Summary
Framgången för en tid-löst seriell femtosekund kristallografi experiment är beroende av effektiva prov leverans. Här beskriver vi protokoll för att optimera extrudering av bacteriorhodopsin microcrystals från en hög viskositet mikro-extrudering injektor. Metodiken bygger på provet homogenisering med en roman trevägs koppling och visualisering med en höghastighetskamera.
Abstract
High-viscosity mikro-extrudering spridare har dramatiskt minskat prov förbrukning i seriell femtosekund kristallografiska experiment (SFX) på röntgen fri elektron lasrar (XFELs). En serie experiment med hjälp av ljus-driven proton pump bacteriorhodopsin har ytterligare etablerat dessa spridare som föredra att leverera kristaller för tid-löst seriell femtosekund crystallography (TR-SFX) att lösa strukturella förändringar av proteiner efter ljusaktivering. För att få flera strukturella ögonblicksbilder av hög kvalitet, är det viktigt att samla in stora mängder data och säkerställa clearance av kristaller mellan varje pump laserpuls. Här beskriver vi i detalj hur vi optimerat extrudering av bacteriorhodopsin microcrystals för våra senaste TR-SFX experiment på Linac koherent ljus källa (LCLS). Målet med metoden är att optimera extrudering för en stabil och kontinuerlig flöde samtidigt som en hög täthet av kristaller för att öka hastigheten på vilka data som kan samlas i en TR-SFX experimentera. Vi uppnår detta mål genom att förbereda lipidic cubic fas med en homogen fördelning av kristaller med en roman trevägs spruta kopplingsanordning följt genom att justera provets sammansättning baserat på mätningar av extrudering stabilitet med ett höghastighetståg kameran setup. Metoden kan anpassas för att optimera flödet av andra microcrystals. Installationen kommer att vara tillgängliga för användare av den nya schweiziska fri elektron Laser-anläggningen.
Introduction
Seriell femtosekund kristallografi (SFX) är en strukturbiologi-teknik som utnyttjar de unika egenskaperna hos röntgen fri elektron lasrar (XFEL) att fastställa rumstemperatur strukturer från tusentals mikrometerstort kristaller medan outrunning de flesta av den strålning skadan ”diffraktion innan förstörelsen” principen1,2,3.
I en tid-löst förlängning av SFX (TR-SFX) används de femtosekund pulserna från XFEL att studera strukturella förändringar i proteiner4,5. Proteinet av intresse aktiveras med en optisk laser (eller en annan aktivitet trigger) strax före att bli skjuten av XFEL i en pump-probe setup. Genom att exakt kontrollera fördröjningen mellan pumpen och sonden pulser, kan Målproteinet fångas i olika stater. Molekylär filmer av strukturella förändringar över elva storleksordningar i tid visar kraften i de nya XFEL källorna att studera dynamiken i flera protein mål6,7,8,9, 10,11,12,13. Huvudsakligen, sammanfogar metoden de dynamiska spektroskopiska och statiska strukturella teknikerna till en, som ger en glimt till protein dynamics på nära atomär upplösning.
Enkla system för TR-SFX kan innehålla en endogen utlösa aktivering med en foto-känslig komponent som retinal bacteriorhodopsin (bR)9,10, chromophores i fotosystem II12,13, fotoaktiva gul protein (PYP)6,7 reversibelt photoswitchable fluorescerande protein11eller en photolyzable kolmonoxid i myoglobin8. Spännande varianter av tekniken fortfarande under utveckling beroende mix och injicera system14,15 för att studera enzymatiska reaktioner eller ett elektriskt fält används för att framkalla strukturella förändringar16. Med tanke på att XFEL källor har bara funnits i några år och extrapolera tidigare framgångar in i framtiden, metoden visar potential som en riktig spel-växlare med avseende på vår förståelse av hur proteiner fungerar.
Eftersom biologiska prover förstörs av en enstaka exponering för en hög effekt XFEL puls, krävdes nya strategier för röntgenkristallografi. Bland dessa förfaranden, möjlighet att odla stora mängder enhetliga microcrystals behövde vara utvecklade17,18,19. För att aktivera datainsamling på en XFEL, måste dessa kristaller levereras, kasseras, och sedan förnyas för varje XFEL puls. Med tanke på att XFELs eld användbara pulser på 10-120 Hz, måste prov leverans vara snabb, stabil och pålitlig, samtidigt också hålla kristallerna intakt och begränsa konsumtion. Bland de mest framgångsrika lösningarna är en hög viskositet mikro-extrudering injektor, som levererar ett musikutbud streaming kolumn i rumstemperatur crystal-lastad lipidic cubic fas (LCP) över de pulsade X-ray balk20. Slumpmässigt orienterade kristaller, inbäddade i LCP-bäcken, som avlyssnas av XFEL pulser scatter röntgen på en detektor där en diffraktionsmönster registreras. LCP var ett naturligt val för ett prov leverans medium som det används ofta som ett odlingsmedium för membran protein kristaller17,21,22,23, ännu andra hög viskositet datamedier 24,25,26,27,28,29,30 och lösliga proteiner31 har också använts i injektorn. SFX med hög viskositet injektorn har varit framgångsrik under strukturbestämning av membranet proteiner13,32 inklusive G-proteinkopplade receptorer (varandra)33,34, 35,36,37, med datakvalitet tillräckligt för infödda fasa38,39 samtidigt vara både tid och prov effektivt. För närvarande är dessa spridare används mer rutinmässigt för rumstemperatur mätningar vid synkrotron källor28,30,40,41 samt under mer tekniskt krävande TR-SFX experiment vid XFELs9,10,13,42.
Jämförbara TR-SFX experiment har utförts med andra typer av injektor som vätskefasen leverans i ett flöde fokuserade munstycke6,7,12, men denna metod kräver protein belopp inte tillgängliga för många biologiskt intressanta mål. För bestämning av statiska strukturer med trögflytande extrudering en genomsnittlig konsumtion av 0.072 mg protein per 10 000 indexerade diffraktionsmönster jämfört med 9,35 mg för flytande jet har munstycken rapporterats (dvs ca 130 gånger fler prov effektiv)20. Hög viskositet injektorn har visat sig vara en livskraftig prov leverans enhet för TR-SFX medan endast offra några av detta prov effektiviteten43. I Nogly et al. (2018)10, till exempel prov konsumtion var ca 1,5 mg per 10 000 indexerade mönster, vilket positivt kan jämföras med liknande TR-SFX experiment med den PYP där genomsnittsprov konsumtion var mycket högre med 74 mg protein per 10 000 indexerade mönster6. Hög viskositet spridare alltså klara fördelar när mängden protein tillgängligt är begränsande eller när kristaller odlas direkt i LCP.
För TR-SFX med hög viskositet spridare ge mest pålitliga data flera tekniska problem behöver åtgärdas: flöde hastighet måste förbli över ett minsta kritiska värde; säljfrekvens bör behållas på en nivå som inte återger datainsamling långsam (t.ex. större än 5%); och prov har levereras utan alltför stora störningar. Helst dessa villkor uppfylls redan långt innan en schemalagd TR-SFX experiment att använda tillgänglig XFEL tid så effektivt som möjligt. Pricipally, en avmattning i LCP-dataströmmen kan sondera kristaller som aktiverades med flera optiska laserpulsen och resultatet i blandade aktiva staterna eller sondera pumpade materialet när umpumped material förväntas i balken. En ytterligare fördel med injektion pre-provande är att driftstopp under datainsamling på en XFEL minimeras som tid förpassas till ersätta tilltäppta munstycken, byta ut icke-strängpressning prover, och andra underhållsuppgifter reduceras.
Här presenterar vi en metod för att optimera prov leverans för TR-SFX datainsamling med en hög viskositet mikro-extrudering injektor. För enkelhetens skull lita de beskrivna metoderna inte på tillgång till en röntgen källa, även om arbetet på en synkrotron beamline29 skulle tillhandahålla ytterligare information om förväntade slå priser och crystal diffraktion. Våra protokoll utvecklades för att optimera experiment för att fånga retinal isomerization i proton-pump bacteriorhodopsin10 och genomförs i två faser börjar med förbereda crystal prover för extrudering följt av övervakning extrudering med en höghastighetskamera setup. I fas ett blandas crystal-lastad LCP med ytterligare LCP, låg övergång temperatur lipider, eller andra tillsatser för att säkerställa den slutliga blandningen är lämplig för leverans i prov miljön utan igensättning eller sakta. En ny tre-vägs spruta coupler utvecklades för att förbättra blandning prestanda och provets homogenitet. Den andra fasen består av en extrudering test registreras av en höghastighetskamera att direkt mäta extrudering hastighet stabilitet. Efter analysen av videodata, justeringar kan göras till protokollet prov förberedelse att förbättra experimentella resultat. Dessa förfaranden kan anpassas för att förbereda andra proteiner för TR-SFX datainsamling, med minimala ändringar, och kommer att bidra till en effektiv användning av begränsade XFEL beamtime. Med nya XFEL faciliteter precis börjat sin drift44,45 och överföring av injektor-baserade seriella datainsamlingsmetoder till synkrotroner28,30,40,41 , de närmaste åren kommer säkert fortsätta att ge spännande nya insikter i den strukturella dynamiken i ett allt större utbud av protein mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein Crystal provberedning
- Ca 30 min innan provet är att injiceras, baserat belastning 50 µL av kristall-lastad monoolein LCP i 100 µL spruta.
- För injektion vid atmosfäriskt tryck: belastning 10 µL av flytande paraffin på baksidan av en andra spruta. Håll sprutan vertikalt, utvisa luftbubblor från sprutan.
- För injektion i vakuum miljö: last 5 µL av MAG 7,9 och 5 µL av flytande paraffin på baksidan av en andra spruta. Håll sprutan vertikalt, utvisa luftbubblor från sprutan.
- Anslut sprutan med paraffin/MAG 7,9 till en standard spruta redskapsfäste, rensa luften från fästet genom att försiktigt trycka på kolven tills en liten volym (< 1 µL) av paraffin/lipid syns på spetsen av nålen redskapsfäste.
- Anslut sprutan provet till den spruta redskapsfäste, noga med att inte införa någon luft i provet. Blanda i lipid/paraffinet av passerar provmaterialet genom fästet flera gånger.
- Placera 20 µL av färdigblandad LCP (27% PEG, 100 mM Sorensen pH 5,6 + MO) i en annan 100 µL spruta. Avlägsna luftbubblor som behövs.
- Ta bort den tomma sprutan från fästet och fäst färdigblandad LCP kristallen innehållande spruta med en vanlig spruta redskapsfäste. Sålla provet genom fästet 100 gånger.
Obs: Urvalet blandning kan värma provet något46. Blandning bör göras i långsam takt där temperaturen av provet kan hållas någorlunda konstant. - Inspektera provet för öppenhet mot en källa av ljus. Om en tydlig homogen LCP har bildats, gå till steg 1,9.
- För att få provet i fasen kubik, tillsätt 3 µL av monoolein och blanda 50 gånger (enligt ovan). Upprepa den här proceduren bara tills en öppen fas har bildats för att undvika ett överskott av monoolein.
Obs: Bildandet av LCP är temperatur beroende47 och bästa resultat uppnås något över 20 ° C. Mängden ytterligare monoolein behövs beror på volymen resterande fällningsmedel lösning som förts över från kristallisering. - Inledningsvis testa för provet stelhet (som väntat från LCP fas) och pressa-förmåga, lossa den tomma sprutan från sprutan fästet och, håll sprutan vertikalt, pressa en liten mängd prov (< 2 µL) genom fästet. Om extruderad provet bildar en upprätt cylinder, då är provet redo för extrudering testning.
- Justera den totala volymen av 100 µL provet genom att lägga till mer färdigblandad LCP (som i steg 1,5).
- Koppla prov sprutan och två tomma sprutor till trevägs spruta fästet (rensa luften från fästet som innan). Blanda minst 50 gånger (eller tills homogen) passerar hälften av provet i andra sprutan och trycker därefter på båda halvorna av provet i tredje sprutan samtidigt.
- Placera sprutan som innehåller blandade provet i stereo Mikroskop för att kontrollera en homogen fördelning av kristaller.
2. testa prov extrudering med en höghastighetskamera Setup
- Att fastställa experimentella parametrar.
- Välj munstycke storlek för testet.
Obs: Munstycke storlekar är vanligtvis 50 eller 75 µm innerdiameter (ID), men någon storlek från ungefär 30-100 µm ID kan övervägas. Urvalet baseras på en balans mellan genomsnittlig igensättning tid, bakgrunden scattering, prov konsumtion och säljfrekvens. - Beräkna optimala flödet hastighet baserat på experimentella laser spot storlek (1/e2 diameter) och data insamling systemet (t.ex. interfolierade ljus och mörk) som ska användas på XFEL.
- Beräkna önskad flödet klassar (
) av provet från den optimala flöde hastigheten (
) och valda munstycke diameter (
):
Bestämma flödet (
) som ska anges vid HPLC pumpen utifrån förstärkningsfaktor (
) av injektorn.
Beräkna det högsta trycket (
) från nominella trycket av munstycket beslag (
) och förstärkningsfaktor av injektorn (
):
- Välj munstycke storlek för testet.
- Inställning av hög viskositet extrudering injektorn för offlineanvändning som visas i figur 1.
Obs: Injektor funktioner med hjälp av hydrauliska extrudering drivs av en HPLC-pump, och använder en samtidig flytande helium gas slida kontrolleras av en gasregulator. Inställningen för pump och regulator behandlas inte i detta protokoll. Se kapitel fyra i James (2015)48 för en detaljerad manual.- Rensa pumpen och alla vattenledningar att säkerställa flöden är korrekta. Rensa den hydrauliska etappen av injektorn.
- Montera injektorn (eller kameran) på en treaxlig scen att underlätta inramning och fokus för höghastighetståg videor. Lämna utrymme runt insprutningspunkten för objektivet, belysning, reflekterande skärm och en liten bägare att fånga förbrukade provet.
- Konstruera ett ”dummy munstycke” (en tom behållare med ett munstycke fäst) och installera det på injektorn att underlätta positionering, fokus och belysning.
- Montera höghastighetståg kameran med munstycksspetsen nära brännpunkten i målet.
- Placera reflekterande skärmen bakom injektorn och justera belysningen för att front-ljus munstycket.
- Slå på och ansluta till kameran med den medföljande programvaran. Med en live-video kör för visuell feedback, placera munstycksspetsen i mitten av ramen, och föra in i fokus med treaxlig scenen.
- Justera belysningen förrän munstycket är tydligt synlig och bakgrunden är jämnt belyst.
- Konfigurera kameran att spela in höghastighetståg time-lapse video.
- Ställ in framerate till 1000 fps. Ställ in upplösning till 512 x 512 pixlar.
- Med exponeringstid nu fastställts av bildrutehastigheten, justera belysningsnivå tills munstycket är synlig (dvs inte under- eller överexponerade). Flytta munstycksspetsen så att den centreras vänster till höger och ligger i den övre tredjedelen av ramen.
- Köra alla bakgrundskorrektion eller vitbalans verksamhet.
- Ställ in kameran i time-lapse läget. Ange intervall till 30 s och upprepar till 40 gånger, ställer in utlösaren läge till slumpmässiga (eller slumpmässiga reset) och ange antalet bildrutor att spela in till 1000.
- Fyll behållaren med 20 µL av provet och bifoga kapillär munstycket.
- Bifoga ifylld reservoaren till injektorn. Anslut gasledningen till porten på munstycket och börja gasflödet.
- Manuellt förväg kolven genom att öppna ventilen i linje och trycka på sprutan. Stäng ventilen när kolven gör solid kontakt med provet i reservoaren.
- Programmera pumpen med det beräknade flödet och ange det maximala trycket till det beräknade värdet (se punkt 2.1.3).
- Samtidigt starta pumpen och kamerainspelning.
- Extrudering börjar, justera gastrycket att öka stabiliteten. Om vätskan bildar en droppe på spetsen av munstycket i stället för en kolumn kan du öka gastryck. Minska trycket om extrudering är bruten på grund av överdriven skjuvning från gasflödet, eller är oscillerande snabbt Vispa ().
- Övervaka extrudering (10 min är oftast tillräckligt för att känna igen en homogen flöde skick) och när pumptrycket ramper kraftigt upp nära beräknade sluttiden, stoppa inspelningen, stänga av pumpen, och ventilera systemtrycket genom att öppna säkerhetsventilen.
- Analys av videofiler
Obs: Urvalet extrudering som är uppenbart otillräcklig kräver inte en detaljerad analys. Det är dock ändå bra att identifiera felmoder så att provet kan optimeras.- Öppna videofilen med analys programvara (t.ex. Fiji49) och kalibrera mätverktyg.
- Kalibrera mätningar genom att välja en rad kända längd i videobilden med linje markeringsverktyget. Öppna fönstret Ange skala via analysera | Ange skala och ange de kända avståndet och måttenheter.
Obs: Den kända diametern av munstycket ger en adekvat kalibrering längd för dessa mätningar. - Hitta en ram i videon där det finns en spårbar funktion synlig (t.ex. en kristall) i extrudering. Anteckna ramnummer.
- Förväg videon till en ram där den samma huvudnummer är synliga men har flyttat från sin position i föregående steg. Anteckna ramnummer.
- Använda verktyget rak linje mätning, Mät avståndet från funktionen start- och slutpunkt via analysera | Mått.
Obs: Ju längre spårbar avståndet, färre fel i mätningen kommer att påverka beräkningarna - Beräkna den jet hastigheten från det uppmätta avståndet och förfluten tid (antalet avverkade ramar dividerat med framerate.)
- Upprepa steg 2.11.3-2.11.6 några gånger för varje segment av videon.
- Rita dataserier som i figur 2.
) av provet från den optimala flöde hastigheten (
) och valda munstycke diameter (
):
) som ska anges vid HPLC pumpen utifrån förstärkningsfaktor (
) av injektorn.
) från nominella trycket av munstycket beslag (
) och förstärkningsfaktor av injektorn (
):
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Perfekt utgångsmaterial för de förfaranden som beskrivs här (figur 3) är höga tätheter av mikrokristaller införlivas trögflytande datamedium för injektorn. Förfarandet kräver cirka 50 µL av crystal lastade bärare för tillredningen. Dessa kan odlas direkt i LCP som med bR9,10 används här som ett exempel (figur 4), eller tillagas med kristaller odlas i konventionella vapor diffusion uppställningar. En utmärkt video guide till kristallisation direkt i gastät sprutor kan hittas i Ishchenko et al. (2016)37. Med bR är kristallint plattorna idealisk diameter omkring 20 μm som en bra kompromiss mellan diffraktion makt och homogen aktivering av pump lasern. Proteinkristaller, beredd med protokoll som förklaras ovan, användes för att samla in TR-SFX data på proton pump BREN som avslöjade de ultrasnabba förändringar som sker efter photon absorbtion (figur 5).
Efter provberedning med trevägs fästet (figur 6AB), visuell inspektion av provmaterialet i sprutan visar homogenitet (figur 6 cD), och Mikroskop exempelbilder av blandade provet, både i den spruta och på en bild, kan bekräfta tätheten av kristallerna och möjliggör mätningar av crystal storlekar, crystal storleksfördelning och crystal densitet. Provet är i fasen kubik när leverans mediet är tydlig (figur 7) och trögflytande. Grumligt blandningar är en indikation på att provet är i en svamp lamellär fas, men är inte avgörande eftersom hög crystal densitet kan dölja LCP tydligheten. Ett kort lågtryck test för att identifiera den flytande svamp fasen kan utföras genom att dra i kolvstången från provet på baksidan av sprutan. Lamellär fas kan lätt identifieras genom dess Dubbelbrytning med polariserat ljusmikroskop. Dessa tester tillsammans med en före extrudering test är vanligen tillräckligt för att motivera ett test i injektorn.
Andelen hög upprepning av XFELs kräver en hastighet som inte kan observeras tillräckligt med låg frame rate kameror. Därför, extrudering karakterisering görs med hjälp av en höghastighetskamera (kopplad till en hög förstoring lins) som kan spela in time-lapse video. Videodata är höghastighetståg däri ramar bokförs vid 1000 fps, och också time-lapse eftersom videon spelas in för 1 s varje 30 s. Detta data collection system möjliggör datainsamling under hela provet provet (ca 10 min) utan att skapa ohanterlig videofiler. Även med denna reducerad datauppsättning kan fortfarande storlek, video filer som överstiger 50 GB. Försiktighet bör iakttas att säkerställa adekvat lagring finns att spara video data innan provningen börjar.
Under jet testet (figur 1), bör provet extrudera en lång (mer än 200 µm) kontinuerlig kolumn av LCP som rör sig på en nästan konstant hastighet (figur 2). Prover som körs i en droppande läge indikerar att provet viskositeten är för låg (figur 2). Prover kan ofta återhämtat sig och blandas med mer monoolein eller paraffin att anpassa viskositet. Prover som bildar en kolumn bör testas med höghastighets kamera. Data från inspelningen ska visa att extrudering stannar över en minsta hastighet som dikteras av din experimentella parametrar. Extrudering hastighet bestäms genom att mäta det linjära avståndet som en funktion i LCP strömmen färdas över ett antal bildrutor. Extrudering nedgångsperioder som kan hänföras till avvikande träskor garanterar omanalys. Om de kvarstår bör jetting förbättras genom tillsatser som paraffin, genom att minska tätheten av kristaller eller genom att välja ett större diameter munstycke. Kristaller som inte normalt odlas i ett trögflytande medium (t.ex. vapor diffusion) kan vara peletted genom centrifugering och införlivas med LCP- eller andra trögflytande flygbolag. För exempel, se tidigare publikationer24,25,26,27,29,30.
Figur 1: höghastighetskamera bänk setup. Ett fotografi av en typisk bänkmonterade setup med väsentliga delar märkta. Treaxlig scenen ger flexibilitet i utformningen och fokusera bilden. Injektorn (visas med munstycke och reservoar bifogas) är monterade vertikalt, och direkt framför objektivet. Belysningen i detta exempel tillhandahålls av en enda fiber ljus lysande provet av axis och som ger ett ljust fält på skärmen. Ett prov monterad och belyst på detta sätt ger en bild som den i infälld B. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: höghastighetskamera testning och dataanalys. Bilden ovan är två LCP extrudering tester. Test A visar bR kristaller i LCP strängpressning i en droppande läge som anger att provet inte är optimerad. Prov B visar LCP extrudering bildar en kontinuerlig kolumn av LCP där kristaller kan spåras, och extrudering hastighet kan beräknas. I det här exemplet flyttas en kristall inbäddade i kolumnen LCP (50 µm diameter) 301 µm i 8 ms (37,6 mm/s). Två uppsättningar med data från olika preparat av bacteriorhodopsin kristaller i LCP visas. Fyra (eller fler) datapunkter från varje sekund av time-lapse höghastighetskamera video (1 s inspelning varje 30 s) var ritade. Stor spridning mellan datapunkter som tas från en enda andra uppgiftsinsamlingsperioden ange kortsiktiga hastighetsförändring. Medan ett glidande medelvärde över hela dataserien visar längre variationerna i flödet. Den översta serien är från ett dåligt extruding prov (hög chans för ljus förorening med två på varandra följande pump laserpulser) och botten serien är från ett prov som utförts optimalt. Den vågräta streckade linjen visar uppsatt extrudering hastighet via HPLC pumpen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: exempel förberedelse flödesschema. Provberedning börjar med en hög täthet av proteinkristaller inbäddade i LCP. Provet är sedan blandas med låg övergång temperatur lipid, paraffin, och förberett LCP tills provet kommer in i kubik fas, och passerar en rad små tester att indikera att provet kommer att pressa i injektorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bacteriorhodopsin kristaller som utgångsmaterial. Kristaller odlas i gastäta sprutor (A) med LCP nedsänkt i fällningsmedel lösningen. Kristallisering är optimerad för hög täthet av kristaller med en möjligen smala storlek distribution (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: strukturell förändring i bacteriorhodopsin. TR-SFX avslöjar ultrasnabb förändringar i strukturen av en proton-pump bacteriorhodopsin. Här är bilden en modell av bR härrör från TR-SFX uppgifter som erhållits från kristaller som tillagas med de protokoll som beskrivs i detta arbete. Den vänstra panelen visar modellen med markerade dragen i näthinnans bindande fickan. Den högra panelen visar förändringarna i retinal från femtosekunder till millisekunder. Denna siffra var Reproducerad från Nogly et al. (2018)10 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: trevägs fästet. Tre-vägs fästet är en minskad döda-volym Y mixer ger kompatibilitet med gastäta sprutor. 3D-renderingar av fästet, visar en sprängskiss av den församling (A), och en transparent vy visar att blanda kanal (B). Figuren visar en inhomogena crystal fördelning efter blandning med standard kopplingen (C) och den resulterande suspensionen efter blandning i trevägs fästet (D). Blandning sker genom att trycka in ungefär hälften av provet i en annan spruta (E) och sedan skjuta båda halvorna i återstående sprutan tillsammans vilket illustreras av de blå pilarna (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: före injektion testning indikatorer. Under provberedning är flera små tester används för att indikera att provet är i fas, och tillräckligt trögflytande. Optisk klarhet är en indikator att provet sannolikt i kubik fas. (A) en grumlig prov visas i sprutan. (B) en tydlig prov visas, notera de avläggande av examen linjerna synliga genom provet trots den höga tätheten av mikro-kristaller. När matrisen lipid är i fasen kubik, förblir det solid-liknande när under ingen stress. Ett lågtryck test utförs genom att dra sprutan från baksidan av provet. När provet är alltför vätska-liknande (vägledande av svamp fas) provet expanderar för att fylla volymen (C). I ett positivt resultat av samma test (D) är provet oförändrad trots dras tillbaka kolven. Slutligen utförs en makronivå extrudering test genom att trycka på en liten mängd av provet genom sprutan fästet. En droppe bildar på munstycksspetsen (E) eller ett snabbt böjande cylinder av LCP anger ett prov som inte är tillräckligt trögflytande. Om provet strängpressar, bildar en cylinder, som förblir upprätt över tid (F), då provet kan avancera till höghastighetskamera testning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TR-SFX metoden med trögflytande extrudering injektorn har visat sig vara en livskraftig teknik för strukturdynamik studier av bacteriorhodopsin9,10 och fotosystem II13 och nu verkar redo att studera proteiner som kör andra Foto biologiska processer såsom ljus-driven ion transport eller sensorisk perception5,50. De protokoll som beskrivs ovan var utformade för att maximera framgångarna med TR-SFX datainsamling på bacteriorhodopsin, ändå vi tror kan fungera som en mall för att optimera insamling av uppgifter om andra prover. På detta sätt, mycket av den dyrbara beamtime för närvarande förlorat på grund av igensättning eller dålig prov extrudering skulle istället kunna användas bättre datainsamling på mer tidsfördröjningar.
Det svåraste, och kritiska steget i protokollet är tillsats av små mängder av monoolein som ger matrisen lipid i fasen kubik (steg 1,8). Svårigheten ligger i subtila fas övergången och den negativa effekten på prov när monoolein läggs i överskott.
Ändringar av metoden bör genomföras för att rymma olika proteinkristaller. Dessa kanske inte är kompatibla med de samma tillsatserna belopp eller krävs blandning. Däremot, bryta kristaller i mindre bitar under blandning processen kan inte äventyra diffraktion kvalitet och kan även förbättra bestyckningen till exempel när långa nålar bryta i kortare fragment. Olika tillsatser kan ersättas i stället för paraffin, som är till för att förbättra flödet hastighet stabilitet9. MAG 7,9/9,7 läggs till hindra trasnistion till lamellär fas som kan uppstå när injicera i vakuum miljöer20 (som den CXI endstation på LCLS), men kan utelämnas om experimentet görs vid atmosfäriskt tryck. Vår erfarenhet, kan många kristaller från lösliga proteiner stabilt införlivas i LCP, ännu något ironiskt membranprotein kristaller inte direkt odlas i lipidic mesophases ofta lös förmodligen eftersom rengöringsmedel extraheras från kristallen i lipid-liknande miljön kring dem. I sådana fall bör det vara försökte helt ersätta LCP med alternativa trögflytande carrier24,25,26,27,29,30.
Ändringar på höghastighetskamera prov kan rymma prover där kristallerna inte är synliga inom flygbolaget. Belysning kan exempelvis konfigureras för att spela in video med hjälp av polariserat ljusmikroskop. Detta kommer att orsaka birefringent kristaller visas (som en glöd), och avslöjar också delar av matrisen lipid som är i birefringent lamellär fas.
Ändringar åt sidan, är det viktigt att protein crystal preparatet så mycket som möjligt uppfylla följande kriterier. Kristallerna bör vara optimalt dimensionerad för att maximera diffraktion samtidigt minimera injektor igensättning. Crystal densiteten bör vara tillräckligt hög för att ge en tillräcklig för att samla in data set säljfrekvens men inte så tät att kompromissa jet stabilitet (en täthet som är för hög kan vanligtvis spädas; i fråga om bR, anpassning till en träffsäkerhet på 10-30% vanligtvis worke d väl). Lipid matrisen bör föras in i fasen kubik, och crystal suspensionen bör vara homogena.
TR-SFX innehar stora fördelar över andra tid-löst kristallografi tekniker som Laue diffraktion eftersom: strålskador är begränsad på grund av ”diffraktion innan förstörelsen” metoden, TR-SFX har en bred tidsupplösning över många beställningar av magnitud och ner till intervallet femtosekund, små kristaller möjliggör bättre ljusaktivering och photocycles av intresse behöver inte vara reversibel.
TR-SFX på en XFEL med hög viskositet injektorn har betydande fördelar jämfört med en flytande jet injektor när det gäller prov besparingar. Direkt jämföra PYP6 och bR10, till exempel indikerar en minskning av faktorn 50 för samma mängd insamlade diffraktion bilder. Flytande jets har å andra sidan en fördel eftersom flödet är snabb, datainsamling körs med full fart (omväxlande mörka och ljusa ramar), utan hänsyn till injektor stream hastighet stabilitet (eller ljus förorening i mörka ramar). Medan den trögflytande jet tillför nya utmaningar, är det värt att överväga att flytande jet TR-SFX använder mängder protein som kan vara helt orimligt att producera för många biologiskt relevanta system.
Trögflytande provberedning för TR-SFX begränsas för närvarande av crystal kompatibilitet med leverans medium. Även om det har förekommit flera alternativa trögflytande transportörer genomfört, har ingen befunnits fungera för alla fall. Dessutom underställt prov leverans med en hög viskositet injektor alltid igensättning eller sakta även med optomozation som använder detta protokoll. En annan begränsning av tekniken är inneboende minskningen i träffsäkerhet när späda provet för att föra den till den optomised extrudability.
I framtiden, kan TR-SFX metoder förlängas från protein mål med naturliga chromophores till de med syntetiska photoswitches. Tid-löst mätningar på reaktioner som inte kan photoactivated måste förlita sig på blandning, temperatur-hoppa, elektriska-fält eller annan aktiveringsteknik som inte ännu anpassas till seriell kristallografi. En kombination av dessa utlösande tekniker tillsammans med ökad tillgänglighet av XFEL beamtime kommer med tiden, lägga grunden för att förstå den strukturella dynamiken i proteinfunktion på atomnivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Vi erkänner Gebhard Schertler, Rafael Abela och Chris Milne för att stödja användningen av hög viskositet spridare på PSI. Richard Neutze och hans team är erkända för diskussioner om tid-löst kristallografi och prov leverans med hög viskositet spridare. För finansiellt stöd, vi erkänner schweiziska National Science Foundation för bidrag 31003A_141235, 31003A_159558 (att J.S.) och PZ00P3_174169 (att P.N.). Detta projekt har beviljats medel från EU: s Horizon 2020 forsknings- och innovationsprogrammet under Marie-Sklodowska-Curie stipendiet avtal nr 701646.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
References
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
- Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
- Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
- Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
- Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
- Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
- Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
- Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
- Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309 (2014).
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703 (2017).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484 (2016).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
- Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
- Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621 (2014).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292 (2016).
- Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
- Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
- Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585 (2017).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
- Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602 (2017).
- Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
- James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).
