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Biochemistry

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

doi: 10.3791/59079 Published: March 23, 2020

Summary

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

Abstract

작은 단백질 유비퀴틴에 의한 단백질의 번역 후 변형은 많은 세포 이벤트에서 관여한다. 유비퀴틴화된 단백질의 트리펩티드 소화 후, 리신의 엡실론 아미노 그룹('K-θ-디글리신' 또는 단순히 'diGly')에 컨쥬게이징된 디글리신 잔재를 함유한 펩티드를 원래의 수정 부위를 추적하는데 사용할 수 있다. 질량 분석법에 의한 민감한 검출과 결합된 diGly 펩티드의 효율적인 면역정화는 현재까지 확인된 유비퀴틴화 부위의 수가 크게 증가하였다. 우리는 농축 절차 이전에 펩타이드의 오프라인 높은 pH 역상 분획및 이온 라우팅 멀티폴에 보다 진보된 펩티드 단편화 설정을 포함하는 이 워크플로우를 몇 가지 개선했습니다. 또한, 항체 비드를 보유하기 위해 필터 기반 플러그를 사용하여 시료를 보다 효율적으로 정리하면 diGly 펩티드에 대한 더 큰 특이성을 초래한다. 이러한 개선은 인간 자궁 경부암 세포 (HeLa) 세포에서 23,000 개 이상의 diGly 펩티드의 일상적인 검출을 초래하여 세포에서 프로테아좀 억제에 따라 용해됩니다. 우리는 몇몇 다른 세포 모형및 두뇌 조직과 같은 생체 내 견본의 보편성 프로파일의 심층 분석을 위한 이 전략의 효험을 보여줍니다. 이 연구는 깊은 세포 유비퀴티노메를 밝히기 위해 단백질 유비퀴틴 분석을 위한 도구 상자에 원래 추가된 것을 제시합니다.

Introduction

단백질에 유비퀴틴의 융합은 프로테아솜에 의한 분해를 표시하고 프로테오스타증에서 중요한 과정입니다. 유비퀴틴의 C 말단 카르복실 그룹은 표적 단백질1,,2의리신 θ-아미노 기와 이소펩티드 결합을 형성한다. 또한, 유비퀴틴은 다른 유비퀴틴 모듈에 부착될 수 있으며, 이로 인해 균질한(즉, K48 또는 K11) 또는 분기(즉, 이질성 또는 혼합) 폴리유비퀴틴구조1,,3의형성을 초래한다. 유비퀴틴의 가장 잘 알려진 기능은 K48 연결 폴리유비퀴틴에 의해 매개된 프로테소말 분해에서의 역할입니다. 그러나, 모노-뿐만 아니라 polyubiquitination 또한 proteasome에 의한 분해와 무관하게 많은 프로세스에서 역할을 한다는 것이 분명해졌습니다. 예를 들어, K63 연결 체인은 세포 내 인신 매매, 리소좀 분해, 키나아제 신호 및 DNA 손상 반응4,,5에서비분해적 역할을 합니다. 다른 6개의 연계 유형은 덜 풍부하고 그들의 역할은 여전히 대체로 수수께끼이지만, 세포에서의 기능에 대한 첫 번째 징후가 나타나고 있지만, 주로 링크지 별검출을가능하게하는 새로운 도구의 개발로 인해 6,7.

질량 분석법은 프로테오메 분석을 위한 필수 도구가 되었으며, 오늘날 거의 모든 생물학적 공급원으로부터 수천 개의 다른 단백질이 단일 실험에서 확인될 수 있습니다. 복잡성의 추가 층은 단백질 활동을 조절할 수 있는 단백질의 번역 후 수정 (PTM)에 의해 제시됩니다 (예를 들어, 인산화, 메틸화, 아세틸화 및 유비퀴틴화). PTM 베어링 단백질의 대규모 식별은 질량 분석 분야의 개발에 의해 가능하게 되었습니다. PTM을 함유하는 펩티드의 상대적으로 낮은 화학적 분석은 수정되지 않은 펩티드에 비해 기술적 과제를 제시하며, 질량 분석 분석 이전에 는 생화학적 농축 단계가 일반적으로 필요하다. 지난 2년 동안 PTM 분석을 위해 여러 가지 특정 농축 방법이 개발되었습니다.

세포에서 단백질 유비퀴틴화의 다각적인 역할 때문에, 단백질 에 대한 유비퀴틴화 부위의 검출을 위한 분석 방법의 개발에 대한 수요가 매우 크다8. 질량 분광 방법의 적용은 과일 플라이, 마우스, 인간 및 효모 단백질9,,10,,11,,12,,13,,14에서확인 된 유비퀴틴 화 부위의 수의 폭발로 이어졌다. 주요 단계는 K-θ-GG 잔여 모티프('디글리신' 또는 'diGly'라고도 함)에 대한 항체를 사용하여 펩타이드 수준에서 면역 침전 기반 농축 전략의 개발에 의해 제시되었다. 이들 디글리 펩티드는 프로테아제15,,16으로서트립신을 사용하여 유비퀴틴화 단백질의 소화시 생산된다.

여기서, 우리는 Orbitrap 질량 분광법에 의한 면역 정화 및 후속 검출을 사용하여 diGly 펩티드를 풍부하게 하는 최적화된 워크플로우를 제시합니다. 특히 시료 전처리 및 질량 분석 단계에서 기존 워크플로우의 여러 변형을 조합하여 proteasome로 처리된 HeLa 세포의 단일 샘플에서 23,000개 이상의 diGly 펩타이드를 일상적으로 식별할 수 있습니다. 억제제 및 치료되지 않은 HeLa 세포로부터 ~10,000. 우리는 세포 배양에 있는 아미노산으로 표지되지 않은 안정한 동위원소 표지둘 다에서 용해하기 위하여 이 프로토콜을 적용했습니다 (SILAC) HeLa 세포를 표지하고 두뇌 조직과 같은 내인성 견본에.

이 워크플로우는 깊은 유비퀴티노메를 발견하기 위해 유비퀴틴 사이트를 분석하기 위한 도구의 레퍼토리에 귀중한 추가를 제공합니다. 다음 프로토콜은 워크플로의 모든 단계를 자세히 설명합니다.

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Protocol

여기에 설명된 모든 방법은 에라스무스 MC의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(EDC)에 의해 승인되었습니다.

1. 견본 준비

  1. 배양 된 세포
    1. 관심 있는 세포주(예: HeLa 또는 골육종 [U2OS] 세포)를 선택하고 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS)과 100 단위/mL 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 덜베코의 최소 독수리 배지(DMEM)에서 세포를 성장시다.
    2. 정량적 프로테오믹스 실험의 경우, DMEM의 배양 세포는 아르기닌과 리신이 결여되어 있다. 배지는 10% 투석소 혈청(FBS), 100 단위/mL 페니실린/스트렙토마이신, 알라닌 글루타민으로 보충되어야 합니다. 기존의 리신과 아르기닌('Light' Medium) 또는 리신-8(13C136)을 추가하여 두 가지 유형의 미디어를 만드십시오. 15N2)및 아르기닌-10(13C6; 15N4)('헤비 미디엄') 각각.
    3. 광배지(즉, 표지되지 않은) 및 중형배지(즉, 표지되지 않은 SILAC)에서 세포의 배양 배치를 확장 및 치료 전에 적어도 6배 이상 배배화하여 중형 배양내의 모든 단백질이 무거운 안정동위원소로 표지되도록 한다. 아미노산.
    4. 프로테아좀 억제제 보르테조미브의 10 μM 또는 DMSO의 동등한 부피를 모의 처리로서 8시간 동안 치료한다. PBS로 세포를 세척, 그들을 사용하여 해리 1% 트립신 / EDTA, 세포를 펠릿.
    5. 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트(DOC)를 가진 얼음-차가운 50 mM Tris-HCl(pH=8.2)의 2 mL에서 시험된 조건당 150 cm2 배양판으로부터 세포 펠릿을 분해한다. 용해액을 95°C에서 5분간 끓이고 10분 동안 초음파 처리합니다(재료 표에열거된 초음파 처리기의 경우 "H"를 4°C에서 설정). 우리는 N-에틸 말레미드 (NEM)와 같은 듀비퀴티나제 억제제의 사용을 권장하지 않습니다, 이것은 펩티드 식별을 복잡하게 할 수있는 원치 않는 단백질 수정을 소개 할 수 있기 때문에.
  2. 생체 내 마우스 뇌 조직
    1. 생체내 조직을 사용하는 경우, 100 mM Tris-HCl(pH=8.5), 12 mM 나트륨 DOC 및 12 mM 나트륨 N-라우로일사르코시네이트17을함유하는 얼음-차가운 완충액으로 조직을 용해시낸다. 4 °C에서 10 분 동안 용해 (재료 의 테이블에나열된 초음파 에 대한 "H"설정)에 대한 용해를 4 °C에서 5 분 동안 끓인다.
  3. 대색 흡광도 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 량을 정량화합니다. 단백질의 총량은 성공적인 디글리 펩티드 면역 침전(IP)을 위해 적어도 몇 밀리그램이어야 한다. SILAC 실험의 경우 총 단백질 량에 따라 1:1 비율로 가볍고 무거운 표지된 단백질을 혼합합니다.
  4. 5 mM1,4-dithiothreitol을 사용하여 50 °C에서 30 분 동안 모든 단백질을 줄이고 그 후 어둠 속에서 15 분 동안 10 mM 요오도 아세타미드로 알킬레이트하십시오. Lys-C(1:200 효소 대 기질 비율)로 단백질 소화를 수행한 다음 30°C 또는 실온(RT)에서 트립신(1:50 효소 대 기질 비율)으로 밤새 소화합니다.
  5. 소화된 시료에 트리플루오로아세트산(TFA)을 0.5%의 최종 농도로 추가하고 모든 세제를 침전시키고 제거하기 위해 10,000 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 후속 분획을 위해 펩티드를 함유하는 상상급체를 수집한다.

2. 오프라인 펩타이드 분획

  1. 고판기 역상(RP) C18 크로마토그래피를 중합체 고정상 재료(300 Å, 50 μM; 재료 표참조)를 빈 컬럼 카트리지에 적재하여 트립틱 펩타이드를 분별합니다. 고정상 침대 크기는 분별될 단백질 소화량으로 조정되어야 합니다. 0.5 g의 고정상 재료로 채워진 빈 6 mL 컬럼 카트리지(재료 참조)를 준비하여 ~ 10 mg의 단백질 다이제스트를 준비합니다. 고정상 비율에 단백질 소화는 대략 1:50 (w/w)이어야 합니다.
  2. 준비된 컬럼에 펩티드를 로드하고 0.1% TFA의 약 10개의 컬럼 부피로 컬럼을 세척하고, 그 다음에H2O의 약 10개의 컬럼 부피를 갖는다.
  3. 펩티드를 각각 7%, 13.5%, 50% 아세토니트릴(AcN)으로 10 mMM 암모늄 포메이트 용액(pH= 10)의 10개의 컬럼 부피를 가진 3개의 분획으로 용해시. 모든 분수를 완전하게 사용자 지정합니다.
  4. 유비퀴틴 잔여 모티프(K-θ-GG) 항체를 사용하여 단백질A아가로즈 비드를 diGly 펩티드의 면역농축에 공액화한다. 구슬의 배치 당 항체의 정확한 양은 독점 정보이며 제조업체에 의해 공개되지 않기 때문에, 혼동을 피하기 위해 제조 업체와 같은 비드 배치에 대해 동일한 정의를 사용하는 것이 좋습니다. 이 비드 의 한 배치를 PBS로 2x로 씻고 비드 슬러리를 6 개의 동일한 분획으로 나눕습니다. 자세한 실험 계획은 그림 1을 참조하십시오.
  5. 50 mM MOPS, 10 mM 나트륨 인산염 및 50 mM NaCl (pH = 7.2)으로 구성된 완충액의 2.3 단계에서 수집 된 3 개의 펩티드 분획을 용해시키고 파편을 스핀 다운합니다.
  6. 분획물의 상피제를 diGly 항체 비드에 첨가하고 회전기 유닛상에서 4°C에서 2시간 동안 배양한다. 구슬을 스핀 다운하고 상급체를 항체 비드의 신선한 배치로 옮기고 4 °C에서 2 시간 동안 다시 배양합니다.
  7. 후속 글로벌 프로테오메(GP) 분석을 위해 상급자를 저장합니다.
  8. 구슬을 유지하기 위해 GF/F 필터 플러그가 장착된 200 μL 파이펫 팁으로 모든 분획에서 구슬을 옮김을 전달합니다. 비드와 함께 파이펫 팁을 원심 분리팁 어댑터가 장착된 1.5mL 마이크로원심지 튜브에 넣습니다. 얼음 차가운 IAP 완충액 200 μL로 구슬을 3x 세척하고 그 후 200 μL의 얼음 차가운 밀리Q H2O. 모든 세척 단계 전에 2 분 동안 200 x g에서 열을 아래로 회전시키지 만 열이 건조하지 않도록주의하십시오. 0.15% TFA의 50 μL의 2 사이클을 사용하여 펩티드를 용해.
  9. C18 단계 팁 (본질적으로 2 개의 C18 디스크가있는 200 μL 파이펫 팁)을 사용하여 펩티드를 탈염시키고 진공 원심 분리를 사용하여 완전성을 위해 건조시십시오.

3. 나노 플로우 LC-MS / MS

  1. 나노 흐름 LC 시스템에 결합된 민감한 질량 분석기에서 LC-MS/MS 실험을 수행합니다.
  2. CSH130 수지(3.5 μm, 130 Å)로 포장된 75 μm 내경을 가진 50cm 반상 열이 있는 사내 포장된 반상 컬럼을 사용하고, 300 nL/min에서 120분 이상 2-28%(AcN, 0.1% FA)의 그라데이션으로 펩티드를 용출할 수 있습니다. 예를 들어 컬럼 오븐을 사용하여 컬럼을 50°C로 유지합니다(재료 참조).
  3. 질량 분석 분석을 수행합니다.
    1. 질량 분석기는 데이터 종속 수집(DDA) 모드에서 작동해야 합니다. MS1 질량 분석기는 Orbitrap 질량 분석기의 경우 자동 게인 제어(AGC) 목표 설정이 4E5이고 최대 주입 시간이 50ms인 고해상도(예: 120,000)로 수집되어야 합니다.
    2. 먼저 "최고 강도 우선" 모드에서 질량 분석 분석을 수행합니다. 이렇게, 가장 강렬한 이온은 조각화를 위해 먼저 선택되고, 그 다음에 두 번째로 높은, 등등, 총 사이클 시간 3초를 가진 최고 속도 방법을 사용한다. 그런 다음 "가장 낮은 강도 첫 번째" 모드에서 두 번째 DDA MS 분석을 수행하여 가장 적은 강도의 이온을 먼저 선택한 다음 두 번째로 낮은 이온을 선택합니다. 이 전략은 매우 낮은 분하 펩티드의 최적의 검출을 보장합니다.
    3. 전하 상태(2-7회 충전) 및 단일 동위원소 피크 할당에 따라 전구체 이온을 필터링합니다. 60s. 4중 대질량 필터로 1.6Th의 폭으로 설정된 펩티드 전구체를 동적으로 심문한 전구체를 제외합니다.
    4. 최대 사출 시간 50ms및 HCD 충돌 에너지 30%로 7E3의 AGC에서 이온 트랩에서 MS2 스펙트럼을 수집합니다.

4. 데이터 분석

  1. 안드로메다 검색 엔진18,,19에기초하여 자유롭게 사용할 수 있는 MaxQuant 소프트웨어 제품군과 같은 적절한 검색 엔진을 사용하여 질량 분석 원시 파일을 분석한다. MaxQuant에서 아래에 표시된 몇 가지 적응이 있는 기본 설정을 선택합니다. 누락 된 절단의 최대 수를 3으로 제기하여 트립신에 효소 특이성을 설정합니다. diGly 잔재 (+114.04 Da), 메티오닌 및 N 말단 아세틸화의 산화를 가변 변형으로 설정하고, 시스테인의 카르바미도메틸화를 고정 된 수정으로 설정합니다.
  2. 예를 들어, Uniprot 저장소(https://www.uniprot.org/downloads)와 결합된 Uniprot저장소(https://www.uniprot.org/downloads)에서다운로드한 단백질 서열을 포함하는 FASTA 파일에 대한 데이터베이스 검색을 MaxQuant에서 자동으로 제공하는 표준 공통 오염 데이터베이스와 결합합니다. 거짓 발견 률(FDR)을 1%로 설정하고 수정된(diGly) 펩티드에 대한 최소 점수를 40(기본값)으로 설정합니다. 추가 분석으로부터 C-말단 diGly 변형 된 라이신 잔기로 확인된 펩티드를 배제한다.
  3. SILAC 실험 파일의 정량적 분석을 위해 복합성을 "2"로 설정하고 4.2단계를 반복합니다.
  4. MaxQuant 소프트웨어 제품군의 Perseus 모듈20을 사용하여 모든 다운스트림 분석(예: 통계, 유전자 온톨로지 분석)을 수행합니다.

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Representative Results

유비퀴틴화 단백질은 단백질이 트립신으로 소화될 때 대상 리신 잔류물 위에 114.04 Da 디글리신 잔재를 남깁니다. 이 모티프에 의한 질량 차이는 질량 분석 실험에서 유비퀴틴화 부위를 명확하게 인식하는 데 사용되었습니다. 여기서 설명하는 전략은 나노흐름 LC-MS/MS에 의한 diGly 펩티드의 농축 및 후속 식별을 위한 최첨단방법(그림 1A)입니다. 본 연구에서, 배양된 세포와 생체 내 물질 모두 단백질의 생물학적 공급원으로 사용되었지만, 이 프로토콜은 단백질의 임의의 공급원과 호환된다. 프로토콜의 단계에 따라 단백질 입력의 2-20 mg에서 10,000-25,000 diGly 펩티드를 확인하는 것이 간단해야한다. 세포에서 단백질 유비퀴틴화의 정도를 증가시키기 위해, 보르테조미브 또는 MG132와 같은 프로테아좀 억제제는 세포를 수확하기 몇 시간 전에 첨가될 수 있다. 프로테아좀 억제제가 사용되지 않은 경우, 확인된 디글리 펩타이드의 수는 현저히 낮은 경향(30-40%).

기존 프로토콜을 몇 가지 개선했습니다. 먼저, 고pH에서의 역상 크로마토그래피 및 후속 용출에 기초한 3개의 분획으로의 조분획은 펩티드 혼합물의 복잡성을 감소시키기 위해 수행된다. 이들 분획은 펩티드 식별에서 매우 낮은 중첩을 나타내며, 비교 가능한 수의 diGly 펩티드는 분획당 식별되어야한다(도 2). 이것은 그 분획의 각각에서 확인된 유일한 diGly 펩티드의 높은 수의 결과. 중요한 것은, 분획물 중 하나(전형적으로 두 번째)는 유비퀴틴의 자체 트립티펩티드 LIFAGK(GG)QLEDGR(m/z 730.39)을 함유해야 한다. 이는 지금까지 면역침전분획에서 가장 풍부한 펩티드이며 LC 크로마토그램에서 강렬하고 넓은 피크를 특징으로한다(도 1B). 이것은 벤치 마크 크로마토 그래피 피크이며 크로마토그램에서 결석한 경우 IP가 가장 실패했을 가능성이 큽니다.

또 다른 개선은 DDA 분석 절차의 적응은 질량 분석기에서 이온 라우팅 멀티폴입니다. 기존의 Top N 데이터 의존적 수집(DDA)에서, MS1 스펙트럼으로부터의 N 피크는 단편화를 위해 선택된다. 이 조각화 방식은 가장 높은 강도의 피크로 시작하여 두 번째로 높은 강도의 피크다음으로 시작합니다. 대체 조각화 방식에서 가장 강렬한 피크가 먼저 선택되고 두 번째로 가장 강렬한 피크 등이 뒤따릅니다. 선택의 이 순서뒤에 근거는 또한 아주 낮은 풍부한 펩티드를 단편화하기 위하여 충분한 시간이 있다는 것입니다. 실제로, 우리는 표준 DDA 설정 (즉, 가장 높은 첫 번째)와 중복 LC-MS 분석에 비해 "가장 높은 첫 번째"와 "가장 낮은 첫 번째"DDA 실행이 결합 되었을 때 펩티드 식별의 수가 증가한다는 것을 발견했습니다. 보다 포괄적인 유비퀴티노메 프로파일링을 위해 LC-MS 실행을 데이터 분석 절차에서 "가장 먼저" 및 "가장 낮은 첫 번째" 조각화 체제와 결합하는 것이 좋습니다. 이러한 "최저 제1" 전략은 종래의 DDA 정권이 사용되었을 때만 검출되지 않은 4,000개 이상의 고유 디글리 펩티드를 추가로 생성할 수있다(도 2).

마지막으로, 제1 IP 후의 유동에 대한 추가IP의 또 다른 ~2,500개의 독특한 디글리 펩티드를 생성할 수있다(도 2).

유비퀴틴 화 프로파일링에 관한 문헌의 기사는 전형적으로 약 10,000개의 확인된 diGly 펩티드12,,21을보고한다. 여기서, 3개의 생물학적 복제 스크린을 통해 확인된 모든 diGly 펩티드 중, >9,000은 모두 3개 모두에 존재하였고, >17,000는 3개의 복제물 중 적어도 2개에서 존재하였다(그림3). 전형적으로, 여기에 기술된 프로토콜에 따라 CST 항체 비드의 하나의 표준 배치를 사용하여 15-20 mg 단백질 샘플로부터 >21,000의 독특한 diGly 펩티드를 식별해야 한다. 순도 및 선택성 측면에서 식별된 diGly 펩티드와 변형되지 않은 펩티드 사이의 비율은 항상 >0.5여야 합니다. diGly 펩티드 식별의 수는 단백질 입력 물질의 양에 크게 의존했다. 약 2,500개의 diGly 펩타이드 식별을 생성한 입력 물질 1 mg으로 수행된 IP와 10 mg의 단백질 입력 물질 >15,000 diGly 펩타이드 식별이 생성되었습니다. 표 1은 각 조건에 대해 확인된 diGly 펩티드의 예상 수를 나열합니다. 이 수치는 추정치일 뿐이며 사용되는 질량 분석기의 유형에 따라 달라집니다. 도 4는 낮은, 중간 및 다량의 입력 물질로 diGly 펩티드 식별 사이의 중첩을 나타낸다.

전술한 유비퀴틴화 부위 분석에 대한 개선의 부가가치를 설명하기 위해, 우리는 또한 중복 라벨 스왑 분석에서 치료되지 않은 대조군 세포에 비해 프로테아좀 억제제 보르테조미브로 처리된 SILAC 표지된 HeLa 세포의 정량적 유비퀴티노믹 분석을 수행하였다. 절반 이상(>55%) IP에 대한 용루수에서 확인된 모든 펩티드중 디글리 펩티드를 diGly 펩티드로 하였다. 19,000개 이상의 독특한 diGly 펩티드가 확인되었으며, 이는 비 SILAC 표지 된 샘플보다 약간 적습니다. 이에 대한 이유는 펩티드 피크 쌍의 존재 로 인해 SILAC 분석에서 MS1 스펙트럼의 더 높은 복잡성일 수 있습니다. SILAC 분석에서 정방향 조건에서 독점적으로 확인된 diGly 펩티드의 수(즉, 보르테조미브 처리 된 세포는 무거운 채널에서, 대조세포는 광 채널에서 대조군 상태로 독점적으로 확인된 세포(즉, 보테조미브 처리된 세포는 광 채널에서, 무거운 채널에서 대조군 세포), 이 경우 1,752 대 6,356(보충표1). MaxQuant 소프트웨어를 "복합성 = 2"(즉, 2채널 SILAC) 모드에서 작동시킬 때, 7,555diGly 펩타이드는 무거운 채널에서 제로 강도(사실상 모든 역실험에서 오는) 및 광 채널에서 0도값이 아닌 것으로 확인되었다. 대조적으로, 광 채널에서 0강도 값을 수반하는 무거운 채널에서 비-0 강도 값으로 단일 diGly 펩티드는 확인되지 않았다. 동일한 데이터 세트에 대한 MaxQuant 분석이 하나의 가변 변형으로 결합된 diGly moiety 및 표지된 아미노산을 가진 "복합성 = 1" 모드에서 수행되었을 때, 그 펩티드의 가벼운 대응이 검출될 수 없는 경우에도 많은 무거운 디글리 펩타이드 변이체가 확인되었다. 이것에 대한 가장 가능성이 설명은 무거운 채널에 독점적으로 존재하는 diGly 펩티드의 식별에 대처하는 소프트웨어의 무능력이다. 이 현상은 프로테아좀의 억제가 새로운 유비퀴틴화 부위의 형성을 유발하기 때문에 광범위하게 발생할 가능성이 있습니다. MaxQuant에서 이러한 문제를 처리하기 위해 개발되었으며 이를 해결하기 위해 개발된 "requantify" 옵션 확인란을 선택하면 이 문제를 완전히 피하기에는 충분하지 않은 것으로 보입니다. 명백하게, diGly 펩티드의 대부분은 펩티드 풀의 3분의 2 이상이 적어도 1.5의 H:L 비율을 갖기 때문에 프로테아솜 억제에 따라 상승 조절되거나 형성되고있다(도 5B).

마지막으로, 우리는 생체 내 조직 샘플에 이 유비퀴틴화 부위 분석 방법을 적용하였다. 효과를 평가하기 위해, 우리는 신선한 마우스 뇌에서 약 32 mg의 단백질을 추출했습니다 (젖은 조직 무게의 10 %는 단백질입니다). 뇌 물질은 전반적인 단백질 유비퀴틴화를 촉진할 수 있는 프로테아좀 억제제 또는 다른 시약으로 처리되지 않았습니다. 이 샘플로부터, 10,871개의 독특한 디글리 펩티드를확인하였다(보충표 2). 이 조직에서 확인된 모든 diGly 펩티드는 꾸준한 상태 상황에서 유비퀴틴화의 내인성 부위에서 유래했습니다. 글로벌 유비퀴틴화를 촉진하는 치료법(예를 들어, 프로테아좀 억제)은 부과되지 않았다. 따라서 우리는 이러한 유비퀴틴화 부위가 적어도 부분적으로 (poly)유비퀴틴화로부터 발생한다는 가설을 세우고, 이는 문헌5,,16,,22에제안된 아이디어와 일치한다.

결론적으로, 여기에 설명된 방법은 재현 가능한 방식으로 유비퀴티노메의 심층적 인 탐구를 허용합니다. 이 절차로 얻은 일반적인 결과에 대한 개요는 Van Der Wal 외23을참조하십시오.

Figure 1
그림 1: 실험 개요. (A)실험 접근법의 개요. 샘플을 제조, 트립시니화, 높은 pH 용출을 이용한 역상 크로마토그래피를 사용하여 3개의 분획으로 분획하였다. 상업적α-diGly 펩티드 항체 비드의 1회 배치를 6개의 동등한 분획으로 분할하고 3개의 펩티드 분획을 3개의 비드 분획상에 적재하였습니다. 디글리 펩티드를 면역정제, 용출, 수집하고, 유동을 이어서 나머지 3개의 신선한 비드 분획으로 옮겼다. 수집된 diGly 펩타이드는 가장 강렬한 피크가 먼저 펩타이드 단편화를 위해 선택된 1개의 주기와 가장 가장 강렬한 피크가 먼저 선택된 다음 주기를 결합한 2단계 계획에 따라 Lumos Orbitrap 질량 분석기에서 질량 분석법에 의해 분석되었습니다. 그런 다음 MaxQuant를 사용하여 전체 nLC-MS/MS 실행 세트를 분석했습니다. (B)분획중 하나는 유비퀴틴자체의 K48 변형된 트리피티 펩티드 LIFAGK(GG)QLEDGR(m/z 730.39)을 함유해야 한다. 이것은 지금까지 면역 침전된 분획에서 가장 풍부한 펩티드이며 120 분 구배에서 50-55 분 사이의 LC 크로마토그램에서 강렬하고 넓은 피크를 특징으로했다. 이 벤치마크 피크가 크로마토그램에서 없는 경우 IP는 대부분 실패했을 가능성이 큽니다. 이 그림은 반 데르 월 외23에서수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 3가지 개선 단계 각각에 대해 검출된 디글리 펩티드의 수. (A)면역 침전 전 원유 분획 효과. 3개의 분리된 분획에서 확인된 diGly 펩티드 집단 사이의 중첩이 도시된다. (B)제 1 및 제 2 배양 단계의 효과. (C)조정된 펩타이드 단편화 정권의 결과. 이 그림은 반 데르 월 외23에서수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 보르테조미브 처리 된 세포의 3 개의 생물학적 복제에서 검출 된 DiGly 펩티드는 실행 사이의 중첩의 양을 나타낸다. 이 그림은 반 데르 월 외23에서수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 낮은 분석에서 확인 된 diGly 펩티드의 중첩 (4 mg), 중간 (10 mg), 그리고 높은 (40 mg) 총 단백질 입력 금액. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: SILAC 표지 된 세포에서 diGly 펩티드의 검출. (a)SILAC 표지된 HeLa 세포의 전진 및 역조건에서 검출된 펩티드의 수(multiplicity settings 1 및 2). (B)보르테조미브(Btz)에서 의 디글리 펩타이드 SILAC 비의 산점도는 HeLa 세포를 처리하였다. 정방향 및 역방향 실험 모두에서 확인 및 정량화된 펩티드만 이 도시됩니다. 이 그림은 반 데르 월 외23에서수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

조건 입력 재료의 양 (mg) 확인된 diGly 펩티드의 예상 수
치료되지 않은 헬라 세포 10 7,500
프로테아좀 억제제 처리 헬라 세포 1 2,500
2 5,000
10 15,000
20 20,000
40 >25,000
조직 (마우스 뇌) 30 >10,000

표 1: 상이한 조건에 대한 diGly 펩티드 식별의 예상 수. 이 숫자는 추정치일 뿐이며 사용된 실험 설정에 따라 달라집니다.

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Discussion

여기서 기재된 프로토콜은 배양된 세포 및 생체내 조직과 같은 다양한 생물학적 공급원으로부터의 샘플에 적용되었다. 모든 경우에 우리는 diGly 펩티드의 수천을 확인, 총 단백질 입력 량이 적어도 이었다는 것을 제공 1 mg. 특이적 항체를 이용한 농축은 유비퀴틴화 단백질 또는 diGly 펩티드에 대한 농축 절차가 적용되지 않은 경우 전체 세포 용해물에서 만 100-150 매우 낮은 풍부한 diGly 펩티드만이 확인되었다는 점을 감안할 때 매우 효율적입니다. 분명히 민감한 질량 분석법은 많은 수의 diGly 식별을 얻기 위한 전제 조건입니다. 우리는 성공적으로 여러 가지 질량 분석기를 사용했지만, 우리는 Orbitrap Tribrid Lumos가 가장 높은 수율을 준 가장 민감한 것으로 나타났습니다.

높은 pH 용출이 있는 오프라인 RP 크로마토그래피는 IP가 수행되기 전에 테스트되어야 합니다. 펩티드 식별의 관점에서 분획 사이의 중첩은 최적의 실험을 위해 가능한 한 낮아야 한다. IP 후, 분획 중 하나는 유비퀴틴의 자신의 Tryptic digly 펩티드 LIFAGK (GG)QLEDGR (m/z 730.39)을 포함해야 한다. 이는 지금까지 면역침전분획에서 가장 풍부한 펩티드이며 120분 그라데이션에서 50-55분 사이의 LC 크로마토그램에서 강렬하고 넓은 피크를 특징으로한다(도 1B). 이 벤치마크 피크가 크로마토그램에서 없는 경우 IP가 실패했을 가능성이 큽니다.

IP 시술 직후 에이치에이치펩티드면역을 분석하는 것이 중요하므로 IP와 분석 사이의 시간을 최소한으로 유지해야 한다. 그 시간 동안, 펩티드는 바람직하게는 플라스틱 튜브 대신 유리 병에 저장되어야한다. RT 또는 -20 °C에서 너무 오래 플라스틱 튜브에 펩티드를 두면 펩티드가 침전되거나 플라스틱 튜브 벽에 달라붙을 수 있습니다. 이는 궁극적으로 분석의 민감도에 영향을 미칩니다.

비록 그들의 동일한 114.04 다 질량 교대24때문에 유비퀴틴화 사이트로 iodoacetamide adducts의 잠재적인 오해에 대 한 문학에 보고 되었습니다. 첫째, iodoacetamide (IAM)를 사용하는 부작용은 위에서 설명한 알킬화 환원 프로토콜을 사용하여 우리의 손에 최소한의 것입니다. 둘째, 항체는 디글리신 잔재를 가진 펩티드에 특이적이다. 2개의 요오도아세타미드 모에티를 함유한 펩티드는 리신 잔류물에 공유적으로 첨가되어서는 이 프로토콜에서 농축되어서는 안 된다. 셋째, 면역침전형 분획에서 펩티드의 대다수는 전술한 SILAC 실험에 예시된 바와 같이 프로테아좀 억제에 따라 업조절된다(도5). 유비퀴틴화 단백질의 집단이 이 처리결과로 영향을 받기 때문에, 이 영향 받은 펩티드는 유비퀴틴화 한 단백질에서 유래하는 실제로 diGly 펩티드일 가능성이 높습니다.

마지막으로, 이 프로토콜은 TMT19를사용하여 최근에 게시된 다중화 정량 전략과 함께 사용될 수 있다. 명백하게, 발표된 diGly 펩티드 수치는 본 프로토콜을 사용하여 수득된 것보다 다소 낮지만, 최대 16개의 시료를 동시에 정량화하는 능력은 큰 장점이다. 이러한 방법을 결합하면 연구원은 대규모 정량적 유비퀴티노메 연구를 매우 심층적으로 수행할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 국가 로드맵 대규모 연구 시설 (프로젝트 번호 184.032.201)의 일환으로 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO)에 의해 자금을 조달 네덜란드 Proteomics 센터의 프로그램 "직장에서 단백질"프로젝트의 일부입니다 ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithioerythritol Sigma-Aldrich D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks Supelco 66883-U product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate Sigma-Aldrich 70221
Bortezomib UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 34869
DMEM ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200 ThermoFisher
FBS Gibco
GF/F filter plug Whatman 1825-021
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125
Lysine, Arginine Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC) Wako Pure Chemicals 129-02541
NanoLC oven MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma-Aldrich L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher / Pierce 23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles Agilent Technologies PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit Cell Signaling Technologies 5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge Waters WAT036790 Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
Tris-base Sigma-Aldrich T6066
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Trypsin, TPCK Treated ThermoFisher 20233

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References

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펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출
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Bezstarosti, K., van der Wal, L., Demmers, J. A. A. Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e59079, doi:10.3791/59079 (2020).More

Bezstarosti, K., van der Wal, L., Demmers, J. A. A. Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e59079, doi:10.3791/59079 (2020).

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