Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

تحسين قذف لزوجة عالية من ميكروكريستالس لحل وقت المسلسل Femtosecond البلورات في أشعة الليزر

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/59087
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 3,4, 3,4, 1,5, 1
1Division of Biology and Chemistry - Laboratory for Biomolecular Research, Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division - SwissFEL, Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Department of Biology, ETH Zürich

Summary

نجاح تجربة علم البلورات femtosecond المسلسل وقت حلها مرهون بتسليم عينة تتسم بالكفاءة. هنا، نحن تصف البروتوكولات الأمثل النتوء ميكروكريستالس باكتيريورهودوبسين من حاقن النتوء الصغير لزوجة عالية. المنهجية تعتمد على تجانس العينة مع مقرنة الثلاثية رواية والتصور مع كاميرا عالية السرعة.

Abstract

اللزوجة عالية النتوء الصغير عن طريق الحقن قد قلل جداً من استهلاك عينة في تجارب بلورية femtosecond التسلسلي (SFX) في أشعة ليزر الإلكترون الحر (إكسفيلس). كذلك أقامت سلسلة من التجارب باستخدام باكتيريورهودوبسين مضخة البروتون يحركها الضوء هذه الحقن كخيار مفضل لتسليم بلورات لحل الوقت femtosecond المسلسل علم البلورات (TR-سفاكس) حل التغييرات الهيكلية البروتينات بعد فوتواكتيفيشن. للحصول على لقطات هيكلية متعددة ذات جودة عالية، من الضروري جمع كميات كبيرة من البيانات، والتأكد من إزالة الألغام بلورات بين كل نبضة ليزر مضخة. هنا، نحن تصف بالتفصيل كيف يمكننا الأمثل النتوء ميكروكريستالس باكتيريورهودوبسين لتجاربنا TR-سفاكس الأخيرة مصدر الضوء متماسك في الجراحة (لكلس). ويهدف الأسلوب الأمثل البثق لتدفق مستقر ومتواصل مع الحفاظ على كثافة عالية من بلورات لزيادة المعدل في البيانات التي يمكن جمعها في سفاكس-TR التجربة. يمكننا تحقيق هذا الهدف بإعداد المرحلة مكعب lipidic مع توزيع بلورات استخدام المحاقن الثلاثية رواية اقتران الجهاز متبوعاً بضبط تكوين نموذج استناداً إلى قياسات الاستقرار البثق المتخذة مع عالي السرعة بصورة متجانسة إعداد الكاميرا. المنهجية التي يمكن تكييفها لتحسين تدفق الأخرى ميكروكريستالس. الإعداد ستكون متاحة لمستخدمي المرفق الجديد "السويسري ليزر الإلكترون الحر".

Introduction

Femtosecond المسلسل علم البلورات (SFX) هو أسلوب الأحياء هيكلية التي يستغل الخواص الفريدة لليزر الإلكترون الحر بالأشعة السينية (إكسفيل) لتحديد درجة حرارة الغرفة هياكل الآلاف من بلورات الحجم ميكرومتر بينما الأمر معظم أضرار الإشعاع "الحيود قبل تدمير" المبدأ1،2،3.

في ملحق الوقت وتصميما من سفاكس (TR-سفاكس)، تستخدم نبضات femtosecond من إكسفيل لدراسة التغيرات الهيكلية في البروتينات4،5. يتم تنشيط بروتين اهتمام ليزر ضوئية (أو مشغل النشاط آخر) قبل إصابته برصاص إكسفيل في إعداد تحقيق مضخة. بدقة السيطرة على التأخير بين نبضات المضخة والتحقيق، يمكن التقاط البروتين المستهدفة في مختلف الدول. أفلام الجزيئية للتغييرات الهيكلية على مدى إحدى عشرة من حيث الحجم في وقت تثبت قوة مصادر إكسفيل جديدة لدراسة ديناميات عدة البروتين الأهداف6،،من78،9، 10،11،،من1213. أساسا، ينضم الأسلوب التقنيات الهيكلية دينامية الطيفية وثابت واحد، تقديم لمحة في ديناميات البروتين في القرب من القرار الذري.

قد تحتوي على أنظمة بسيطة ل TR-سفاكس مشغل ذاتية للتنشيط مع عنصر الصور الحساسة مثل الشبكية في9،باكتيريورهودوبسين (bR)10، صباغات في فوتوسيستيم الثاني12،13، 6،فوتواكتيفي البروتين أصفر (PYP)7 عكسية فوتوسويتشابل بروتين فلوري11، أو أول أكسيد الكربون فوتوليزابل في الميوجلوبين8. الاعتماد على مزيج اختلافات مثيرة من هذه التقنية لا تزال في التنمية وضخ مخططات14،15 دراسة التفاعلات الانزيمية أو مجال الكهربائي تستخدم للحث على إجراء تغييرات هيكلية16. نظراً لأن مصادر إكسفيل كانت متاحة فقط لبضع سنوات واستقراء النجاحات السابقة في المستقبل، الأسلوب يبين المحتملة مغير لعبة حقيقية فيما يتعلق بفهمنا لكيفية وظيفة البروتينات.

لأنه يتم تدمير عينات بيولوجية تعرض مرة واحدة لقوة عالية نبض إكسفيل، ونهج جديدة للبروتين البلوري كانت ضرورية. من بين هذه الإجراءات، يلزم أن القدرة على زراعة كميات كبيرة من ميكروكريستالس الموحدة المتقدمة17،،من1819. لتمكين جمع البيانات في إكسفيل، هذه البلورات يجب أن يكون تسليم وتجاهل وتجديد ثم لكل نبض إكسفيل. تسليم العينة نظراً لأن إكسفيلس النار البقول قابلة للاستخدام في 10-120 هرتز، يجب أن تكون سريعة ومستقرة وموثوق بها، مع الحفاظ أيضا البلورات سليمة والحد من الاستهلاك. من بين الحلول الأكثر نجاحا هو حاقن النتوء الصغير لزوجة عالية، التي يسلم continiously الجري العمود من درجة حرارة الغرفة كريستال لادن lipidic مكعب المرحلة (LCP) عبر نبضات الأشعة السينية شعاع20. بلورات المنحى عشوائياً، المضمنة في الدفق نظام الإجراءات الجزائية، التي يتم اعتراضها من قبل مبعثر نبضات إكسفيل الأشعة السينية على جهاز كشف حيث يتم تسجيل نمط حيود. LCP كان خياراً طبيعيا لوسيلة تسليم عينة كما يتم استخدامه كوسيلة نمو كثيرا ما لغشاء بروتين بلورات17،21،22،23، لزوجة عالية أخرى وسائل الإعلام الناقل 24،25،،من2627،،من2829،30 و31 من البروتينات القابلة للذوبان كما استخدمت في محقن. سفاكس مع حاقن لزوجة عالية قد نجحت خلال تصميم هيكل غشاء بروتينات13،32 بما في ذلك33،ز مستقبلات البروتين-إلى جانب (جبكرس)34، 35،،من3637، مع نوعية البيانات الكافية لإنشاء38،مراحل39 الأصلية بينما يجري كل الوقت وعينه تتسم بالكفاءة. حاليا، هذه الحقن تستخدم أكثر بشكل روتيني لقياس درجة حرارة الغرفة في السنكروتروني مصادر28،30،،من4041 وكذلك خلال الأكثر من الناحية الفنية وتطالب تجارب سفاكس TR في إكسفيلس9،10،،من1342.

المقارنة TR-سفاكس التجارب قد نفذت باستخدام أنواع حاقن أخرى مثل الطور السائل ركز التسليم في تدفق فوهة6،،من712، ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب كميات البروتين لا تتوفر للعديد أهداف مثيرة للاهتمام من الناحية البيولوجية. لتحديد هياكل ثابتة باستخدام البثق لزج متوسط استهلاك 0.072 ميلغرام بروتين لأنماط الحيود المفهرسة 10,000 مقارنة بملغ 9.35 ل jet السائل أبلغ فوهات (أي حوالي 130 مرات أكثر من عينة 20من الكفاءة). ثبت حاقن لزوجة عالية يكون جهاز تسليم نماذج قابلة للتطبيق ل TR-سفاكس بينما فقط التضحية ببعض من هذه الكفاءة عينة43. وكان في نوغلي et al. (2018)10، على سبيل المثال، نموذج استهلاك حوالي 1.5 ملغ في أنماط المفهرسة 10,000، الذي يقارن إيجابيا لتجارب TR-سفاكس مماثلة باستخدام PYP حيث كان استهلاك متوسط عينة أعلى بكثير مع 74 ملغ بروتين كل 000 10 6من أنماط المفهرسة. وهكذا يكون لزوجة عالية عن طريق الحقن مزايا واضحة عندما يتم الحد من كمية البروتين المتاحة أو عندما تزرع البلورات مباشرة في نظام الإجراءات الجزائية.

ل TR-سفاكس لزوجة عالية باستخدام الحقن لإنتاج البيانات الأكثر موثوقية عدة مسائل تقنية تحتاج إلى معالجتها: سرعة تدفق يحتاج إلى البقاء فوق قيمة الحد أدنى الحرج؛ ينبغي الاحتفاظ بضرب المعدل المستوى لا تجعل من جمع البيانات بطيئة (مثلاً، أكبر من 5 في المائة)؛ وقد عينة لتسليمها دون انقطاع المفرط. ومن الناحية المثالية، الفعل استيفاء هذه الشروط قبل وقت طويل من تجربة TR-سفاكس مجدولة لاستخدام الوقت المتاح إكسفيل أكبر قدر ممكن من الكفاءة. بريسيبالي، قد تسمح تباطؤ في تيار LCP السبر البلورات التي تم تنشيطها مع نبض الليزر الضوئية واحد أو أكثر والنتيجة في الدول النشطة مختلطة، أو سبر ضخ المواد عند أومبومبيد المواد المتوقع في الحزمة. فائدة إضافية لحقن قبل الاختبار هو أن التوقف أثناء جمع البيانات في إكسفيل تصغير وقت إنزالها إلى استبدال فوهات مسدودة، تغيير خارج العينات غير القذف، ويتم تقليل مهام الصيانة الأخرى.

نقدم هنا، وسيلة لتحسين تقديم عينة لجمع البيانات سفاكس TR مع حاقن النتوء الصغير لزوجة عالية. للبساطة، الأساليب المذكورة لا تعتمد على إمكانية الوصول إلى مصدر الأشعة سينية، على الرغم من أن العمل في بيمليني السنكروتروني29 تقديم معلومات إضافية عن معدلات ضرب المتوقعة وكريستال الحيود. لدينا البروتوكولات وضعت لتحسين تجارب لالتقاط isomerization الشبكية في مضخة البروتون باكتيريورهودوبسين10 وتنفذ على مرحلتين بدءاً بإعداد عينات كريستال لقذف متبوعاً بالرصد قذف استخدام إعداد كاميرا عالية السرعة. في المرحلة الأولى، يختلط LCP كريستال لادن LCP إضافية، انتقال انخفاض درجة حرارة الدهون، أو غيرها من المواد المضافة لضمان الخليط النهائي مناسبة لتوصيلها إلى البيئة عينة دون إعاقة أو إبطاء. مقرنة حقنه ثلاثية جديدة وضعت لتحسين خلط التجانس الأداء وعينه. وتتألف المرحلة الثانية اختبار قذف سجلتها كاميرا عالية السرعة لقياس استقرار سرعة قذف مباشرة. وبعد تحليل بيانات الفيديو، يمكن تعديلات على بروتوكول إعداد نموذج لتحسين النتائج التجريبية. هذه الإجراءات يمكن تكييفها لتحضير البروتينات الأخرى لجمع البيانات TR-سفاكس، مع الحد الأدنى من تعديلات، وسوف تسهم في الاستخدام الفعال لمحدودية إكسفيل بيمتيمي. مع مرافق إكسفيل جديدة بدأت للتو على العملية44،45 ونقل أساليب جمع البيانات التسلسلية حاقن المستندة إلى سينتشروترونس28،،من3040،41 ، السنوات القليلة القادمة ستواصل بالتأكيد تقديم رؤى جديدة مثيرة في ديناميات الهيكلية لنطاق أوسع من أي وقت مضى لأهداف البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-البروتين إعداد عينة كريستال

  1. حوالي 30 دقيقة قبل أن تكون العينة بالحقن، على أساس حمولة 50 ميليلتر من مونولين كريستال لادن LCP في حقنه 100 ميليلتر.
  2. للحقن في الضغط الجوي: تحميل 10 ميليلتر من البارافين السائل في الجزء الخلفي من حقنه ثانية. عقد المحاقن عمودياً، طرد فقاعات الهواء من المحاقن.
    1. لحقن في بيئة فراغ: تحميل 5 ميليلتر من 7.9 ماج و 5 ميليلتر من البارافين السائل في الجزء الخلفي من حقنه ثانية. عقد المحاقن عمودياً، طرد فقاعات الهواء من المحاقن.
  3. الاتصال المحاقن مع البارافين/ماج 7.9 مقرنة حقنه قياسية، وتطهير الجو من المقرنة بالضغط بلطف على المكبس حتى كمية صغيرة (< 1 ميليلتر) البارافين/دهن مرئياً في طرف الإبرة مقرنة.
  4. قم بتوصيل المحاقن عينة مقرنة المحاقن، مع الحرص على عدم إدخال أي الهواء في العينة. خلط في الدهن/البارافين بتمرير المواد عينة من خلال المقرنة عدة مرات.
  5. تحميل 20 ميليلتر من خلط LCP (27% شماعة، 100 ملم سورنسن pH 5.6 + مو) في آخر 100 محقن ميليلتر. إزالة فقاعات الهواء عند الاقتضاء.
  6. إزالة المحاقن الفارغة من المقرنة وإرفاق LCP خلط البلورة التي تحتوي على المحاقن مقرنة حقنه قياسية استخدام. تمرير العينة من خلال المقرنة مائة مرة.
    ملاحظة: خلط العينة قد حرارة العينة قليلاً46. خلط وينبغي أن يتم بمعدل بطيء حيث يمكن عقد درجة حرارة العينة ثابتة معقولة.
  7. فحص العينة للشفافية ضد مصدر الضوء. إذا شكلت LCP واضحة متجانسة، انتقل إلى الخطوة 1، 9.
  8. لإحضار العينة إلى مرحلة مكعب، إضافة 3 ميليلتر من مونولين ومزيج 50 مرة (كما هو موضح أعلاه). كرر هذا الإجراء فقط حتى شكلت مرحلة تتسم بشفافية لتفادي وجود فائض مونولين.
    ملاحظة: تشكيل نظام الإجراءات الجزائية تعتمد درجة الحرارة47 وهي تحقق نتائج أفضل قليلاً فوق 20 درجة مئوية. مبلغ إضافي مونولين حاجة سيعتمد على حجم الحل مرسب المتبقية التي رحلت من بلورة.
  9. كأولى اختبار لصلابة العينة (كما هو متوقع في مرحلة LCP) والقدرة على قذف وفصل المحاقن الفارغة من مقرنة المحاقن و، عقد المحاقن عمودياً، الضغط على كمية صغيرة من العينة (< 2 ميليلتر) من خلال المقرنة. إذا كانت العينة مقذوف أشكال اسطوانة منتصبا، ثم العينة جاهز لاختبار النتوء.
  10. ضبط الحجم الكلي للعينة إلى 100 ميليلتر بإضافة أكثر من خلط LCP (كما في الخطوة 1، 5).
  11. إرفاق المحاقن عينة والمحاقن الفارغة اثنين مقرنة حقنه الثلاثية (تطهير الجو من المقرنة قبل). مرات على الأقل 50 (أو حتى متجانسة) مزيج بتمرير نصف العينة في محقن الثاني ثم الضغط كل شطر من العينة في محقن الثالثة في وقت واحد.
  12. مكان حقنه تحتوي على عينة مختلطة تحت مجهر ستيريو للتحقق من توزيع البلورات بصورة متجانسة.

2-اختبار قذف العينة باستخدام إعداد كاميرا عالية السرعة

  1. تحديد البارامترات التجريبية.
    1. حدد حجم الفوهة للاختبار.
      ملاحظة: عادة ما تكون أحجام فوهة 50 أو 75 ميكرون قطرها الداخلي (ID)، لكن أي حجم من حوالي 30-100 ميكرون يمكن اعتبار معرف. اختيار يستند إلى توازن بين وقت انسداد يعني ونثر الخلفية واستهلاك عينة وضرب معدل.
    2. حساب سرعة التدفق الأمثل استناداً إلى حجم بقعة ليزر تجريبي (قطرها2 1/e)، ونظام جمع البيانات (مثلاً، معشق النور والظلام) التي سيتم استخدامها في إكسفيل.
    3. حساب معدل التدفق المطلوب (Equation 1) من العينة من سرعة التدفق الأمثل (Equation 2) وقطر فوهة المحدد (Equation 3):
      Equation 4
      تحديد معدل التدفق (Equation 5) التي يجب إدخالها في المضخة [هبلك] استناداً إلى معامل التضخيم (Equation 6) في محقن.
      Equation 7
      حساب الضغط الأقصى (Equation 8) من الضغط مصنفة من التجهيزات فوهة (Equation 9) ومعامل التضخيم من محقن (Equation 10):
      Equation 11
  2. إعداد محقن البثق لزوجة عالية للاستخدام دون اتصال كما هو مبين في الشكل 1.
    ملاحظة: مهام حاقن عن طريق البثق هيدروليكية بواسطة مضخة [هبلك]، ويستخدم غمد غاز هليوم تتدفق شارك يسيطر عليها منظم غاز. لم تناقش الإعداد مضخة ومنظم في هذا البروتوكول. انظر الفصل الرابع في جيمس (2015)48 لدليل تفصيلي.
    1. إزالة المضخة وجميع خطوط المياه التأكد من فلووراتيس دقيقة. إزالة هيدروليكي مرحلة محقن.
    2. جبل محقن (أو الكاميرا) في مرحلة ثلاثة محاور لتسهيل تأطير والتركيز لأشرطة الفيديو عالية السرعة. ترك مسافة حول نقطة الحقن للعدسة الهدف والإضاءة والشاشة العاكسة وكوب صغير لالتقاط العينة المستهلك.
    3. بناء فوهة "وهمية" (خزان فارغ مع فوهة المرفقة) وتثبيته على محقن تيسيرا لتحديد المواقع، والتركيز، والإضاءة.
    4. جبل الكاميرا عالية السرعة مع طرف فوهة قرب النقطة المحورية في الهدف.
    5. ضع الشاشة العاكسة وراء محقن وضبط الإضاءة الضوء الأمامي الفوهة.
    6. قم بتشغيل وتوصيل الكاميرا مع البرامج التي تم توفيرها. مع لقطات فيديو حية للملاحظات البصرية، ضع طرف فوهة في وسط الإطار، وجعله مع مرحلة ثلاثة محاور التركيز.
    7. ضبط الإضاءة حتى الفوهة واضحة للعيان والخلفية مضاءة بشكل متساو.
  3. تكوين الكاميرا لتسجيل الفيديو الوقت الفاصل بين عالية السرعة.
    1. تعيين معدل الإطارات إلى 1000 إطارا في الثانية. تعيين دقة إلى 512 × 512 بكسل.
    2. مع وقت التعرض الآن تعيين معدل الإطار، قم بضبط مستوى الإضاءة حتى الفوهة مرئياً (أي، لا تخضع-أو تعريض). تغيير موضع الفوهة تلميح حتى أن يتم توسيطه من اليسار إلى اليمين، ويقع في الثلث العلوي من الإطار.
    3. قم بتشغيل أي عمليات توازن اللون الأبيض أو تصحيح الخلفية.
    4. إعداد الكاميرا في وضع الوقت الفاصل. تعيين الفاصل الزمني إلى 30 ثانية ويكرر 40 مرة، قم بتعيين وضع الزناد عشوائية (أو إعادة تعيين عشوائي)، وأدخل عدد الإطارات لتسجيل إلى 1000.
  4. تحميل الخزان مع 20 ميكروليتر من عينة الاختبار، ونعلق على فوهة الشعرية.
  5. إرفاق الخزان مليئة بمحقن. إرفاق خط الغاز إلى منفذ على الفوهة وبدء تدفق الغاز.
  6. تقدم المكبس يدوياً بفتح الصمام في خط الضغط المحاقن. إغلاق الصمام عند المكبس يجعل الاتصال مع العينة الصلبة في الخزان.
  7. برنامج المضخة مع معدل التدفق المحسوب وتعيين الضغط الأقصى للقيمة المحسوبة (راجع الخطوة 2.1.3).
  8. في نفس الوقت بدء تشغيل المضخة وتسجيل الكاميرا.
  9. كما يبدأ قذف، ضبط ضغط الغاز لزيادة الاستقرار. زيادة ضغط الغاز إذا كان السائل يشكل قطره في غيض الفوهة بدلاً من عمود. انخفاض الضغط إذا قذف مكسورة بسبب القص المفرط من تدفق الغاز، أو هي تتأرجح سريعاً (الجلد).
  10. رصد قذف (10 دقيقة عادة بما يكفي للاعتراف بشرط تدفق متجانسة)، وعند ضغط مضخة سلالم حادا حتى قرب وقت النهاية المتوقعة، إيقاف التسجيل، إيقاف تشغيل المضخة، وتنفيس الضغط النظام عن طريق فتح صمام الإغاثة.
  11. تحليل ملفات الفيديو
    ملاحظة: لا تتطلب تحليلاً مفصلاً قذف العينة بصراحة غير كافية. ومع ذلك، أنها لا تزال مفيدة للتعرف على وضع الفشل حيث أن العينة قد يكون الأمثل.
    1. فتح ملف الفيديو مع برنامج التحليل (مثلاً، فيجي49) ومعايرة أدوات القياس.
    2. معايرة القياسات عن طريق تحديد خط الطول المعروفة في صورة الفيديو باستخدام أداة التحديد الخط. فتح نافذة ضبط مقياس عبر تحليل | ضبط مقياس وأدخل المسافة المعروفة ووحدات القياس.
      ملاحظة: يوفر القطر المعروفة من الفوهة على طول معايرة كافية لهذه القياسات.
    3. البحث عن إطار في الفيديو حيث توجد ميزة تتبعها مرئية (مثل كريستال) في قذف. سجل عدد الإطار.
    4. النهوض بالفيديو إلى إطار فيها نفس الميزة مرئياً ولكن قد انتقلت من موقعها في الخطوة السابقة. سجل عدد الإطار.
    5. باستخدام أداة قياس خط مستقيم، قياس المسافة من بداية ميزة ونقطة النهاية عن طريق تحليل | قياس.
      ملاحظة: المسافة التي تتبعها، عدد أقل من الأخطاء في قياس أطول سوف يؤثر على العمليات الحسابية
    6. حساب سرعة طائرة من قياس المسافة والوقت المنقضي (عدد إطارات المنقضية مقسوماً على معدل الإطارات).
    7. كرر الخطوات 2.11.3-2.11.6 عدة مرات لكل جزء من شريط الفيديو.
    8. رسم سلسلة البيانات كما في الشكل 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مواد انطلاق مثالية للإجراءات المذكورة هنا (الشكل 3) بكثافات عالية من ميكروكريستالس التي أدرجت في الناقل اللزوجة المتوسطة محقن. ويدعو هذا الإجراء حوالي 50 ميليلتر من الناقل آدن كريستال لكل إعداد. يمكن زراعتها مباشرة في نظام الإجراءات الجزائية كهذه مع9،ر10 المستخدمة هنا، على سبيل مثال (الشكل 4)، أو أعد استخدام بلورات نمت في الأجهزة انتشار البخار التقليدية. دليل فيديو ممتاز لبلورة مباشرة في الحقن جاستيت ويمكن الاطلاع في إيشتشينكو وآخرون (2016)37. مع برازيلي، القطر المثالي من لوحات بلوري حوالي 20 ميكرومتر كحل وسط جيد بين السلطة الحيود والتنشيط متجانسة بواسطة الليزر مضخة. البلورات البروتينية، أعدت باستخدام البروتوكولات كما هو موضح أعلاه، استخدمت لجمع البيانات سفاكس TR في فرع مضخة بروتون الذي كشف عن فائق السرعة التغييرات التي تحدث بعد امتصاص فوتون (الشكل 5).

بعد إعداد نموذج باستخدام مقرنة الثلاثية (الشكل 6 أ، ب)، يبين الفحص البصري للمواد عينة في المحاقن عينة من الصور التجانس (الشكل 6، د)، ومجهر العينة المختلطة، سواء في المحاقن وعلى شريحة، يمكن تأكيد كثافة البلورات ويسمح لقياسات الأحجام كريستال، كريستال حجم التوزيع وكثافة البلورة. العينة في مرحلة مكعب عندما يكون وسيلة إيصال واضحة (الشكل 7) ولزج. خلائط عكر مؤشرا على أن تكون العينة في الأسفنج مرحلة أو مرحلة رقائقي، لكن ليست قاطعة كما قد يحجب كثافة كريستال عالية الوضوح LCPs. يمكن إجراء اختبار الضغط المنخفض مختصر لتحديد المرحلة السائلة الأسفنج عن طريق سحب المكبس حقنه بعيداً عن العينة في الجزء الخلفي من المحاقن. يمكن تحديد المرحلة رقائقي بسهولة من خلال ما إنكسار مزدوج مع الاستقطاب مجهرية الخفيفة. هذه الاختبارات مقترنة باختبار قبل بثق عادة ما تكون كافية لتبرير إجراء اختبار في محقن.

يتطلب ارتفاع معدل الرسوب من إكسفيلس بسرعة تدفق التي لا يمكن ملاحظتها على نحو كاف مع الكاميرات معدل الإطار منخفضة. ولذلك، يتم وصف قذف باستخدام كاميرا عالية السرعة (بالإضافة إلى عدسة تكبير عالية) التي يمكن تسجيل الفيديو الوقت الفاصل. بيانات الفيديو عالية السرعة في أن تسجل الإطارات في الثانية 1000، والوقت الفاصل بين أيضا في أن يتم تسجيل الفيديو ل 1 s كل 30 ثانية. سيسمح هذا النظام جمع البيانات لجمع البيانات أثناء اختبار عينة كاملة (حوالي 10 دقائق) دون إنشاء ملفات الفيديو لا يمكن السيطرة عليها. وحتى مع انخفاض مجموعة البيانات هذه قد تكون ملفات الفيديو، وحجم ما يزيد على 50 جيجابايت. وينبغي الحرص على ضمان تتوفر مساحة تخزين كافية لحفظ بيانات الفيديو قبل بدء الاختبار.

أثناء اختبار jet (الشكل 1)، وينبغي أن قذف العينة عمود مستمرة منذ فترة طويلة (أكثر من 200 ميكرومتر) من نظام الإجراءات الجزائية التي تتحرك سرعة ثابتة تقريبا (الشكل 2). العينات التي يتم تشغيلها في وضع نازف تشير إلى أن عينة اللزوجة منخفضة جداً (الشكل 2). يمكن غالباً انتشال عينات ومختلطة مع مونولين أو البارافين التكيف مع اللزوجة أكثر. وينبغي اختبار العينات التي تشكل عمود مع كاميرا عالية السرعة. وتظهر البيانات من التسجيل ينبغي أن يبقى قذف أعلاه بسرعة دنيا التي تمليها معلمات التجريبية الخاصة بك. تتحدد سرعة البثق بقياس المسافة الخطية ميزة في تيار LCP يسافر على مدى عدد من الإطارات. تباطؤ النتوء الذي يمكن أن يعزى إلى قباقيب الشاذة تبرر إعادة الاختبار. إذا استمروا النفث ينبغي تحسين بمواد مثل الكيروسين، بتخفيض كثافة البلورات، أو بواسطة تحديد فوهة قطرها أكبر. البلورات عادة تزرع في وسيلة لزج (مثلاً، نشر بخار) يمكن أن تكون بيليتيد بالطرد المركزي وإدراجها في نظام الإجراءات الجزائية أو غيرها من حاملات لزج. للحصول على أمثلة، انظر السابق منشورات24،25،26،27،،من2930.

Figure 1
رقم 1: إعداد مقاعد البدلاء كاميرا عالية السرعة- صورة فوتوغرافية للإعداد benchtop نموذجية مع تسمية الأجزاء الأساسية. المرحلة ثلاثة محاور يوفر المرونة في تأطير والتركيز الصورة. يتم تحميل الحاقن (مبين بفوهة وخزان المرفقة) عمودياً، ومباشرة أمام عدسة الهدف. الإضاءة في هذا المثال يتم توفيرها من قبل على ضوء ألياف واحد ينير العينة خارج المحور وتوفير حقل مشرق على الشاشة. نموذج المركبة ومضيئة في هذه الطريقة توفر صورة مثل واحد في اقحم باء الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحليل البيانات واختبار الكاميرا عالية السرعة- في الصورة أعلاه اختبارين البثق LCP. اختبار يظهر بلورات bR في LCP البثق في وضع نازف أ تبين أن العينة ليست الأمثل. اختبار ب يظهر النتوء LCP تشكيل عمود مستمرة من نظام الإجراءات الجزائية حيث يمكن تتبع البلورات، ويمكن حساب سرعة قذف. في هذا المثال، يتحرك كريستال مضمنة في العمود LCP (50 ميكرون القطر) ميكرومتر 301 8 مللي ثانية (37.6 ملم/ثانية). تظهر مجموعتين من البيانات من الاستعدادات المختلفة لبلورات باكتيريورهودوبسين في نظام الإجراءات الجزائية. أربعة (أو أكثر) من نقاط البيانات من كل ثانية من الوقت الفاصل بين كاميرا عالية السرعة فيديو (1 s لتسجيل كل 30 ثانية) تم رسمها. على فارق كبير بين نقاط البيانات المأخوذة من واحد الفترة الثانية لجمع البيانات تشير إلى اختلاف سرعة قصيرة الأجل. بينما يظهر معدل متحرك عبر سلسلة بيانات بأكملها أطول التقلبات في التدفق. سلسلة أعلى من عينة سيئة extruding (فرصة عالية للتلوث الخفيفة مع اثنين من نبضات الليزر مضخة على التوالي)، وسلسلة أسفل من عينة أن يؤديها على النحو الأمثل. خط منقط أفقي يشير إلى الهدف المحدد سرعة البثق عن طريق المضخة [هبلك]. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: نموذج إعداد مخطط انسيابي. إعداد نموذج يبدأ بكثافة عالية من بلورات البروتين جزءا لا يتجزأ من نظام الإجراءات الجزائية. العينة هو مختلطة مع انتقال انخفاض درجة حرارة الدهن، البرافين، ثم أعد LCP حتى يأتي إلى مرحلة مكعب العينة، وتمرير سلسلة من التجارب الصغيرة للإشارة إلى أنه سيتم قذف العينة في محقن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: بلورات باكتيريورهودوبسين كبداية المواد- بلورات يزرع في الحقن الغاز (A)، مع LCP منغمسين في الحل مرسب. هو الأمثل تبلور الكثافة عالية لبلورات بتوزيع حجم ربما ضيقة (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: التغيرات الهيكلية في باكتيريورهودوبسين- ويكشف TR-سفاكس فائقة السرعة التغييرات في هيكل باكتيريورهودوبسين مضخة بروتون. هنا هو الصورة نموذجا لفرع المستمدة من سفاكس TR البيانات المتحصل عليها من بلورات المعدة باستخدام البروتوكولات المبينة في هذا العمل. اللوحة اليسرى يظهر النموذج مع السمات المميزة في جيب ملزم الشبكية. تعرض اللوحة اليمنى التغييرات في الشبكية من فيمتوسيكوندس إلى ميلي ثانية. واستنسخ هذا الرقم من نوجلي وآخرون (2018)10 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: مقرنة ثلاثية- مقرنة الثلاثية خلاط Y الميت-حجم انخفاض المصممة للتوافق مع الحقن جاستايت. اﻷداءات ثلاثية الأبعاد المقرنة، إظهار طريقة عرض انفجرت للجمعية (A)، وطريقة عرض شفافة تبين اختلاط قناة (ب). ويوضح الشكل توزيعاً كريستال متنافرة بعد الاختلاط مع مقرنة القياسية (ج)، وتعليق الناتجة بعد خلط في مقرنة الثلاثية (د). ويتحقق بدفع حوالي نصف العينة في محقن آخر (ه) ومن ثم دفع كلا نصفي في محقن المتبقية معا كما يتضح من الأسهم الزرقاء (و) خلط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: مؤشرات الاختبار قبل الحقن. أثناء إعداد عينة، عدة اختبارات صغيرة تستخدم للإشارة إلى أن العينة في المرحلة، ولزج على نحو كاف. الوضوح البصري مؤشر واحد أن العينة من المرجح في مرحلة مكعب. (أ) عينة عكره يرد في المحاقن. (ب) عينة واضحة ويبين، مذكرة التخرج خطوط مرئية من خلال عينة على الرغم من كثافة عالية من بلورات صغيرة. عند دهن المصفوفة في مرحلة مكعب، يبقى مثل الصلبة عندما تحت لا ضغط. يتم إجراء اختبار الضغط المنخفض عن طريق سحب المحاقن بعيداً عن الجزء الخلفي العينة. عندما تكون العينة جداً مثل سائل (الإرشادية المرحلة الأسفنج) العينة يوسع لملء الحجم (ج). بنتيجة إيجابية لنفس الاختبار (د)، تظل العينة ثابتة على الرغم من سحب المكبس. أخيرا، يتم اختبار بثق حجم الكلي عن طريق الضغط على كمية صغيرة من العينة عن طريق مقرنة المحاقن. معالجة تجميعية تشكيل في تلميح فوهة (ه) أو اسطوانة الانحناء بسرعة من نظام الإجراءات الجزائية يشير إلى عينة غير لزج ما فيه الكفاية. إذا كان يقذف العينة، تشكل اسطوانة، الذي ما زال منتصبا على مر الزمن (و)، ثم قد تقدم العينة لاختبار الكاميرا عالية السرعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأسلوب سفاكس TR مع حاقن البثق لزج ثبت أن تقنية قابلة للتطبيق للدراسات ديناميات الهيكلية باكتيريورهودوبسين9،10 وفوتوسيستيم الثاني13 ويبدو الآن مستعدا لدراسة البروتينات قيادة أخرى صور العمليات البيولوجية مثل النقل أيون يحركها الضوء أو الإدراك الحسي5،50. البروتوكولات المذكورة أعلاه كانت تهدف إلى تحقيق أقصى نجاح TR-سفاكس جمع البيانات على باكتيريورهودوبسين، ومع ذلك نعتقد أنه يمكن أن يعمل كقالب لتحسين جمع البيانات المتعلقة بالعينات الأخرى. وبهذه الطريقة، كثير من بيمتيمي الثمينة المفقودة حاليا بسبب انسداد أو يمكن بدلاً من ذلك استخدام البثق عينة الفقراء لجمع بيانات أفضل في أكثر وقت التأخير.

أن الخطوة الأكثر صعوبة، والحاسمة في البروتوكول هو إضافة كميات صغيرة من مونولين التي تجمع بين المصفوفة المادة الدهنية في مرحلة مكعب (الخطوة 1.8). وتكمن الصعوبة في دقة المرحلة الانتقال والتأثير السلبي على العينة عند إضافة مونولين في الزائدة.

وينبغي تنفيذ التعديلات على المنهجية لاستيعاب البلورات البروتينية المختلفة. وهذه قد لا تكون متوافقة مع إضافات نفسه أو كمية أو خلط المطلوبة. من ناحية أخرى، كسر البلورات إلى أجزاء أصغر أثناء عملية خلط قد لا تنال من النوعية الحيود ويمكن تحسين حتى النفث على سبيل المثال عند اقتحام الإبر طويلة أقصر من الشظايا. يمكن الاستعاضة عن إضافات مختلفة بدلاً من البارافين، إضافة إلى تحسين تدفق سرعة الاستقرار9. يتم إضافة ماج 7.9/9.7 للحيلولة دون تراسنيستيون إلى رقائقي المرحلة التي قد تحدث عند حقن في فراغ بيئات20 (مثل اندستاتيون ككسي في لكلس)، ولكن قد تم حذف إذا كان يتم إجراء التجربة في الضغط الجوي. في تجربتنا، بلورات كثيرة من البروتينات القابلة للذوبان يمكن ستابلي إدماجها في نظام الإجراءات الجزائية، ومع ذلك المفارقة بروتين غشائي حل بلورات غير مباشرة نمت في ميسوفاسيس ليبيديك وكثيراً ما يفترض أن سبب المنظفات يتم استخراجها من الكريستال في الدهن مثل البيئة المحيطة بهم. وفي مثل هذه الحالات، ينبغي أن يحاكم ل LCP استبدالها كلياً حاملة لزج بديل24،25،26،،من2729،30.

تعديلات لاختبار الكاميرا عالية السرعة يمكن أن تستوعب عينات فيها البلورات غير مرئية داخل الناقل. على سبيل المثال، يمكن تكوين الإضاءة لتسجيل الفيديو باستخدام مجهر ضوء الاستقطاب. وهذا سيؤدي بلورات بيريفرينجينت تظهر (توهج)، ويكشف أيضا أجزاء من المصفوفة الدهون التي في مرحلة رقائقي بيريفرينجينت.

التعديلات جانبا، من الأهمية بمكان أن إعداد كريستال البروتين قدر الإمكان تلبية المعايير التالية. ينبغي أن يكون حجم البلورات على النحو الأمثل تحقيق أقصى قدر من حيود مع التقليل من حاقن انسداد. ينبغي أن تكون كثافة الكريستال عالية بما فيه الكفاية للعائد بضرب معدل يكفي لتجميع مجموعات البيانات كاملة، ولكنها ليست كثيفة حتى فيما يتعلق بخرق استقرار الطائرة (عادة يمكن أن تضعف بكثافة عالية جداً؛ في حالة برازيلي، التكيف بضرب معدل 10-30% عادة تخاف د جيدا). ينبغي أن المصفوفة الدهن إلى مرحلة مكعب، وتعليق كريستال وينبغي أن تكون متجانسة.

TR-سفاكس يحمل مزايا رئيسية على تقنيات البلوري حلها مرة أخرى مثل الحيود لاوي لأن: أضرار الإشعاع محدودة بسبب المنهجية "الحيود قبل تدميرها"، سفاكس TR لديها قرار وقت واسع عبر العديد من الطلبات من ضخامة ووصولا إلى النطاق femtosecond، تسمح بلورات صغيرة فوتواكتيفيشن أفضل، ولا يلزم أن يكون فوتوسيكليس لمصلحة عكسها.

سفاكس TR في إكسفيل استخدام محقن لزوجة عالية مزايا هامة أكثر حاقن جت سائل من حيث تحقيق وفورات عينة. مقارنة مباشرة PYP6 وبرازيلي10، يشير على سبيل المثال، إلى انخفاض معامل 50 لنفس المقدار من حيود جمع الصور. من ناحية أخرى تملك طائرات السائل ميزة في ذلك التدفق سريع، ويعمل جمع البيانات بالسرعة الكاملة (بالتناوب الإطارات الداكنة والفاتحة)، دون اعتبار لاستقرار سرعة تيار حاقن (أو تلوث الضوء في إطارات الظلام). بينما الطائرة النفاثة لزج إضافة تحديات جديدة، يجدر النظر في أن السائل جت TR-سفاكس يستخدم كميات من البروتينات التي قد يكون من غير المعقول على الإطلاق لإنتاج للعديد من النظم البيولوجية ذات الصلة.

في الوقت الراهن، يقتصر إعداد نموذج لزج سفاكس TR كريستال التوافق مع وسيلة إيصال. على الرغم من أن هناك عدة شركات لزج بديلة تنفذ، أي وجد للعمل لجميع الحالات. بالإضافة إلى ذلك، تقديم نموذج مع حاقن لزوجة عالية ستخضع دائماً انسداد، أو تباطؤ حتى مع أوبتوموزيشن باستخدام هذا البروتوكول. قيد آخر تقنية هو تخفيض المتأصلة في معدل ضرب عند إذابة العينة لإحضاره إلى اكسترودابيليتي أوبتوميسيد.

في المستقبل، يمكن توسيع أساليب سفاكس TR من أهداف البروتين مع صباغات طبيعية لتلك مع photoswitches الاصطناعية. يجب أن تعتمد قياسات الوقت وتصميما على ردود الفعل التي لا يمكن أن فوتواكتيفاتيد على الاختلاط، ودرجة الحرارة-قفزة، المجالات الكهربائية، أو تقنيات التنشيط الأخرى التي لا يزال يتعين تكييفها مع البلورات المسلسل. ستضع الجمع بين هذه التكنولوجيات المسبّب جنبا إلى جنب مع زيادة توافر بيمتيمي إكسفيل، مع مرور الوقت، الأساس لفهم ديناميات الهيكلية وظيفة البروتين على المستوى الذري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونعترف جبهارد شيرتلير ورفائيل أبيلا وميلن كريس لدعم استخدام محاقن لزوجة عالية في هذه المبادرة. يعترف نيوتزي ريتشارد وفريقه للمناقشات بشأن حل الوقت علم البلورات وتسليم نموذج باستخدام محاقن لزوجة عالية. للدعم المالي، نحن نعترف "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية" للمنح 31003A_141235، 31003A_159558 (إلى ج. س.) و PZ00P3_174169 (إلى ب. ن.). هذا المشروع قد تلقي تمويلاً من الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 البحث والابتكار البرنامج منحة ماري-سكلودوفسكا-كوري 701646 أي اتفاق.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mosquito LCP Syringe Coupling TTP labtech store 3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl Hamilton HA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl Hamilton HA-81265
Monoolein Nu-Chek Prep, Inc. M-239
7.9 MAG Avanti Polar Lipids Inc. 850534O
50% w/v PEG 2000 Molecular Dimensions MD2-250-7
Paraffin (liquid) Sigma-Aldrich 1.07162
High speed camera Photron Photron Mini AX
High magnification lens Navitar 12X Zoom Lens System
Three axis stage ThorLabs PT3/M
Fiber light Thorlabs OSL2
Fused silica fiber Molex/Polymicro TSP-505375
Lite touch ferrule IDEX LT-100
ASU high viscosity injector Arizona State University Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pump Shimadzu LC-20AD
Electronic gas regulator Proportion Air GP1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  5. Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718 (2015).
  6. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  7. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
  8. Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
  9. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  10. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
  11. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
  12. Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
  13. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  14. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  15. Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
  16. Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
  17. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  18. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
  19. Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
  20. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309 (2014).
  21. Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
  22. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  23. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
  24. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
  25. Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703 (2017).
  26. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
  27. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484 (2016).
  28. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  29. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
  30. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
  31. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
  32. Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621 (2014).
  33. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  34. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  35. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
  36. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  37. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
  38. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292 (2016).
  39. Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
  40. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  41. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
  42. Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585 (2017).
  43. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
  44. Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602 (2017).
  45. Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
  46. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
  47. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
  48. James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
  49. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  50. Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).

Tags

الكيمياء، 144 قضية، حل وقت المسلسل علم البلورات، المرحلة مكعب lipidic، باكتيريورهودوبسين، بروتينات الغشاء، حاقن لزوجة عالية، مقرنة الثلاثية، الأشعة السينية الترون الحرة الليزر
تحسين قذف لزوجة عالية من ميكروكريستالس لحل وقت المسلسل Femtosecond البلورات في أشعة الليزر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

James, D., Weinert, T., Skopintsev,… More

James, D., Weinert, T., Skopintsev, P., Furrer, A., Gashi, D., Tanaka, T., Nango, E., Nogly, P., Standfuss, J. Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers. J. Vis. Exp. (144), e59087, doi:10.3791/59087 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter