Summary
Suksessen til en tid-løst føljetong femtosecond krystallografi eksperiment er avhengig for effektiv utvalg levering. Her beskriver vi for å optimalisere byggesystemer i bacteriorhodopsin microcrystals fra en høy viskositet mikro-ekstrudering injektor. Metodene er avhengig av prøven homogenisering med romanen treveis coupler og visualisering med et høyhastighets kamera.
Abstract
Høy viskositet mikro-ekstrudering sprøytebrukere har dramatisk redusert eksempel forbruk føljetong femtosecond krystallografisk eksperimenter (SFX) på X-ray gratis elektron lasere (XFELs). En rekke eksperimenter med lys-drevet proton pumpen bacteriorhodopsin har videre etablerte disse sprøytebrukere som foretrukket alternativ å levere krystaller for tid-løst føljetong femtosecond krystallografi (TR-SFX) å løse strukturelle endringer av proteiner etter photoactivation. For å få flere strukturelle øyeblikksbilder av høy kvalitet, er det viktig å samle inn store mengder data og sikre Lagersalg krystaller mellom hver pumpe laser puls. Her beskrive vi i detalj hvordan vi optimalisert byggesystemer i bacteriorhodopsin microcrystals for våre siste TR-SFX eksperimenter på Linac sammenhengende lys kilde (LCLS). Målet med metoden er å optimalisere ekstrudering for en stabil og kontinuerlig flyt samtidig opprettholde en høy tetthet av krystaller til å øke hastigheten på hvilke data kan samles i en TR-SFX eksperimentere. Vi oppnå dette målet ved å forberede lipidic kubikk fase med en homogen fordeling av krystaller bruker en roman treveis sprøyte kopling enheten etterfulgt av justere eksempel sammensetningen basert på målinger for ekstrudering stabilitet tatt med en rask kamerainnstillingene. Metodikken kan tilpasses å optimalisere flyten av andre microcrystals. Oppsettet vil være tilgjengelig for brukere av nye sveitsiske gratis elektron Laser.
Introduction
Føljetong femtosecond krystallografi (SFX) er en strukturell biologi teknikk som utnytter de unike egenskapene til X-ray gratis elektron lasere (XFEL) til å fastslå romtemperatur strukturer fra tusenvis av mikrometer store krystaller mens outrunning de fleste av stråling skader ved "Diffraksjon før ødeleggelsen" prinsippet1,2,3.
I en tid-løst forlengelse av SFX (TR-SFX) brukes femtosecond pulser fra XFEL å studere strukturelle endringer i proteiner4,5. Protein rundt aktiveres med en optisk laser (eller en annen aktivitet utløser) like før blir skutt av XFEL i en pumpe-sonden oppsett. Ved å kontrollere nøyaktig forsinkelsen mellom pumpe og sonde pulser, kan målet protein fanges i forskjellige stater. Molekylær filmer av strukturelle endringer over elleve størrelsesordener tid viser kraften i de nye XFEL kildene å studere dynamikken i flere protein mål6,7,8,9, 10,11,12,13. Prinsipielt blir metoden dynamisk spektroskopiske og statisk strukturelle teknikker til én, gir et glimt inn protein dynamics på nær Atom løsning.
Enkle systemer for TR-SFX kan inneholde en endogen utløser av aktivisering med et foto-sensitive komponent som retinal i bacteriorhodopsin (bR)9,10, chromophores i photosystem II12,13, fotoaktive gul protein (PYP)6,7 reversibel photoswitchable fluorescerende protein11, eller en photolyzable karbonmonoksid i myoglobin8. Spennende varianter av teknikken fortsatt i utvikling avhengige blanding og injisere ordninger14,15 for å studere enzymatiske reaksjoner eller et elektrisk felt brukt til å indusere strukturendringer16. Gitt at XFEL kilder har bare vært tilgjengelig i noen år og ekstrapolere tidligere suksesser i fremtiden, metoden viser potensial som en ekte spill-veksler med hensyn til vår forståelse av hvordan proteiner-funksjonen.
Fordi biologiske prøver er ødelagt av en enkelt eksponering til en høy effekt XFEL puls, var nye tilnærminger til protein krystallografi nødvendig. Blant disse prosedyrene, muligheten til å vokse store mengder uniform microcrystals måtte være utviklet17,18,19. For å aktivere datainnsamling på en XFEL, må disse krystallene leveres, forkastet, og deretter fornyes for hver XFEL puls. Gitt at XFELs brann brukbare pulser på 10-120 Hz, må prøve levering være rask, stabile og pålitelig, samtidig holde krystallene intakt og begrensende. Blant de mest vellykkede løsningene er en høy viskositet mikro-ekstrudering injektor, som leverer en fabrikkindustrien stadig streaming kolonnen romtemperatur krystall-laden lipidic kubikk fase (LCP) over den pulserende røntgenbilde stråle20. Tilfeldig orientert krystaller, innebygd i LCP strømmen, som er fanget opp av XFEL pulser scatter røntgen på en detektor der et Diffraksjon mønster er lagret. LCP var et naturlig valg for et eksempel levering medium som den brukes ofte som vekst medium for membran protein krystaller17,21,22,23, ennå andre høy viskositet carrier medier 24,25,26,27,28,29,30 og løselig proteiner31 har også vært brukt i injektoren. SFX med høy viskositet injektoren har vært vellykket i strukturen fastsettelse av membran proteiner13,32 inkludert G protein-kombinert reseptorer (GPCRs)33,34, 35,36,37, med kvalitet tilstrekkelig for native innfasing38,39 samtidig både tid og prøve effektiv. Foreløpig disse sprøytebrukere blir brukt mer rutinemessig for rom temperaturmålinger på synchrotron kilder28,30,40,41 og mer teknisk krevende TR-SFX eksperimenter på XFELs9,10,13,42.
Sammenlignbare TR-SFX eksperimenter har blitt utført ved hjelp av andre injektor typer som flytende fase levering i en fokusert munnstykke6,7,12, men denne metoden krever protein beløp ikke tilgjengelig for mange biologisk interessant mål. For bestemmelse av statiske strukturer bruker tyktflytende ekstrudering en gjennomsnittlig forbruk av 0.072 mg protein per 10 000 indekserte Diffraksjon mønstre i forhold til 9.35 mg for flytende jet er dyser rapportert (dvs. ca 130 ganger mer utvalg effektiv)20. Høy viskositet injektoren har vist seg å være en levedyktig eksempel levering enhet for TR-SFX mens bare å ofre noen av denne prøven effektivitet43. I Nogly et al. (2018)10, for eksempel eksempel forbruk var ca 1.5 mg per 10 000 indekserte mønstre, som sammenligner gunstig til lignende TR-SFX eksperimenter med PYP hvor gjennomsnittlig eksempel forbruk var mye høyere med 74 mg protein per 10 000 indekserte mønstre6. Høy viskositet sprøytebrukere har dermed klare fordeler når mengden av protein tilgjengelig begrenser eller krystaller dyrkes i LCP.
For TR-SFX med høy viskositet sprøytebrukere å gi den mest pålitelige data flere tekniske problemer må tas: siden strømmen fart må være over en minimumsverdi for kritiske; hit-prisen bør opprettholdes på et nivå som ikke gjengir datainnsamling langsom (f.eks større enn 5%); og utvalget har leveres uten overdreven avbrudd. Ideelt disse betingelsene oppfylles allerede lenge før en planlagt TR-SFX eksperiment bruke tilgjengelig XFEL gang så effektivt som mulig. Pricipally, en nedgang i LCP strømmen kan sondering krystaller som er aktivert med flere optiske laser puls og resultere i blandet aktive stater eller sondering pumpet materiale når umpumped materiale forventes i strålen. En ekstra fordel av injeksjon pre-tester er at nedetid under datainnsamlingen på en XFEL er minimert som henvist å erstatte dysene, endring ut ikke-ekstrudering prøvene, og andre vedlikeholdsoppgaver reduseres.
Her presenterer vi en metode for å optimalisere eksempel levering for TR-SFX datainnsamling med en høy viskositet mikro-ekstrudering injektor. For enkelhet stole metodene beskrevet ikke på tilgang til en X-ray kilde, selv om arbeid på en synchrotron beamline29 vil gi ytterligere informasjon om forventet hit priser og krystall Diffraksjon. Våre protokoller ble utviklet for å optimalisere eksperimenter for å fange retinal isomerization i proton pumpe bacteriorhodopsin10 og er gjennomført i to faser med krystall prøvene forberedte ekstrudering etterfulgt av overvåking byggesystemer ved hjelp av et høyhastighets kamera oppsett. I fase en blandes krystall-laden LCP med ekstra LCP, lav overgang temperatur lipider eller andre tilsetningsstoffer å sikre den endelige blandingen er egnet for levering i prøven miljøet uten tilstopping eller bremse. En ny tre-veis sprøyte coupler ble utviklet for å forbedre miksing ytelse og prøve homogenitet. Den andre fasen består av en ekstrudering test av et høyhastighets kamera direkte måle ekstrudering hastighet stabiliteten. Etter analyse av videodata, justeringer kan gjøres for eksempel forberedelse protokollen å forbedre eksperimentelle resultater. Disse prosedyrene kan tilpasses for å forberede andre proteiner TR-SFX datainnsamling, med minimal modifikasjoner, og vil bidra til effektiv bruk av begrenset XFEL beamtime. Med nye XFEL fasiliteter bare starte sin drift44,45 og overføring av injektor-baserte serielle data samling metoder til synchrotrons28,30,40,41 , de neste årene vil sikkert fortsette å tilby spennende ny innsikt i strukturelle dynamikken i et stadig bredere utvalg av protein mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein Crystal eksempel forberedelse
- Ca 30 min før prøven er som skal injiseres, basert laste 50 µL av krystall-laden monoolein LCP i 100 µL sprøyte.
- For injeksjon med lufttrykk: Last 10 µL av flytende parafin på baksiden av en andre sprøyte. Holder sprøyten vertikalt, utvise luftbobler i sprøyta.
- For injeksjon i vakuum miljø: Load 5 µL av MAG 7.9 og 5 µL av flytende parafin på baksiden av en andre sprøyte. Holder sprøyten vertikalt, utvise luftbobler i sprøyta.
- Koble sprøyten med parafin/MAG 7.9 til en standard sprøyte coupler, rense luften fra kabelendene ved forsiktig å trykke på stempelet til små (< 1 µL) av parafin/lipid vises på spissen av coupler nålen.
- Koble eksempel sprøyten til sprøyten coupler, ta vare å ikke innføre noen luft i utvalget. Bland lipid/parafinen ved bestått utvalget materialet gjennom kabelendene flere ganger.
- Legg 20 µL av ferdigblandet LCP (27% PEG, 100 mM Sorensen pH 5.6 + MO) i en annen 100 µL sprøyten. Fjerne luftbobler som nødvendig.
- Fjerne tom sprøyten fra kabelendene og fest ferdigblandet LCP til crystal som inneholder sprøyten ved hjelp av en standard sprøyte kopling. Passere prøven gjennom kabelendene 100 ganger.
Merk: Utvalg blanding kan varme prøven litt46. Blande bør gjøres med ett langsom rate der temperaturen på prøven kan holdes rimelig konstant. - Se utvalget for gjennomsiktighet mot en kilde til lys. Hvis en klar homogen LCP har dannet, gå til trinn 1.9.
- For å bringe prøven inn kubikk fasen, tilsett 3 µL av monoolein og bland 50 ganger (som beskrevet ovenfor). Gjenta denne fremgangsmåten bare til en gjennomsiktig fase har dannet for å unngå et overskudd av monoolein.
Merk: Dannelsen av the LCP er temperatur avhengig47 og best resultat over 20 ° C. Mengden av ekstra monoolein nødvendig vil avhenge av antall gjenværende precipitant løsning overført fra krystallisering. - Som en foreløpig test for eksempel stivhet (som forventet fra den LCP-fasen) og extrude-evne, koble den tom sprøyten fra sprøyten kabelendene og holder sprøyten vertikalt, presse litt prøve (< 2 µL) gjennom kabelendene. Hvis ekstrudert prøven danner en oppreist sylinder, er prøven klar for ekstrudering testing.
- Juster det totale volumet av prøven til 100 µL ved å legge mer ferdigblandet LCP (som trinn 1.5).
- Fest prøven sprøyten og to tomme sprøyter til treveis sprøyte coupler (renser luften fra coupler som før). Bland minst 50 ganger (eller til homogen) ved å sende halvparten av prøven i andre sprøyten og deretter trykke begge halvdelene av prøven i tredje sprøyten samtidig.
- Plass sprøyten som inneholder blandede prøven under stereo mikroskop bekrefte en homogen fordeling av krystaller.
2. testing eksempel ekstrudering ved hjelp av et høyhastighets kamera oppsett
- Avgjøre eksperimentelle parametere.
- Velg munnstykke størrelsen for testen.
Merk: Munnstykke størrelser er vanligvis 50 eller 75 µm interne diameter (ID), men alle størrelser fra omtrent 30-100 µm ID kan vurderes. Utvalget er basert på en balanse mellom mener tilstopping tid, bakgrunn spredning, prøve forbruk og hit-rate. - Beregne optimal trafikkflyten fart basert på eksperimentell laser størrelsen (1/e2 diameter), og dataene samling ordningen (f.eks innfelt lys og mørk) som skal brukes på XFEL.
- Beregne ønsket flow rate (
) av utvalget fra optimal vannstrøm speed (
) og valgte munnstykke diameter (
):
Bestemme flow rate (
) som skal angis på HPLC pumpen basert på forsterkning faktor (
) av injektoren.
Beregne maksimalt trykk (
) fra vurdert trykket munnstykket er modulbasert (
) og forsterkning faktoren av injektoren (
):
- Velg munnstykke størrelsen for testen.
- Oppsett av høy viskositet ekstrudering injektoren for frakoblet bruk som vist i figur 1.
Merk: Funksjonene injektor med hydraulisk ekstrudering drevet av en såkalt HPLC-pumpe, og bruker en co flytende helium gass skjede kontrollert av en gass regulator. Pumpen og regulator oppsettet er ikke omtalt i denne protokollen. Se kapittel fire i James (2015)48 en detaljert manual.- Tømme pumpen og alle vann linjer å sikre at flowrates er riktig. Tømme hydraulisk scenen av injektoren.
- Montere injektoren (eller kameraet) på en tre-akse scene å lette utforming og fokus for høyhastighets videoer. La plass rundt injeksjon punktet for linsen, belysning, reflekterende skjerm og en liten kanne fange brukt prøven.
- Konstruere en "dummy dyse" (et tomt reservoar med en dyse knyttet) og installere det på injektoren å lette posisjonering, fokus, og belysning.
- Montere høyhastighets kameraet med munnstykke spissen nær fokuspunkt for målet.
- Plasser reflekterende skjermen bak injektoren og juster lysintensiteten å foran lys munnstykket.
- Slå på og koble til kameraet med den medfølgende programvaren. Med en live video kjører for visuell tilbakemelding, plasser munnstykke spissen i midten av rammen, og bringe det i fokus med tre akser scenen.
- Juster lysintensiteten til munnstykket er tydelig og bakgrunnen lyser jevnt.
- Konfigurering av kameraet å spille høyhastighets time-lapse video.
- Angi bildefrekvens 1000 fps. Angi oppløsningen 512 x 512 bildepunkter.
- Med eksponeringstiden nå satt på Rammehastigheten, justere belysning til munnstykket er synlig (dvs. ikke under- eller overeksponert). Omplasser munnstykket tips slik at den midtstilles venstre og ligger i den øverste tredjedelen av rammen.
- Kjør noen bakgrunn korreksjon eller hvitbalanse operasjoner.
- Sett opp kameraet i time-lapse modus. Angi intervallet for å 30 s gjentas til 40 ganger, sette utløser modusen til tilfeldig (eller tilfeldig reset), og angi antall rammer til posten til 1000.
- Last reservoaret med 20 µL av prøven, og knytte kapillær munnstykket.
- Fest fylt reservoaret injektoren. Fest gassrøret til porten på munnstykket og starte gasstrømmen.
- Manuelt gå stempelet ved åpning innebygd ventilen og trykke sprøyten. Lukke ventilen når stempelet gjør god kontakt med prøven i reservoaret.
- Program pumpen med beregnede infusjonshastigheten og angi maksimalt trykk beregnet verdi (se trinn 2.1.3).
- Samtidig starte pumpen og kamera opptak.
- I ekstruderingsprosessen begynner, justere gass press for å øke stabiliteten. Øke gasstrykket hvis væsken danner en nedgang på tuppen av munnstykket i stedet for en kolonne. Nedgang press hvis byggesystemer er brutt på grunn av overdreven skjær fra gasstrømmen eller er oscillerende raskt pisket ().
- Overvåke byggesystemer (10 min er vanligvis nok til å gjenkjenne en homogen flyt tilstand) og når pumpetrykk kraftig ramper opp nær forventede sluttidspunktet, stoppe innspillingen, slå av pumpen, og ventilere systemtrykket ved å åpne avlastningsventilen.
- Analyse av video-filer
Merk: Utvalg ekstrudering som tydelig utilstrekkelig krever ikke en detaljert analyse. Men er det fremdeles nyttig å identifisere feilmodus slik at prøven kan optimaliseres.- Åpne videofilen med analyseprogramvare (f.eks Fiji49) og kalibrere måleverktøyene.
- Kalibrere målingene ved å velge en rekke kjent lengde i videobildet med markeringsverktøyet linje. Åpne vinduet Sette skala via analyser | Angi skala og angi kjent avstand og måleenheter.
Merk: Kjente diameteren på munnstykket gir en tilstrekkelig kalibrering lengde for disse målingene. - Finne en ramme i videoen hvor det er en sporbar funksjon synlig (f.eks en krystall) i ekstruderingsprosessen. Registrere ramme.
- Advance video til en ramme der den samme funksjonen er synlig, men har flyttet fra sin posisjon i forrige trinn. Registrere ramme.
- Bruke måleverktøy rett linje mål avstanden fra funksjonen start- og sluttpunktet via analyser | Tiltak.
Merk: Jo lenger sporbar avstand, færre feil måling vil påvirke beregningene - Beregne jet hastigheten fra målt avstand og tiden (antall forløpt rammer delt bildefrekvens.)
- Gjenta trinn 2.11.3-2.11.6 noen ganger for hvert segment av videoen.
- Tegne inn dataserier som i figur 2.
) av utvalget fra optimal vannstrøm speed (
) og valgte munnstykke diameter (
):
) som skal angis på HPLC pumpen basert på forsterkning faktor (
) av injektoren.
) fra vurdert trykket munnstykket er modulbasert (
) og forsterkning faktoren av injektoren (
):
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ideelle starte materialet for prosedyrene som er beskrevet her (Figur 3) er høye tettheter av microcrystals innlemmet i tyktflytende bærematerialet for injektoren. Operasjonen krever 50 µL av krystall laden operatør for hvert preparat. Dette kan dyrkes i LCP som med bR9,10 brukes her som eksempel (Figur 4), eller tilberedt med krystaller vokst i konvensjonelle damp diffusjon oppsett. Et utmerket video guide til krystallisering direkte i gastight sprøyter kan finnes i Ishchenko et al. (2016)37. BR er ideelle diameteren på krystallinsk platene rundt 20 μm som et godt kompromiss mellom Diffraksjon makt og homogen aktivisering av pumpe laser. Protein krystaller, tilberedt med protokoller som ble brukt til å samle inn TR-SFX data om proton pumpen bR som avslørte de lynraske endringene som oppstår etter Foton absorpsjon (figur 5).
Etter eksempel forberedelse på tre-måten kabelendene (figur 6AB), visuell inspeksjon av utvalget materialet i sprøyten viser eksempler på homogenitet (figur 6CD), og mikroskopet bilder av blandet prøven, både i den sprøyte på et lysbilde, kan bekrefte tettheten av krystaller og tillater målinger av krystall størrelser, krystall størrelsesDistribusjon og krystall tetthet. Prøven er i kubikk fase når levering mediet er klart (figur 7) og tyktflytende. Grumset blandinger er en indikasjon på at prøven er i en svamp fase eller lamellær fase, men er ikke avgjørende som høy krystall tetthet kan utydeliggjøre LCPer og klarhet. En lavt trykk test til å identifisere den flytende svamp fasen kan utføres ved å trekke sprøytestempelet fra prøven bak sprøyten. Lamellær fase kan lett identifiseres gjennom sin birefringence med polarisert * lys. Disse testene kombinert med en pre ekstrudering test er vanligvis tilstrekkelig til å rettferdiggjøre en test i injektoren.
Høy repetisjon krever av XFELs en flyt-hastighet som ikke kan observeres tilstrekkelig med lav rammen rate kameraer. Derfor ekstrudering karakterisering er gjort ved hjelp av et høyhastighets kamera (koplet til en forstørring linse) som kan spille time-lapse video. Video dataene er høyhastighets at rammer registreres på 1000 fps, og også time-lapse i at videoen spilles for 1 s hver 30 s. Denne data samling ordningen vil tillate datainnsamling under hele prøven testen (ca 10 min) uten å opprette uhåndterlig videofiler. Selv med redusert datasettet kan størrelse, video filer fremdeles være i overkant av 50 GB. Omsorg bør tas for å sikre tilstrekkelig lagringsplass til å lagre video dataene før testen begynner.
Under jet testen (figur 1), skal prøven extrude en lang (mer enn 200 µm) kontinuerlig kolonnen LCP som beveger seg i en nesten konstant hastighet (figur 2). Prøver som kjører i en dryppende modus angir at prøven viskositet er for lavt (figur 2). Eksempler kan ofte være utvinnes og blandet med mer monoolein eller parafin å tilpasse viskositet. Eksempler som danner en kolonne bør testes med høyhastighets kameraet. Data fra registreringen skal vise at byggesystemer holdes over en minimum hastighet diktert av eksperimentelle parametere. Ekstrudering hastighet bestemmes av måle lineære avstanden en funksjon i LCP strømmen reiser over flere rammer. Ekstrudering slow-downs som kan tilskrives uregelrett tresko garanterer retesting. Hvis de hardnakkethet bør spyling forbedres ved tilsetningsstoffer som parafin, ved å redusere tettheten av krystaller, eller velge en større diameter dyse. Krystaller normalt ikke vokst i et flytende medium (f.eks damp diffusjon) kan peletted med sentrifugering og innlemmet i LCP eller andre tyktflytende bærere. Profileksempler tidligere publikasjoner24,25,26,27,29,30.
Figur 1: høyhastighets kamera benk oppsett. Et bilde av en typisk Borstemmaskin oppsett med essensielle deler merket. Tre-akse scenen gir fleksibilitet i innramming og fokus bildet. Injektoren (vist med munnstykke og reservoaret festet) er montert vertikalt, og direkte foran målet linsen. Belysning i dette eksemplet er levert av en enkelt fiber lys opplysende utvalg av aksen, og gi en lysende felt på skjermen. Et eksempel montert og opplyst på denne måten gir et bilde som innfelte B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: høyhastighets kamera tester og dataanalyse. Bildet over er to LCP ekstrudering tester. Test A viser bR krystaller i LCP ekstrudering i en dryppende modus indikerer at prøven ikke er optimalisert. Testen B viser LCP ekstrudering danner en sammenhengende kolonne med LCP der krystaller kan spores, og ekstrudering hastighet kan beregnes. I dette eksemplet flytter en krystall innebygd i kolonnen LCP (50 µm diameter) 301 µm 8 ms (37,6 mm/s). To datasett fra forskjellige preparater av bacteriorhodopsin krystaller i LCP vises. Fire (eller flere) datapunkter fra hvert sekund av time-lapse høyhastighets kamera video (1 s for innspilling hver 30 s) ble tegnet. En stor spredning mellom datapunkt tatt fra en enkelt andre data samling perioden indikerer kortsiktige hastighet variasjon. Mens et glidende gjennomsnitt over hele serien viser lengre svingninger i flyten. Den øverste serien er fra en dårlig extruding prøve (høy sjanse for lys forurensning med to påfølgende pumpe laser pulser), og bunnen serien er fra et utvalg som utført optimalt. Den vannrette prikkete linjen angir hvilke mål ekstrudering hastighet via HPLC pumpen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: eksempel forberedelse flytskjema. Eksempel forberedelse starter med en høy tetthet av protein krystaller i LCP. Prøven er så blandet med lav overgang temperatur lipid, parafin og forberedt LCP til prøven kommer i kubikk fasen, og en rekke små tester for å angi at utvalget vil extrude i injektoren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Bacteriorhodopsin krystaller som starter materiale. Krystaller dyrkes i gass-tette sprøyter (A,) med LCP midt i den precipitant løsningen. Krystallisering er optimalisert for en høy tetthet av krystaller med en muligens smale størrelsesDistribusjon (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: strukturelle endringer i bacteriorhodopsin. TR-SFX avslører Ultrarask endringer i strukturen av proton pumpen bacteriorhodopsin. Her er bildet en modell av bR avledet fra TR-SFX data fra krystaller utarbeidet ved hjelp av protokoller i dette arbeidet. Informasjonsvinduet viser modellen med spesielle funksjoner i netthinnen binding lomme. Panelet til høyre viser endringer i retinal fra femtoseconds til millisekunder. Dette tallet ble gjengitt fra Nogly et al. (2018)10 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: tre-måten kabelendene. Den treveis coupler er en redusert døde-Y Volummikser designet for kompatibilitet med gastight sprøyter. 3D-gjengivelser av coupler, viser en oppbygning av montering (A), og en gjennomsiktig visning viser blanding kanal (B). Figuren viser en ikke-homogen krystall fordeling etter blanding med den standard coupler (C), og den resulterende suspensjonen etter blanding i den treveis coupler (D). Blande oppnås ved å skyve omtrent halvparten av prøven i en annen sprøyten (E), og deretter skyve halvdel i gjenværende sprøyten som illustrert av de blå pilene (F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: pre injeksjon testing indikatorer. Under eksempel forberedelse er flere små tester brukt for å indikere at prøven er i fasen og tilstrekkelig tyktflytende. Optisk klarhet er en indikator på at prøven er sannsynlig i kubikk fase. (A) en grumset prøve vises i sprøyten. (B) et klart eksempel vises, Merk eksamen linjene synlig gjennom utvalget til tross for høy tetthet av mikro-krystaller. Når lipid matrisen i kubikk fase, er det fortsatt solid-lignende når under stress. En lavt trykk test utføres ved å trekke sprøyten fra baksiden av prøven. Når prøven er for væske-lignende (indikativ av svamp fase) utvalget utvides for å fylle volum (C). I et positivt resultat av den samme testen (D) forblir prøven statisk tross trukket stempelet. Endelig er en makro skala ekstrudering testen utført ved å trykke på en liten mengde eksempel gjennom sprøyte kabelendene. En dråpe danner munnstykke tipset (E) eller en raskt bøying sylinder av LCP angir et utvalg som ikke er tyktflytende nok. Hvis prøven spyr, danner en sylinder, som fortsatt er oppreist over tid (F), deretter prøven kan gå videre til høyhastighets kamera tester. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TR-SFX metoden med tyktflytende ekstrudering injektoren har vist seg for å være en levedyktig teknikk for strukturelle dynamics studier av bacteriorhodopsin9,10 og photosystem II13 og nå synes klar til å studere proteiner kjører andre Foto biologiske prosesser som lys-drevet ion transport eller sensorisk persepsjon5,50. Protokollene beskrevet ovenfor ble utformet for å maksimere suksessen av TR-SFX innsamling av data på bacteriorhodopsin, men vi tror kan fungere som en mal for å optimalisere datainnsamlingen på andre prøver. På denne måten, mye av den edle beamtime tapt er på grunn av tilstopping eller dårlig eksempel ekstrudering kunne i stedet brukes til å samle inn bedre data på flere forsinkelser.
Det vanskeligste og kritiske trinnet i protokollen er tillegg av små mengder monoolein som bringer lipid matrisen i kubikk fasen (trinn 1.8). Vanskeligheten ligger i subtilitet av fase overgangen og den negative effekten på prøven når monoolein legges i overkant.
Endringer metodikken skal implementeres for å imøtekomme ulike protein krystaller. Disse kan ikke være kompatibel med samme tilsetningsstoffer eller beløp eller nødvendig miksing. På den annen side, bryte krystaller i mindre biter under miksing kan ikke kompromiss Diffraksjon kvalitet og kan selv forbedre spyling for eksempel når lenge pinner bryte i kortere fragmenter. Ulike tilsetningsstoffer kan erstattes i stedet for parafin, som er lagt til forbedre flyten hastighet stabilitet9. MAG 7.9/9,7 legges til forhindre trasnistion lamellær fase som kan oppstå når injisere inn vakuum miljøer20 (som CIX endstation på LCLS), men kan utelates hvis eksperimentet utføres med lufttrykk. I vår erfaring, kan mange krystaller fra løselig proteiner stabilt innlemmet i LCP, men litt ironisk membran protein krystaller ikke direkte dyrket i lipidic mesophases ofte løses antagelig fordi vaskemidler trekkes ut fra krystall inn i lipid-lignende miljøet rundt dem. I slike tilfeller bør det prøvd å helt erstatte LCP med en alternativ tyktflytende bærebølge24,25,26,27,29,30.
Modifikasjoner på høyhastighets kamera prøve rommer eksempler der krystallene ikke er synlig i holderen. Belysning kan for eksempel konfigureres til å spille inn video med polarisert * lys. Dette vil føre birefringent krystaller vises (som en glød) og avslører også deler av lipid matrisen som er i birefringent lamellær fase.
Endringer til side, er det avgjørende at protein krystall utarbeidelse så mye som mulig oppfyller følgende kriterier. Krystallene bør være optimalt dimensjonert for å maksimere Diffraksjon samtidig minimere injektor tilstopping. Crystal-tetthet bør være høy nok til å gi en hit-rate tilstrekkelig å samle komplette datasett, men ikke så tett som å invadere jet stabilitet (en tetthet som er for høy kan vanligvis bli utvannet; ved bR, tilpasning til et treff på 10-30% vanligvis arbeidet d vel). Lipid matrisen skal bringes i den kubiske fasen, og krystall suspensjon bør være homogene.
TR-SFX har store fordeler over andre tid-løst krystallografi teknikker som Laue Diffraksjon fordi: stråling skader er begrenset på grunn av "Diffraksjon før ødeleggelsen" metodikken, TR-SFX har en bred tid oppløsning over mange bestillinger av omfanget og ned til femtosecond området, små krystaller tillater bedre photoactivation, og photocycles rundt må ikke reverseres.
TR-SFX på en XFEL med høy viskositet injektoren har betydelige fordeler fremfor en flytende jet injektor i eksempel besparelser. Direkte sammenligne PYP6 og bR10, angir for eksempel en reduksjon av faktor på 50 for samme mengde samlet Diffraksjon bilder. Flytende jets har derimot en fordel flyt er rask og datainnsamling kjører i full fart (alternerende mørke og lyse rammer), uten hensyn til injektor strømmen fart stabilitet (eller lys forurensning i mørke rammer). Mens tyktflytende jet legger til nye utfordringer, er det verdt å vurdere at flytende jet TR-SFX bruker mengder protein som kan være helt urimelig å produsere for mange biologisk relevante systemer.
Foreløpig er tyktflytende eksempel forberedelse til TR-SFX begrenset av krystall kompatibilitet med levering medium. Selv om det har vært flere alternative tyktflytende bærere implementert, har ingen blitt funnet for å arbeide for alle tilfeller. I tillegg være prøve levering med en høy viskositet injektor alltid underlagt tilstopping eller bremse selv med optomozation bruker denne protokollen. En annen begrensning av teknikken er iboende reduksjon i treffprosent når fortynne prøven for å bringe den til optomised extrudability.
I fremtiden, kan TR-SFX metoder utvides fra protein mål med naturlige chromophores til de med syntetiske photoswitches. Tid-løst målene på reaksjoner som ikke kan photoactivated må stole på blanding, temperatur-hopp, elektrisk felt eller andre aktivisering teknologiene som ennå tilpasses føljetong krystallografi. En kombinasjon av disse utløsende teknologier sammen med økt tilgjengelighet av XFEL beamtime, over tid, legger grunnlaget for å forstå strukturelle dynamikken i protein funksjon på en Atom-nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen motstridende interesser.
Acknowledgments
Vi erkjenner Gebhard Schertler, Rafael Abela og Chris Milne for å støtte bruk av høy viskositet sprøytebrukere på PSI. Richard Neutze og hans team er anerkjent for diskusjoner om tid-løst krystallografi og prøve levering med høy viskositet sprøytebrukere. For finansiell støtte, vi erkjenner Swiss National Science Foundation for stipend 31003A_141235, 31003A_159558 (til js) og PZ00P3_174169 (til P.N.). Dette prosjektet har mottatt finansiering fra EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet under Marie-Sklodowska-Curie stipendet avtalen ingen 701646.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
References
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
- Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
- Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
- Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
- Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
- Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
- Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
- Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
- Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309 (2014).
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703 (2017).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484 (2016).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
- Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
- Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621 (2014).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292 (2016).
- Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
- Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
- Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585 (2017).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
- Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602 (2017).
- Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
- James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).
