Summary
时间解析的飞秒晶体学实验的成功取决于有效的样品传递。在这里, 我们描述了从高粘度微挤压喷射器中优化细菌视紫红质微晶挤出的方案。该方法依赖于样品同质化与一种新的三向耦合器和可视化与高速相机。
Abstract
在 x 射线自由电子激光器 (xfels) 的连续飞秒晶体学实验 (sfx) 中, 高粘度微挤出喷射器大幅降低了样品消耗。一系列使用光驱动质子泵细菌视灯相的实验进一步确定了这些注射剂作为为时间分辨的串行飞秒晶体学 (tr-sfx) 提供晶体的首选, 以解决结构变化。光激活后的蛋白质。为了获得高质量的多个结构快照, 必须收集大量数据, 并确保每个泵浦激光脉冲之间的晶体间隙。在这里, 我们详细介绍了我们如何优化细菌视紫红素微晶的挤出, 为我们最近在 linac 相干光源 (lcls) 进行的 tr-sfx 实验。该方法的目标是优化挤出, 以实现稳定和连续的流动, 同时保持高密度的晶体, 从而提高 tr-sfx 实验中收集数据的速度。我们通过使用一种新型的三向注射器耦合装置制备具有均匀分布的晶体的脂质立方相来实现这一目标, 然后根据高速对挤出稳定性的测量调整样品组成。摄像机设置。该方法可以调整, 以优化其他微晶的流动。该设置将提供给新的瑞士免费电子激光设施的用户。
Introduction
串行飞秒晶体学 (sfx) 是一种结构生物学技术, 利用 x 射线自由电子激光器 (xfel) 的独特特性, 从数千颗微米大小的晶体中确定室温结构, 同时超过大多数晶体。辐射损伤由 "衍射在破坏之前" 原则1,2,3。
在 sfx (TR-SFX) 的时间解析扩展中, 来自 xfel 的飞秒脉冲用于研究蛋白质4,5的结构变化。感兴趣的蛋白质是用光学激光 (或另一个活动触发器) 激活的, 就在 xfel 在泵-探针设置中被 xfel 击中之前。通过精确控制泵与探针脉冲之间的延迟, 可以在不同的状态下捕获目标蛋白。分子电影的结构变化超过十一个数量级的时间显示了新的 xfel 源的力量, 研究几个蛋白质靶标 6,7,8, 9, 10、11、12、13。主要是, 该方法将动态光谱和静态结构技术结合在一起, 提供了近原子分辨率下蛋白质动力学的一瞥。
tr-sfx 的简单系统可能包含具有光敏感成分的内源性激活触发器, 如视网膜在细菌视紫红质 (br)9,10, 光系统 ii,13中的色谱,光活性黄色蛋白 (pyp)6,7可逆光敏荧光蛋白11, 或肌红蛋白8中的可光解一氧化碳.该技术的令人兴奋的变化仍在开发中, 它依靠混合和注入方案14,15 来研究酶反应或用于诱发结构变化的电场16。鉴于 xfel 源只提供了几年, 并将过去的成功推断到未来, 该方法显示了我们对蛋白质功能的理解作为真正改变游戏规则的潜力。
由于生物样本被一次暴露在高功率 xfel 脉冲中破坏, 因此有必要采用新的蛋白质晶体学方法。在这些程序中, 需要开发生长大量均匀微晶的能力 17、18、19.为了在 xfel 中进行数据收集, 必须交付、丢弃这些晶体, 然后为每个 xfel 脉冲续订这些晶体。鉴于 xfels 在10-120 赫兹的情况下发射可用脉冲, 样品交付必须快速、稳定和可靠, 同时保持晶体的完整性并限制消耗。其中最成功的解决方案是高粘度微挤出喷射器, 它提供了一个连续流的液晶脂质立方相 (lcp) 跨越脉冲 x 射线光束20的流动柱.嵌入在 lcp 流中的随机取向晶体, 由 xfel 脉冲将 x 射线散射到记录衍射图的探测器上。lcp 是样品输送介质的自然选择, 因为它经常被用作 17、21、22、23等膜蛋白晶体的生长介质, 而其他高粘度载体介质24、25、26、27、28、29、30 和可溶性蛋白质31也被用于注射器中。sfx 与高粘度喷射器已成功地在结构测定膜蛋白 13,32包括 g 蛋白耦合受体 (gpcr)33,34, 35、36、37, 数据质量足以满足本地阶段38、39 的要求, 同时同时具有时间和样本效率。目前, 这些喷油器在同步加速器源 28、30、40、41以及技术上更经常地用于室温测量。在 xfels9、10、13、42上需要tr-sfx 实验。
可比较的 tr-sfx 实验是使用其他喷射器类型进行的, 如液相输送在流量聚焦喷嘴 6,7, 12, 然而, 这种方法需要蛋白质量不能提供给许多生物上有趣的目标。据报告, 在使用粘性挤出的情况下, 每 10, 000个指数化衍射模式平均消耗0.72 毫克蛋白质, 而液体喷射喷嘴的平均消费量为9.35 毫克 (即样品增加约 130倍)效率)20。高粘度喷油器已被证明是 TR-SFX 的一个可行的样品输送装置, 而只是牺牲了其中的一部分样品效率43。例如, 在 nogly 等人 (2018年)10中, 样本消费量约为每 10, 000个指数模式1.5 毫克, 这与使用 pyp 进行的类似 tr-sfx 实验相比是有利的, 该实验的平均样本消费量要高得多, 每 10, 000 人中有74毫克蛋白质索引模式 6。因此, 当可用蛋白质的数量受到限制或晶体直接生长在 lcp 中时, 高粘度喷射器具有明显的优势。
要使 tr-sfx 使用高粘度喷射器产生最可靠的数据, 需要解决几个技术问题: 流速需要保持在最小临界值以上;命中率应保持在不会使数据收集缓慢的水平 (例如, 大于 5%); 必须在没有过度中断的情况下交付样本。理想情况下, 早在计划的 tr-sfx 实验尽可能高效地使用可用 xfel 时间之前, 这些条件就已经得到满足。在合理的情况下, lcp 流的减慢可能会使探测晶体被多个光学激光脉冲激活, 并导致混合活动状态, 或探测泵浦材料时, 泵送材料预计在光束中。注塑预测试的另一个好处是, xfel 数据收集过程中的停机时间降至最低, 因为时间将减少到更换堵塞的喷嘴、更换非挤出样品和其他维护任务。
在这里, 我们提出了一种使用高粘度微挤出喷射器优化 tr-sfx 数据收集样品交付的方法。为了简单起见, 所描述的方法并不依赖于获得 x 射线源, 尽管在同步加速器波束线 29上的工作将提供有关预期命中率和晶体衍射的进一步信息。我们的协议是为了优化实验来捕获质子泵细菌-视紫红质10中的视网膜异构, 并分两个阶段进行, 从准备挤出的晶体样品开始, 然后对挤出进行监测使用高速摄像机设置。在第一阶段, 晶体满载的 lcp 与额外的 lcp、低过渡温度脂质或其他添加剂混合, 以确保最终混合物适合在不堵塞或减速的情况下输送到样品环境中。为了提高混合性能和样品均匀性, 研制了一种新型的三向注射器耦合器。第二阶段由高速摄像机记录的挤压试验组成, 直接测量挤压速度稳定性。在对视频数据进行分析后, 可以对样品制备协议进行调整, 以提高实验结果。这些过程可以调整为 tr-sfx 数据收集准备其他蛋白质, 只需进行最少的修改, 这将有助于有效利用有限的 xfel 波束时间。随着新的 xfel 设施刚刚开始运作44、45 , 并将基于注射器的串行数据收集方法转移到 28、30、40、41的同步加速器, 未来几年一定会继续为越来越广泛的蛋白质靶标的结构动力学提供令人兴奋的新见解。
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Protocol
1. 蛋白质晶体样品制备
- 在样品注射前大约 30分钟, 将50μl 的基于晶体的单油蛋白基 lcp 装入100μl 注射器中。
- 用于在大气压力下注射: 将10μl 的液体石蜡装入第二个注射器的背面。垂直按住注射器, 排出注射器中的气泡。
- 用于注入真空环境: 将5μl 的 mag 7.9 和5μl 的液体石蜡加载到第二个注射器的背面。垂直按住注射器, 排出注射器中的气泡。
- 用石蜡与 mag 7.9 连接注射器到标准的注射器耦合器, 轻轻按压柱塞, 将空气从耦合器中清除, 直到在耦合器针头处可见少量 (& lt;1 μl)。
- 将样品注射器连接到注射器耦合器, 注意不要在样品中引入任何空气。通过多次通过耦合器将样品材料传递到脂肪-石蜡中。
- 将20μl 预混 lcp (27% peg, 100 mm sorensen ph 5.6 + mo) 加载到另一个100μl 注射器中。根据需要去除气泡。
- 从耦合器中取出空注射器, 并使用标准注射器耦合器将预混 lcp 连接到含有注射器的晶体上。通过耦合器将样品传递100次。
注: 样品混合可能会使样品稍微加热46。在样品温度可以保持合理稳定的情况下, 应以较慢的速度进行混合。 - 根据光源检查样品的透明度。如果形成了明确的齐次 lcp, 请转到步骤1.9。
- 要将样品放入立方相, 请加入3μl 单烯烃, 并混合 50次 (如上文所述)。重复此过程, 直到形成透明的阶段, 以避免过量的单烯烃。
注: lcp 的形成与温度有关 47 , 在20°c 以上略有达到最佳效果。所需的额外单烯烃的量将取决于从结晶中结转的残留沉淀液的体积。 - 作为样品刚度 (如 lcp 阶段所预期的那样) 和挤出能力的初步测试, 将空注射器从注射器耦合器中分离出来, 并垂直按住注射器, 通过耦合器挤压少量样品 (和 lt;2 μl)。如果挤出样品形成一个直立的圆柱体, 那么样品就可以进行挤出测试了。
- 通过添加更多预混 lcp (如步骤1.5 中所示), 将样品的总体积调整为100μl。
- 将样品注射器和两个空注射器连接到三通注射器耦合器 (像以前一样从耦合器中净化空气)。将一半的样品放入第二个注射器中, 然后同时将样品的两个一半按入第三个注射器, 将样品混合至少 50次 (或直到均匀)。
- 将含有混合样品的注射器置于立体显微镜下, 以验证晶体的均匀分布。
2. 使用高速摄像机设置测试样品挤出
- 确定实验参数。
- 选择测试的喷嘴尺寸。
注: 喷嘴尺寸通常为50或75μm 内径 (id), 但可以考虑从大约 30-100μm id 的任何尺寸。选择基于平均堵塞时间、背景散射、样品消耗和命中率之间的平衡。 - 根据实验激光光斑尺寸 (直径为 2 ) 和将在 xfel 使用的数据收集方案 (例如, 交错光和暗) 计算最佳流速。
- 根据最佳流速 (
) 和所选喷嘴直径 (
) 计算样品的所需流速 ():
根据喷油器的放大
系数 (
) 确定应在高效液相色谱泵上输入的流速 ()。
根据喷嘴配件 (
) 的额定压力和喷油器 (
) 的放大系数计算最大压力 ():
- 选择测试的喷嘴尺寸。
- 设置用于离线使用的高粘度挤出喷射器, 如图 1所示。
注: 喷油器通过高效液相色谱泵驱动的液压挤出功能, 并使用由气体调节器控制的共流氦气体护套。该协议不讨论泵和调节器的设置。详情手册见《詹姆斯》 (2015年)48第四章。- 清除泵和所有水线, 以确保流量准确。清洗喷油器的液压级。
- 将喷油器 (或相机) 安装在三轴舞台上, 以方便高速视频的框架和对焦。为物镜、照明、反光屏幕和小烧杯留出注射点周围的空间, 以捕捉已用样品。
- 构建一个 "虚拟喷嘴" (一个带有喷嘴的空蓄水池), 并将其安装在喷油器上, 以方便定位、聚焦和照明。
- 将高速摄像机安装在目标的焦点附近, 将喷嘴尖端固定在目标的焦距附近。
- 将反射屏幕放置在喷油器后面, 并将照明调整为喷嘴的前灯。
- 打开并使用提供的软件连接到相机。通过现场视频进行视觉反馈, 将喷嘴尖端放置在框架的中心, 并将其与三轴阶段一起聚焦。
- 调整照明, 直到喷嘴清晰可见, 背景均匀照明。
- 配置摄像机以录制高速延时视频。
- 将帧率设置为 1000 fps。将分辨率设置为 512 x 512 像素。
- 现在, 曝光时间由帧速率确定, 调整照明水平, 直到喷嘴可见 (即, 而不是曝光不足或过度曝光)。重新定位喷嘴尖端, 使其从左到右居中, 位于框架的前三分之一。
- 运行任何背景校正或白平衡操作。
- 在延时模式下设置相机。将间隔设置为30秒, 并重复到40次, 将触发模式设置为随机(或随机重置), 并输入要记录为1000秒的帧数。
- 用测试样品的20μl 装入储液库, 并连接毛细管喷嘴。
- 将已填充的水库连接到喷射器。将气线连接到喷嘴上的端口, 然后启动气体流动。
- 通过打开在线阀门并按下注射器, 手动推进活塞。当活塞与储罐中的样品进行实心接触时, 请关闭阀门。
- 使用计算出的流量对泵进行编程, 并将最大压力设置为计算值 (请参阅步骤 2.1.3)。
- 同时启动泵和相机录制。
- 当挤压开始时, 调整气体压力以增加稳定性。如果流体在喷嘴的尖端而不是柱处形成下降, 则增加气体压力。如果挤压因气流的过度剪切而破裂, 或快速振荡 (抽打), 则可降低压力。
- 监控挤出 (10分钟通常足以识别均匀流动条件), 当泵压力在接近预期结束时间的时候急剧上升时, 停止记录, 关闭泵, 并通过打开安全阀来释放系统压力。
- 视频文件分析
注: 明显不足的样品挤出不需要详细分析。但是, 确定故障模式以优化示例仍然很有用。- 使用分析软件 (例如, 斐济49) 打开视频文件并校准测量工具。
- 使用换行工具在视频图像中选择已知长度的线, 以校准测量值。通过 "分析" 打开"设置缩放"窗口设置 "缩放"并输入已知距离和度量单位。
注: 喷嘴的已知直径为这些测量提供了足够的校准长度。 - 在视频中查找一个帧, 其中有一个可跟踪的特征在拉伸中可见 (例如, 晶体)。记录帧号。
- 将视频推进到同一功能可见但已从上一步中的位置移动的帧。记录帧号。
- 使用直线测量工具, 通过 "分析" 测量与要素起点和终点之间的距离测量。
注: 可跟踪距离越长, 测量中的误差越少, 将影响计算 - 根据测量的距离和经过的时间 (通过的帧数除以帧数) 计算喷射速度。
- 重复步骤 2.11.3-对视频的每个片段2.11.6 几次。
- 绘制数据系列, 如图 2所示。
) 和所选喷嘴直径 (
) 计算样品的所需流速 ():
系数 (
) 确定应在高效液相色谱泵上输入的流速 ()。
) 的额定压力和喷油器 (
) 的放大系数计算最大压力 ():
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Representative Results
此处描述的过程 (图 3) 的理想起始材料是将微晶高密度集成到喷射器的粘性载体介质中。该程序要求每个制备过程中大约有50μl 的含晶载流子。它们可以直接在 lcp 中生长, 就像这里使用的 br9, 10 一样, 例如 (图 4), 也可以使用传统蒸汽扩散设置中生长的晶体进行制备。在 ishchenko 等人 (2016年)37中可以找到直接在气密注射器中结晶的优秀视频指南。使用 br, 晶体板的理想直径约为 20μm, 这是在衍射功率和泵浦激光器的均匀激活之间的一个很好的妥协。使用上述协议制备的蛋白质晶体被用来收集质子泵 br 上的 tr-sfx 数据, 这些数据揭示了光子吸收后发生的超快变化 (图 5)。
在使用三通耦合器制备样品 (图 6a, b) 后, 对注射器中样品材料的目视检查显示样品均匀性 (图 6A, d) 和混合样品的显微镜图像, 均在注射器和滑块上, 可以确认晶体的密度, 并允许测量晶体大小、晶体尺寸分布和晶体密度。当输送介质清晰 (图 7) 且粘稠时, 样品处于立方阶段。混浊混合物是样品处于海绵相或层状相的表示, 但不是决定性的, 因为高晶体密度可能会掩盖 lcp 的清晰度。通过将注射器柱塞从注射器背面的样品中拉出来, 可以进行短暂的低压测试, 以识别液体海绵相。通过偏振光显微镜, 可以很容易地通过其双折射来识别层状相位。这些测试加上预挤出试验通常足以证明在喷油器中进行试验是合理的。
xfels 的高重复率要求低帧速率相机无法充分观察到的流速。因此, 挤压表征是使用高速摄像机 (耦合到高放大镜) 完成的, 可以录制延时视频。视频数据是高速的, 因为帧记录在 1000 fps, 而且在该视频中的延时每30秒录制1秒。此数据收集方案将允许在整个样本测试期间 (约 10分钟) 收集数据, 而无需创建无法管理的视频文件。即使减少了数据集大小, 视频文件仍可能超过 50 gb。应注意确保有足够的存储空间, 以便在测试开始前保存视频数据。
在射流试验期间 (图 1), 样品应挤出一个长 (超过 200μm) 的 lcp 连续柱, 该柱以几乎恒定的速度移动 (图 2)。在滴水模式下运行的样品表明样品粘度太低 (图 2)。样品通常可以回收和混合更多的单烯烃或石蜡, 以适应粘度。形成柱的样品应使用高速摄像机进行测试。记录中的数据应显示挤出保持在实验参数所决定的最小速度之上。挤出速度是通过测量 lcp 流中的特征在多个帧上的线性距离来确定的。可归因于异常堵塞的挤压减速值得重新测试。如果它们持续喷射, 应通过石蜡等添加剂、降低晶体密度或选择直径较大的喷嘴来改进。通常不在粘性介质中生长的晶体 (如蒸汽扩散) 可以通过离心进行颗粒状, 并纳入 lcp 或其他粘性载体中。例如, 见以前的出版物24、25、26、27、29、30。
图 1: 高速摄像机工作台设置.贴有必要部件标签的典型台式设置的照片。三轴阶段提供了灵活的框架和对焦图像。喷油器 (显示与喷嘴和储罐连接) 垂直安装, 并直接安装在物镜前面。本例中的照明是由单个光纤光照亮样品的轴, 并在屏幕上提供一个明亮的字段。以这种方式安装和照明的示例提供了一个类似于插入 b 中的图像. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 高速摄像机测试和数据分析.上图为两次 lcp 挤出试验。测试 a 显示 br 晶体在 lcp 挤压在滴水模式下, 表明样品没有优化。试验 b 显示 lcp 挤压形成了一个连续的 lcp 柱, 在这里可以跟踪晶体, 并且可以计算挤压速度。在本例中, 嵌入在 lcp 柱 (50 微米直径) 中的晶体以8毫秒 (37.6 m/) 的形式移动301微米。显示了 lcp 中不同制备的细菌视紫红质晶体的两个数据集。绘制了延时高速摄像机视频每秒的四个 (或更多) 数据点 (每30秒录制 1秒)。从单个数据收集周期中提取的数据点之间的较大分布表明短期速度变化。而整个数据系列的移动平均线显示了流量的更长波动。顶部系列来自一个挤出不良的样品 (两个连续的泵浦激光脉冲对光污染的几率很高), 底部系列来自于性能最佳的样品。水平虚线表示通过高效液相色谱泵设定的目标挤出速度。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 样品制备流程图.样品制备从嵌入在 lcp 中的高密度蛋白质晶体开始。然后将样品与低过渡温度脂、石蜡混合, 制备 lcp, 直到样品进入立方阶段, 并通过一系列小型测试, 以表明样品将在喷射器中挤出。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 细菌视紫红素晶体作为起始材料.晶体生长在气密注射器 (a) 中, lcp 浸入沉淀液中。结晶优化了高密度的晶体, 其尺寸分布可能很窄 (b)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 细菌视紫红质的结构变化.tr-sfx 揭示了质子泵细菌性视紫红质结构的超快变化。本文介绍了从使用本工作中概述的协议制备的晶体中获得的 tr-sfx 数据中获得的 br 模型。左侧面板显示视网膜绑定口袋中突出显示功能的模型。右侧面板显示视网膜中的变化, 从飞秒到毫秒。经允许, 这一数字转载于 nogly 等人 (2018年).请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 三通耦合器.三通耦合器是一种减少的死体积 y 混频器, 专为与气密注射器兼容而设计。耦合器的3d 渲染, 显示组件 (a) 的爆炸视图和显示混合通道 (b) 的透明视图。该图显示了与标准耦合器 (c) 混合后的不均匀晶体分布, 以及在三通耦合器 (d) 中混合后产生的悬浮液。混合是通过将大约一半的样品推入另一个注射器 (e), 然后将两个一半推入剩余的注射器一起完成的, 如蓝色箭头 (f) 所示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 注射前测试指标.在样品制备过程中, 使用了几个小测试来表明样品处于阶段, 而且具有足够的粘性。光学清晰度是样品可能在立方阶段的一个指标。(a) 注射器中显示了一个混浊样品。(b) 显示一个清晰的样品, 注意通过样品可见的毕业线, 尽管微晶体密度很高。当脂质基质处于立方阶段时, 在无应力条件下, 它保持像固体一样。通过将注射器从样品背面拉出来进行低压测试。当样品是太液体状 (表明海绵阶段) 时, 样品膨胀以填充体积 (c)。在同一测试 (d) 的阳性结果中, 尽管撤出了柱塞, 样品仍然保持不变。最后, 通过注射器耦合器按少量样品进行宏观挤压试验。在喷嘴尖端 (e) 形成的液滴或 lcp 的快速弯曲圆筒表示样品不够粘性。如果样品挤出, 形成一个圆柱体, 随着时间的推移 (f) 保持直立, 那么样品可能会推进到高速相机测试。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
tr-sfx 方法与粘性挤出喷射器已被证明是一种可行的技术,结构动力学研究细菌视紫红质 9,10 和光系统 ii13 , 现在似乎准备研究蛋白质驱动其他照片生物过程, 如光驱动离子传输或感官感知5,50。上述协议旨在最大限度地提高 TR-SFX 细菌视紫红质数据收集的成功率, 但我们相信可以作为模板, 优化其他样本的数据收集。这样, 目前因堵塞或样品挤出不良而损失的许多宝贵的波束时间, 可以在更多的时间延迟下用于收集更好的数据。
该协议中最困难、最关键的一步是添加少量的单烯烃, 将脂质基质带入立方阶段 (步骤 1.8)。困难在于相变的微妙性和过量添加单烯烃对样品的负面影响。
应对方法进行修改, 以适应不同的蛋白质晶体。这些可能与相同的添加剂或数量或所需的混合不兼容。另一方面, 在混合过程中将晶体分解成较小的碎片可能不会影响衍射质量, 甚至可以改善喷射, 例如, 当长针断裂成较短的碎片时。用不同的添加剂代替石蜡, 以提高流动速度稳定性.增加 mag 7.9/9.7 是为了防止在真空环境中注入 20 (如 lcls 的 cxi 端站) 时可能发生的层状相位的趋势, 但如果在大气压力下进行实验, 则可能会省略。根据我们的经验, 许多可溶性蛋白质中的晶体可以稳定地纳入 lcp, 但有些具有讽刺意味的是, 没有直接生长在脂质中成膜酶中的蛋白质晶体往往会溶解, 大概是因为从晶体中提取洗涤剂进入他们周围的脂质样的环境。在这种情况下, 应尝试用 24、25、26、27、29、30的备用粘性载体完全取代 lcp。
对高速相机测试的修改可以适应在载体内看不到晶体的样品。例如, 可以将照明配置为使用偏振光显微镜录制视频。这将导致双折射晶体出现 (作为辉光), 也揭示了部分的脂质矩阵是在双折射层状阶段。
撇开修改不谈, 蛋白质晶体的制备必须尽可能满足以下标准。晶体的尺寸应优化, 以最大限度地提高衍射, 同时最大限度地减少喷油器堵塞。晶体密度应足够高, 足以产生足以收集完整数据集的命中率, 但不要密度到损害射流稳定性的程度 (这种密度过高通常可以稀释; 在 br 的情况下, 调整到10-30 的命中率通常会发生问题d 很好)。脂质基质应进入立方相, 晶体悬浮液应均匀。
tr-sfx 比 laue 衍射等其他时间解析的晶体学技术具有主要优势, 因为: 由于 "销毁前的衍射" 方法, 辐射损伤是有限的, tr-sfx 在许多订单上具有广泛的时间分辨率。小晶体允许更好的光活化, 而感兴趣的光环不需要是可逆的。
使用高粘度喷射器的 tr-sfx 在样品节约方面比液体喷射式喷射器具有显著优势。例如, 直接比较 pyp6和 br10, 表明相同数量的衍射图像减少了50的系数。另一方面液体喷射器有一个优点, 那就是流量是快速的, 并且数据收集在全速运行 (交替黑暗和轻的框架), 不用考虑喷油器流速度稳定性 (或光污染在黑暗的框架)。虽然粘性喷射机确实增加了新的挑战, 值得考虑的是, 液体喷射机 tr-sfx 使用的蛋白质数量可能是绝对不合理的, 为许多生物相关的系统生产。
目前, tr-sfx 的粘性样品制备受到晶体与输送介质相容性的限制。虽然已经实施了几种替代的粘性载体, 但没有发现任何载波适用于所有情况。此外, 使用高粘度喷油器的样品输送将始终受到堵塞, 或放缓, 即使使用此协议的光学。该技术的另一个局限性是稀释样品以将其带到可接受的挤出物时, 命中率的内在降低。
在未来, tr-sfx 方法可以从具有天然色谱的蛋白质靶点扩展到具有合成光开关的蛋白质靶点。对不能光激活的反应进行的时间分辨测量必须依靠混合、温度跃升、电场或其他尚未适应串行晶体学的活化技术。这些触发技术与 xfel 波束时间的增加相结合, 随着时间的推移, 将为了解原子水平上蛋白质功能的结构动力学奠定基础。
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Disclosures
提交人声明没有相互冲突的利益。
Acknowledgments
我们感谢 gebhard schertler、rafael abela 和 chris milne 支持在 psi 使用高粘度喷射器。richard neutze 和他的团队被认可讨论时间解析的晶体学和样品交付使用高粘度喷射器。为了提供财政支助, 我们感谢瑞士国家科学基金会提供赠款31003A_141235、31003A_159558 (向 j. s.) 和 PZ00P3_174169 (向 p. n.) 提供的赠款。根据 marie-sklolowska-curie 第706号赠款协议, 该项目得到了欧洲联盟 "地平线 2020" 研究和创新方案的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
References
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