्सियस पर, पेप्टाइड्स की वर्षा और/या प्लास्टिक ट्यूब की दीवार से चिपके हुए हो सकता है । यह अंततः विश्लेषण की संवेदनशीलता को प्रभावित करेगा।

यद्यपि साहित्य में उनके समान 114.04 डीए द्रव्यमान परिवर्तन24के कारण सर्वव्यापकता स्थलों के रूप में iodoacetamide एडडक्टकी संभावित गलत व्याख्या के बारे में रिपोर्ट ें आई हैं, लेकिन हमें इम्यूनोप्रिसिपेटेड ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स की अपनी तैयारियों के साथ इसका कोई संकेत नहीं मिला है। सबसे पहले, ऊपर वर्णित एल्किलेशन-रिडक्शन प्रोटोकॉल का उपयोग करके iodoacetamide (IAM) का उपयोग करने के दुष्प्रभाव हमारे हाथों में कम हैं। दूसरा, एंटीबॉडी एक डिग्लाइसिन अवशेष के साथ पेप्टाइड्स के लिए विशिष्ट है। लाइसिन अवशेषों में दो iodoacetamide moieties के साथ पेप्टाइड्स को इस प्रोटोकॉल में समृद्ध नहीं किया जाना चाहिए। तीसरा, इम्यूनोप्रीसिपेटेड अंश में पेप्टाइड्स के बहुमत को प्रोटेसोम अवरोध पर अपरेच किया जाता है, जैसा कि ऊपर वर्णित सिलाक प्रयोग(चित्र5)पर उदाहरण दिया जाता है। क्योंकि इस उपचार के परिणामस्वरूप सर्वव्यापी प्रोटीन की आबादी प्रभावित होती है, इसलिए इस बात की बहुत संभावना है कि ये प्रभावित पेप्टाइड्स वास्तव में सर्वव्यापी प्रोटीन के परिणामस्वरूप डिग्ली पेप्टाइड्स हैं।

अंत में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग टीएमटी19का उपयोग करके हाल ही में प्रकाशित मल्टीप्लेक्समात्र रणनीति के संयोजन में किया जा सकता है। जाहिर है, हालांकि प्रकाशित डिग्ली पेप्टाइड संख्या वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त लोगों की तुलना में कुछ कम कर रहे हैं, अपेक्षाकृत 16 नमूनों को एक साथ मात्रा निर्धारित करने की क्षमता एक बड़ा फायदा है । इन तरीकों के संयोजन से शोधकर्ताओं को बड़े पैमाने पर मात्रात्मक सर्वव्यापकता अध्ययन करने की अनुमति मिलेगी।

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Disclosures

लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

यह काम परियोजना "काम पर प्रोटीन" का हिस्सा है, नीदरलैंड प्रोटेओमिक्स सेंटर के एक कार्यक्रम के राष्ट्रीय रोडमैप बड़े पैमाने पर अनुसंधान सुविधाओं (परियोजना संख्या १८४.०३२.२०१ के भाग के रूप में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO) द्वारा वित्त पोषित ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithioerythritol Sigma-Aldrich D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks Supelco 66883-U product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate Sigma-Aldrich 70221
Bortezomib UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 34869
DMEM ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200 ThermoFisher
FBS Gibco
GF/F filter plug Whatman 1825-021
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125
Lysine, Arginine Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC) Wako Pure Chemicals 129-02541
NanoLC oven MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma-Aldrich L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher / Pierce 23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles Agilent Technologies PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit Cell Signaling Technologies 5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge Waters WAT036790 Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
Tris-base Sigma-Aldrich T6066
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Trypsin, TPCK Treated ThermoFisher 20233

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References

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Bezstarosti, K., van der Wal, L., Demmers, J. A. A. Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e59079, doi:10.3791/59079 (2020).

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