Summary
O sucesso de um experimento de cristalografia de tempo-resolvido serial femtosecond é dependente da entrega de amostra eficiente. Aqui, descrevemos os protocolos para otimizar a extrusão de Bacteriorrodopsina microcristais de um injector de microextrusão de alta viscosidade. A metodologia baseia-se na homogeneização da amostra com um romance acoplador de três vias e visualização com uma câmera de alta velocidade.
Abstract
Injetores de microextrusão de alta viscosidade têm reduziu drasticamente o consumo de amostra em femtosecond serial cristalográficas experimentos (SFX) em lasers de raio-x elétron livre (XFELs). Uma série de experimentos usando a Bacteriorrodopsina de bomba de próton orientado a luz estabeleceram ainda mais estes injectores como uma opção preferencial para entregar cristais para tempo-resolvido serial femtosecond cristalografia (TR-SFX) resolver as alterações estruturais da proteínas após fotoativação. Para obter vários snapshots estruturais de alta qualidade, é essencial para coletar grandes quantidades de dados e garantir o apuramento dos cristais entre cada pulso de laser da bomba. Aqui, descrevemos em detalhe como nós aperfeiçoamos a extrusão de microcristais Bacteriorrodopsina para nossos experimentos recentes TR-SFX na fonte de luz coerente o Linac (LCLS). O objetivo do método é otimizar a extrusão para um fluxo estável e contínuo, mantendo uma elevada densidade de cristais para aumentar a taxa na qual os dados podem ser coletados em um TR-SFX experimentar. Podemos atingir este objetivo, preparando a fase cúbica lipídico com uma distribuição homogénea de cristais usando uma seringa de três vias novel dispositivo seguido ajustando a composição da amostra com base em medições da estabilidade da extrusão, tiradas com uma alta velocidade de acoplamento configuração da câmera. A metodologia pode ser adaptada para otimizar o fluxo de outros microcristais. A instalação estará disponível para usuários do novo recurso suíço Free Electron Laser.
Introduction
Femtosecond serial cristalografia (SFX) é uma técnica de biologia estrutural que explora as propriedades únicas de lasers de raio-x elétron livre (XFEL) para determinar a temperatura ambiente de estruturas de milhares de cristais de tamanho micrométrico enquanto correr mais que a maioria dos os danos de radiação pela "difração antes da destruição" princípio1,2,3.
Em uma extensão de tempo-resolvido de SFX (TR-SFX), os femtosecond pulsos da XFEL são usados para estudar as alterações estruturais em proteínas4,5. A proteína de interesse é ativada com um laser óptico (ou outra atividade trigger) antes de ser baleado pelo XFEL em uma instalação de bomba-sonda. Controlando precisamente o atraso entre os pulsos de bomba e sonda, a proteína do alvo pode ser capturada em diferentes Estados. Filmes moleculares de alterações estruturais ao longo de onze ordens de grandeza no tempo demonstram o poder das novas fontes XFEL para estudar a dinâmica de várias proteínas alvos6,7,8,9, 10,11,12,13. Principalmente, o método junta-se as técnicas de estruturais dinâmicas espectroscópicas e estáticas em um só, fornecendo um vislumbre na dinâmica da proteína em perto de resolução atômica.
Sistemas simples para TR-SFX podem conter um gatilho endógeno de ativação com uma componente de foto-sensível como retinal em Bacteriorrodopsina (bR)9,10, os cromóforos no fotossistema II12,13, fotoativa proteína amarelo (PYP)6,7 photoswitchable reversível de proteína fluorescente11, ou um photolyzable monóxido de carbono em mioglobina8. Excitantes variações da técnica ainda em desenvolvimento dependem de mistura e injetam esquemas14,15 para estudar reações enzimáticas ou um campo elétrico usado para induzir mudanças estruturais16. Dado que fontes XFEL somente estão disponíveis há alguns anos e extrapolando passado sucessos no futuro, o método mostra potencial como uma real mudança de jogo no que diz respeito a nossa compreensão de como função de proteínas.
Porque amostras biológicas são destruídas por uma única exposição a uma alta potência pulso XFEL, novas abordagens de cristalografia de proteínas eram necessárias. Entre esses procedimentos, a habilidade de crescer grandes quantidades de uniforme microcristais precisava ser desenvolvidos17,18,19. Para habilitar a coleta de dados em um XFEL, estes cristais devem ser entregue, descartados e então renovados para cada pulso XFEL. Dado que XFELs fogo utilizáveis pulsos de 10 a 120 Hz, entrega de amostra deve ser rápido, estável e confiável, mantendo também os cristais intacto e limitador de consumo. Entre as soluções mais bem sucedidas é um injector de microextrusão de alta viscosidade, que proporciona um continuamente streaming de coluna de temperatura cristal-carregado lipídico fase cúbica (LCP) através de raio-x feixe pulsado20. Cristais aleatoriamente orientados, incorporadas no fluxo de LCP, que são interceptadas por dispersão de pulsos a XFEL raios-x sobre um detetor onde um padrão de difração é gravado. LCP foi uma escolha natural para um meio de entrega de amostra, como é frequentemente usado como um meio de crescimento de membrana proteínas cristais17,21,22,23, ainda outros suportes de alta viscosidade 24,25,26,,27,28,29,30 e proteínas solúveis31 também têm sido usados no injector. SFX com o injetor de alta viscosidade tem sido bem sucedido durante a determinação de estrutura de membrana proteínas13,32 incluindo G receptores (GPCRs)33,34, 36, 35,37, com qualidade de dados suficiente para nativo progressiva38,39 estando tanto tempo e amostra eficiente. Atualmente, estes injetores estão sendo usados mais rotineiramente para medições de temperatura em síncrotron fontes28,30,40,41 , bem como durante a mais tecnicamente exigindo a experiências e TR-SFX XFELs9,10,13,42.
Experimentos de TR-SFX comparáveis foram realizados usando outros tipos de injector como fase líquida entrega em um fluxo concentrado bocal6,7,12, no entanto, esse método requer quantidades de proteína não está disponíveis para muitos biologicamente interessantes destinos. Para a determinação de estruturas estáticas usando extrusão viscoso um consumo médio de 0,072 mg de proteína por padrões de difração indexado 10.000 em comparação com 9,35 mg para o jato de líquido bocais têm sido relatados (ou seja, cerca de 130 vezes mais amostra eficiente)20. O injetor de alta viscosidade tem demonstrado ser um dispositivo de entrega de amostra viável para TR-SFX enquanto apenas sacrificando algumas das de eficiência desta amostra43. Em Nogly et al. (2018)10, por exemplo, o consumo de amostra foi cerca de 1,5 mg por 10.000 padrões indexados, que compara-se favoravelmente aos experimentos de TR-SFX semelhantes usando o PYP onde o consumo médio da amostra foi muito maior com 74 mg de proteína por 10.000 padrões indexado6. Injetores de alta viscosidade, portanto, têm vantagens evidentes quando é limitar a quantidade de proteína disponível ou quando cristais são cultivadas diretamente no LCP.
Para TR-SFX utilizando alta viscosidade injetores para produzir os dados mais confiáveis várias questões técnicas devem ser abordadas: a velocidade de fluxo deve manter-se acima de um valor crítico mínimo; a taxa de sucesso deve ser mantida a um nível que não processa lento de coleta de dados (por exemplo, superior a 5%); e a amostra tem que ser entregue sem interrupções excessivas. Idealmente, estes já condições muito antes de um experimento de TR-SFX agendado para usar tempo XFEL disponível de forma mais eficiente possível. Pricipally, uma diminuição no fluxo de LCP pode permitir sondagem cristais que foram ativados com mais de um pulso de laser óptico e resultado em Estados mistos de ativos, ou sondagem material bombeado quando umpumped material é esperado no feixe. Um benefício adicional de injeção pre-teste é que o tempo de inatividade durante a coleta de dados em um XFEL é minimizado como tempo relegado para substituir bicos entupidos, mudando amostras não-expulsando, e outras tarefas de manutenção é reduzido.
Aqui, apresentamos um método para otimizar a entrega de amostra para coleta de dados TR-SFX com um injector de microextrusão de alta viscosidade. Para simplificar, os métodos descritos não contam com acesso a uma fonte de raios-x, apesar de trabalho em uma trajetória de síncrotron29 iria fornecer informações adicionais sobre as taxas de sucesso esperadas e difração de cristal. Nossos protocolos foram desenvolvidos para otimizar as experiências para capturar isomerização da retina da bomba de protões Bacteriorrodopsina10 e são realizados em duas fases, começando com a preparação de amostras de cristal para extrusão, seguida de acompanhamento a extrusão usando uma configuração de câmera de alta velocidade. Na primeira fase, o LCP cristal-carregado é misturado com o LCP adicional, lipídios de transição de baixa temperatura ou outros aditivos para garantir que a mistura final é adequada para entrega para o ambiente de amostra sem entupimento ou abrandar. Um novo acoplador de três vias seringa foi desenvolvido para melhorar a homogeneidade mistura de desempenho e amostra. A segunda fase consiste em um teste de extrusão, gravado por uma câmera de alta velocidade para medir diretamente a estabilidade de velocidade de extrusão. Após a análise dos dados de vídeo, podem ser feitos ajustes ao protocolo de preparação de amostra para melhorar os resultados experimentais. Estes procedimentos podem ser adaptados para preparar outras proteínas para coleta de dados TR-SFX, com modificações mínimas e contribuirão para a utilização eficiente dos limitados XFEL beamtime. Com novas instalações XFEL, começando sua operação44,45 e a transferência de métodos de recolha de dados de série baseado no injector para os síncrotrons28,30,40,41 , nos próximos anos certamente continuará a fornecer excitantes novos insights sobre a dinâmica estrutural de uma nunca mais ampla gama de alvos de proteína.
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Protocol
1. preparação da amostra de cristal da proteína
- Cerca de 30 min antes que a amostra deve ser injetado, carga 50 µ l de cristal-carregado monoleína baseado LCP em uma seringa de 100 µ l.
- Para injeção à pressão atmosférica: carga de 10 µ l de parafina líquida na parte de trás de uma segunda seringa. Segurando a seringa verticalmente, expulse as bolhas de ar da seringa.
- Para injeção em ambiente de vácuo: carga 5 µ l de MAG 7.9 e 5 µ l de parafina líquida na parte de trás de uma segunda seringa. Segurando a seringa verticalmente, expulse as bolhas de ar da seringa.
- Conectar a seringa com parafina/MAG 7,9 para um acoplador de seringa padrão, o ar de exaustão do acoplador pressionando suavemente o êmbolo até um pequeno volume (< 1 µ l) de parafina/lipídio é visível na ponta da agulha do acoplador.
- Conecte a seringa de amostra para o acoplador de seringa, tomando o cuidado de não introduzir ar na amostra. Misture a lipídios/parafina, passando o material de amostra através do acoplador várias vezes.
- Carrega 20 µ l de pré-misturado LCP (27% PEG, 100 mM pH Sorensen 5.6 + MO) em outra seringa de 100 µ l. Remova as bolhas de ar conforme necessário.
- Remova a seringa vazia o acoplador e anexar o LCP pré-misturado para o cristal contendo seringa usando um acoplador de seringa padrão. Passe a amostra através do acoplador 100 vezes.
Nota: Amostra de mistura pode aquecer a amostra ligeiramente46. Mistura deve ser feita a um ritmo lento onde a temperatura da amostra pode ser realizada razoavelmente constante. - Inspecione a amostra para transparência contra uma fonte de luz. Se formou-se uma clara homogénea LCP, vá para a etapa 1.9.
- Para trazer a amostra na fase cúbica, adicione 3 µ l de monoleína e misture 50 vezes (como descrito acima). Repita este procedimento até que formou-se uma fase transparente para evitar um excesso de monoleína.
Nota: A formação do LCP é dependente de temperatura47 e obter os melhores resultados são conseguidos ligeiramente acima de 20 ° C. A quantidade de monoleína adicional necessários dependerá o volume da solução residual de precipitant transitada de cristalização. - Como preliminar teste para rigidez de amostra (como esperado desde a fase LCP) e capacidade de extrusão, retire a seringa vazia de acoplador a seringa e, segurando a seringa verticalmente, espremer uma pequena quantidade de amostra (< 2 µ l) através do acoplador. Se a amostra extrudada forma um cilindro vertical, a amostra está pronta para o teste de extrusão.
- Ajuste o volume total da amostra de 100 µ l, adicionando mais pré-misturado LCP (como na etapa 1.5).
- Fixe a seringa de amostra e duas seringas vazias do engate de três vias seringa (purgar o ar do acoplador como antes). Mistura de pelo menos 50 vezes (ou até homogêneo) passando metade da amostra para a segunda seringa e pressionando as duas metades da amostra para a seringa de terceira simultaneamente.
- Coloque a seringa contendo a amostra mista sob um microscópio estéreo para verificar uma distribuição homogénea de cristais.
2. teste de extrusão de amostra usando uma configuração de câmera de alta velocidade
- Determinação de parâmetros experimentais.
- Selecione o tamanho do bocal para o teste.
Nota: Tamanhos diferentes de bico são tipicamente 50 ou 75 µm de diâmetro interno (ID), mas qualquer tamanho de aproximadamente 30-100 µm ID pode ser considerado. Seleção é baseada em um equilíbrio entre o tempo médio de entupimento, espalhamento de fundo, consumo de amostra e taxa de sucesso. - Calcule velocidade de fluxo ideal com base no tamanho do ponto laser experimental (diâmetro de2 1/e) e o esquema de coleção de dados (por exemplo, intercalada de luz e escuro) que será usado para o XFEL.
- Calcular a taxa de fluxo desejada (
) da amostra a velocidade de fluxo ideal (
) e o diâmetro do bocal selecionado (
):
Determinar a taxa de fluxo (
) que devem ser inseridos na bomba HPLC baseada o fator de amplificação (
) do injector.
Calcular a pressão máxima (
) da pressão nominal dos acessórios bocal (
) e o fator de amplificação do injector (
):
- Selecione o tamanho do bocal para o teste.
- Instalação do injector de extrusão de alta viscosidade para uso offline, como mostrado na Figura 1.
Nota: As funções do injector através da extrusão hidráulica alimentado por uma bomba de HPLC e usa uma bainha de gás hélio co fluxo controlada por um regulador de gás. A instalação de bomba e regulador não são discutidas neste protocolo. Consulte o capítulo quatro de James (2015)48 para um manual detalhado.- Limpe a bomba e todas as linhas de água para garantir que os caudais são precisos. Limpe o palco hidráulico do injector.
- Monte o injector (ou câmera) em um estágio de três eixos para facilitar o enquadramento e foco para os vídeos de alta velocidade. Deixe o espaço em torno do ponto de injeção para a lente objetiva, iluminação, tela reflexiva e um copo pequeno para pegar a amostra gastava.
- Construir um bocal"manequim" (um reservatório vazio com um bocal anexado) e instalá-lo sobre o injector para facilitar o posicionamento, foco e iluminação.
- Monte a câmera de alta velocidade com a ponta do bico perto do ponto focal do objectivo.
- Posicione a tela reflexiva para trás o injector e ajustar a iluminação para frente-luz do bocal.
- Ativar e conectar a câmera com o software fornecido. Com um vídeo ao vivo correndo para feedback visual, posicione a ponta do bico no centro do quadro e trazê-lo em foco com o estágio de três eixos.
- Ajuste a iluminação até o bocal é claramente visível e o fundo é uniformemente iluminado.
- Configurar a câmera para gravar vídeo de alta velocidade de lapso de tempo.
- Conjunto de framerate para 1000 fps. Definir a resolução para 512 x 512 pixels.
- Com o tempo de exposição agora definido pela taxa de quadros, ajuste o nível de iluminação até o bocal é visível (ou seja, não sob- ou superexposta). Reposicione a ponta do bico para que ele é centrado à esquerda para a direita e situa-se no terço superior do quadro.
- Execute qualquer correcção de fundo ou operações de balanço de branco.
- Configure a câmera no modo de lapso de tempo. Intervalo definido para 30 s e repete a 40 vezes, definir o modo de gatilho para aleatório (ou reset aleatório) e digite o número de quadros para gravar a 1000.
- Carregar o reservatório com 20 µ l da amostra e anexar o bocal capilar.
- Anexe o reservatório cheio para o injector. Ligue a linha de gás à porta do bocal e iniciar o fluxo de gás.
- Avança manualmente o pistão abrindo a válvula em linha e pressionar a seringa. Feche a válvula quando o pistão faz contato contínuo com a amostra no reservatório.
- Programar a bomba com a taxa de fluxo calculado e defina a pressão máxima ao valor calculado (ver passo 2.1.3).
- Inicie simultaneamente a bomba e a gravação da câmera.
- Como começa a extrusão, ajuste a pressão do gás para aumentar a estabilidade. Aumente a pressão do gás se o fluido forma uma gota na ponta do bocal em vez de uma coluna. Diminuição de pressão se a extrusão é interrompida devido a excesso de cisalhamento do fluxo do gás, ou está a oscilar rapidamente (chicote).
- Monitorar a extrusão (10 min geralmente é suficiente para reconhecer uma condição de fluxo homogêneo) e, quando a pressão da bomba agudamente rampas até perto da hora do fim esperado, parar a gravação, fechar a bomba e a pressão do sistema de ventilação, abrindo a válvula de alívio.
- Análise dos arquivos de vídeo
Nota: Extrusão de amostra que é claramente insuficiente não requer uma análise detalhada. No entanto, é ainda útil identificar o modo de falha para que a amostra pode ser otimizada.- Abra o arquivo de vídeo com o software de análise (por exemplo, Fiji49) e calibrar os instrumentos de medição.
- Calibre as medições, selecionando uma linha de comprimento conhecido na imagem de vídeo com a ferramenta de seleção de linha. Abra a janela Definir escala através de Analyze | Definir escala e digite a distância conhecida e as unidades de medida.
Nota: O diâmetro conhecido do bocal fornece um comprimento de calibração adequada para as medições. - Encontrar um quadro no vídeo onde existe uma característica controlável visível (por exemplo, um cristal) em extrusão. Registre o número do quadro.
- Avance o vídeo para um quadro onde o mesmo recurso é visível, mas mudou-se de sua posição na etapa anterior. Registre o número do quadro.
- Usando a ferramenta de medição da linha reta, medir a distância desde o início do recurso e o ponto de extremidade através de Analyze | Medida.
Nota: Quanto mais tempo a distância controlável, as menos erros na medição afetará os cálculos - Calcular a velocidade do jato da distância medida e o tempo decorrido (o número de quadros decorridos dividido por framerate).
- Repita etapas 2.11.3-2.11.6 algumas vezes para cada segmento do vídeo.
- Sinopse da série de dados como na Figura 2.
) da amostra a velocidade de fluxo ideal (
) e o diâmetro do bocal selecionado (
):
) que devem ser inseridos na bomba HPLC baseada o fator de amplificação (
) do injector.
) da pressão nominal dos acessórios bocal (
) e o fator de amplificação do injector (
):
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Representative Results
A matéria-prima ideal para os procedimentos descritos aqui (Figura 3) são altas densidades de microcristais incorporada viscoso suporte informático para o injector. O procedimento chama-se para cerca de 50 µ l de carga transportadora de cristal para cada preparação. Estas podem ser cultivadas diretamente em LCP como com o bR9,10 usado aqui, como exemplo (Figura 4), ou preparadas usando cristais crescidos em configurações de difusão de vapor convencionais. Um excelente guia de vídeo para cristalização diretamente em seringas herméticos pode ser encontrado em Ishchenko et al (2016)37. Com bR, o diâmetro ideal das placas cristalinos é cerca de 20 μm, como um bom compromisso entre o poder de difração e homogénea ativação por laser da bomba. Cristais de proteínas, utilizando os protocolos como explicado acima, foram utilizados para coletar dados de TR-SFX sobre a bR de bomba de prótons que revelou as alterações ultra rápidas que ocorrem após a absorção de fótons (Figura 5).
Após a preparação da amostra usando o acoplador de três vias (figura 6AB), inspeção visual do material na seringa amostra mostra imagens de homogeneidade (Figura 6D) e o microscópio de amostra da amostra mista, ambos no seringa e em um slide, pode confirmar a densidade dos cristais e permite medições de tamanhos de cristal, cristal tamanho distribuição e densidade de cristal. A amostra está em fase cúbica quando o meio de entrega é claro (Figura 7) e viscoso. Turvas misturas são uma indicação de que a amostra é uma esponja de fase ou fase lamelar, mas não são conclusivas como densidade cristalina elevada pode obscurecer a clareza da LCPs. Um breve teste de baixa pressão para identificar a fase líquida esponja pode ser executado, puxando o êmbolo da seringa longe da amostra no fundo da seringa. Fase lamelar pode ser facilmente identificado através de sua birrefringência com microscopia de luz polarizada. Estes testes juntamente com um teste de pré-extrusão são geralmente suficientes para justificar um teste no injector.
A taxa de repetência alta de XFELs requer uma velocidade de fluxo que não pode ser adequadamente observada com câmeras de taxa de quadros baixa. Portanto, a caracterização de extrusão é feita usando uma câmera de alta velocidade (acoplada a uma lente de alta magnificação) que pode gravar vídeo lapso de tempo. Dados de vídeo são de alta velocidade em que os quadros são registrados em 1000 fps e também lapso de tempo em que o vídeo é gravado por 1 s cada 30 s. Este esquema de coleta de dados permitirá para coleta de dados durante o teste de toda a amostra (cerca de 10 min) sem criar arquivos de vídeo incontroláveis. Mesmo com este conjunto de dados reduzido tamanho, vídeo arquivos ainda podem ser superiores a 50 GB. Deve ter cuidado para garantir o armazenamento adequado está disponível para salvar dados de vídeo antes de começa o teste.
Durante o ensaio de jato (Figura 1), a amostra deve expulsar uma coluna contínua de longo (mais de 200 µm) de LCP que se move a uma velocidade quase constante (Figura 2). Amostras que são executados em um modo de gotejamento indicam que a viscosidade da amostra é muito baixa (Figura 2). Amostras, muitas vezes podem ser recuperadas e misturadas com mais monoleína ou parafina para adaptar a viscosidade. Amostras que formam uma coluna devem ser testadas com a câmera de alta velocidade. Dados da gravação devem mostrar que a extrusão fica acima de uma velocidade mínima ditada pelos seus parâmetros experimentais. Velocidade da extrusão é determinada medindo a distância linear que uma característica no fluxo de LCP viaja por um número de quadros. Slow-Downs extrusão que podem ser atribuídas à tamancos anômalos mandado refazer o teste. Se eles persistirem jorrando, prevendo aditivos como parafina, reduzindo a densidade dos cristais ou selecionando um bocal diâmetro maior. Cristais não são normalmente cultivadas em um meio viscoso (por exemplo, difusão de vapor) podem ser peletted por centrifugação e incorporaram a LCP ou outras operadoras viscosas. Para obter exemplos, consulte anteriores Publicações24,25,26,,27,29,30.
Figura 1: configuração de banco de câmera de alta velocidade. Uma fotografia de uma configuração típica de bancada com as partes essenciais rotulado. A fase três eixos fornece flexibilidade no enquadramento e focar a imagem. O injector (mostrado com o bocal e o reservatório anexado) é montado verticalmente e diretamente na frente da lente objetiva. A iluminação neste exemplo é fornecida por uma luz única fibra iluminando a amostra fora do eixo e fornecendo um campo claro na tela. Uma amostra montado e iluminado desta forma fornece uma imagem como a de baixo-relevo B. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: câmera de alta velocidade de teste e análise de dados. Na foto acima estão dois testes de extrusão de LCP. Teste A mostra bR cristais em LCP extrusão em um modo de gotejamento indicando que a amostra não é otimizada. Teste B mostra a extrusão de LCP, formando uma coluna contínua de LCP onde cristais podem ser rastreadas, e velocidade de extrusão pode ser calculada. Neste exemplo, um cristal incorporado na coluna LCP (50 µm de diâmetro) move 301 µm em 8 ms (37,6 mm/s). Dois conjuntos de dados de diferentes preparações de cristais Bacteriorrodopsina no LCP são mostrados. Quatro (ou mais) pontos de dados de cada segundo de vídeo da câmera de alta velocidade de lapso de tempo (1 s de gravação a cada 30 s) foram plotados. Uma grande propagação entre pontos de dados extraídos de um único período de coleta de dados segundo indicam a variação de velocidade a curto prazo. Enquanto uma média móvel ao longo da série de dados mostra as mais flutuações no fluxo. A série superior é partir de uma amostra mal expulsando (alta chance para contaminação de luz com dois pulsos de laser da bomba consecutivos), e a série de fundo é um exemplo de que executadas de forma otimizada. Linha horizontal pontilhada indica o conjunto de velocidade de extrusão de destino através da bomba HPLC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exemplo de fluxograma de preparação. Preparação da amostra começa com uma elevada densidade de cristais de proteína incorporado no LCP. A amostra é então misturada com lipídios de transição de baixa temperatura, parafina e preparou o LCP, até que a amostra entra em fase de cúbica e passa uma série de pequenos testes para indicar que a amostra será extrude no injector. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: cristais Bacteriorrodopsina como material de partida. Cristais são cultivadas em seringas estanques ao gás (A), com o LCP imergido na solução precipitant. Cristalização é otimizada para uma alta densidade de cristais com uma distribuição de tamanho possivelmente estreitas (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: as mudanças estruturais no Bacteriorrodopsina. TR-SFX revela ultra rápidas mudanças na estrutura da Bacteriorrodopsina de bomba de próton. Aqui é retratado um modelo de bR derivada de TR-SFX dados obtidos de cristais preparados usando os protocolos descritos neste trabalho. O painel esquerdo mostra o modelo com características destacadas no bolso da vinculação da retina. O painel direito mostra as alterações na retina de femtoseconds para milissegundos. Esta figura foi reproduzida de Nogly et al. (2018)10 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: O acoplador de ménage. O acoplador de três vias é um misturador de Y de mortos-volume reduzido projetado para compatibilidade com seringas herméticos. Renderings 3D do acoplador, mostra uma vista explodida do conjunto (A), e uma visão transparente mostrando a mistura do canal (B). A figura mostra uma distribuição não homogênea de cristal após a mistura com o acoplador padrão (C) e a suspensão resultante após a mistura do engate de três vias (D). Mistura é realizada empurrando aproximadamente metade da amostra em outra seringa (E), e em seguida, empurrando as duas metades para a seringa restante juntos como ilustrado pelas setas azuis (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: testes indicadores pre-injeção. Durante a preparação da amostra, vários testes pequenos são usados para indicar que a amostra está em fase e adequadamente viscoso. Claridade ótica é um indicador de que a amostra é provável na fase cúbica. (A) uma amostra turva é mostrada na seringa. (B) um exemplo claro é mostrado, observe as linhas de graduação visíveis através da amostra, apesar da alta densidade de microcristais. Quando a matriz lipídica na fase cúbica, permanece sólido, como quando sob nenhum estresse. Um teste de baixa pressão é realizado, puxando a seringa longe atrás da amostra. Quando a amostra é demasiado líquido-like (indicativo da fase de esponja) a amostra se expande para preencher o volume (C). Em um resultado positivo do teste mesmo (D), a amostra permanece estática apesar o êmbolo retirado. Finalmente, um teste de extrusão de macroescala é realizado pressionando-se uma pequena quantidade da amostra através do acoplador de seringa. Uma gotícula formando na ponta do bocal (E) ou um cilindro rapidamente dobra de LCP indica uma amostra que não é bastante viscosa. Se a amostra de extrusão, forma um cilindro, que permanece na posição vertical ao longo do tempo (F), em seguida, a amostra pode avançar para testes de câmera de alta velocidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método de TR-SFX com o injector de extrusão viscoso tem provado para ser uma técnica viável para estudos de dinâmica estrutural da Bacteriorrodopsina9,10 e o fotossistema II13 e agora parece pronto para estudar proteínas dirigindo outros processos biológicos de foto como transporte de iões orientado a luz ou percepção sensorial5,50. Os protocolos descritos acima foram projetados para maximizar o sucesso da recolha de dados TR-SFX sobre Bacteriorrodopsina, no entanto, acreditamos que pode agir como um modelo para otimizar a coleta de dados em outras amostras. Desta forma, grande parte do precioso beamtime atualmente perdido por causa de entupimento ou extrusão pobre amostra em vez disso poderia ser usado para coletar dados melhores em mais atrasos de tempo.
O passo mais difícil e crítico no protocolo é a adição de pequenas quantidades de monoleína que traz a matriz lipídica na fase cúbica (passo 1.8). A dificuldade reside na sutileza da fase de transição e o efeito negativo sobre a amostra quando monoleína é adicionada em excesso.
Modificações da metodologia devem ser implementadas para acomodar cristais de proteínas diferentes. Estes não podem ser compatíveis com os mesmos aditivos ou a quantidade ou mistura necessária. Por outro lado, quebrando cristais em pedaços menores durante o processo de mistura não pode comprometer a qualidade de difração e pode até mesmo melhorar jorrando por exemplo quando agulhas longas quebra em fragmentos menores. Diferentes aditivos poderiam ser substituídos no lugar da parafina, que é adicionada para melhorar o fluxo de estabilidade de velocidade9. MAG 7.9/9,7 é adicionado para impedir o trasnistion à fase lamelar que pode ocorrer ao injetar em ambientes20 (como o CXI estação final no LCLS) de vácuo, mas pode ser omitido se o experimento for feito à pressão atmosférica. Em nossa experiência, muitos cristais de proteínas solúveis podem ser estàvel incorporados LCP, ainda um pouco ironicamente proteína de membrana cristais não diretamente cultivadas em superfluido lipídico frequentemente dissolvem presumivelmente porque detergentes são extraídos do cristal no ambiente de lipídios, como em torno deles. Em tais casos, deve ser tentado para substituir inteiramente o LCP com um portador viscoso alternativo24,25,26,,27,29,30.
Modificações para o teste de câmera de alta velocidade podem acomodar amostras onde os cristais não são visíveis dentro da transportadora. Por exemplo, a iluminação pode ser configurada para gravar vídeo usando microscopia de luz polarizada. Isto causará cristais birrefringentes de aparecer (como um brilho) e também revela porções da matriz lipídica que estão na fase lamelar birrefringentes.
Modificações à parte, é fundamental que a preparação de cristais de proteína, tanto quanto possível satisfazer os seguintes critérios. Os cristais devem ser dimensionados otimamente para maximizar a difração, minimizando o injector entupimento. A densidade de cristal deve ser alta o suficiente para produzir uma taxa de sucesso suficiente para coletar conjuntos completos de dados, mas não tão densa quanto comprometer a estabilidade do jato (uma densidade muito alta geralmente pode ser diluída; no caso do bR, ajuste para uma taxa de 10-30% normalmente worke d bem). A matriz lipídica deve ser trazida para a fase cúbica, e a suspensão de cristal deve ser homogênea.
TR-SFX tem grandes vantagens sobre outras técnicas de tempo-resolvido cristalografia como difração de Laue porque: danos de radiação são limitado devido a metodologia de "difração antes da destruição", TR-SFX tem uma resolução de tempo amplo sobre muitas ordens de magnitude e até faixa de femtossegundo, os pequenos cristais permitem photoactivation melhor, e o photocycles de interesse não precisa ser reversível.
TR-SFX em um XFEL usando o injetor de alta viscosidade tem vantagens significativas sobre um injector de jato de líquido em termos de poupança de amostra. Comparar diretamente PYP6 e bR10, por exemplo, indica uma redução pelo fator de 50 para a mesma quantidade de imagens de difração coletados. Jatos de líquido por outro lado têm uma vantagem em que o fluxo é rápido e, coleta de dados é executado na velocidade cheia (alternando frames escuros e claro), sem levar em conta a estabilidade de velocidade de fluxo do injector (ou luz contaminação em frames escuro). Enquanto o jato viscoso adicionar novos desafios, vale considerar que o jato de líquido TR-SFX usa quantidades de proteína que pode ser absolutamente irracional produzir para muitos sistemas biologicamente relevantes.
Atualmente, preparação de amostras viscosas para TR-SFX é limitada pela compatibilidade de cristal com o meio de entrega. Embora tenha havido várias transportadoras viscosas alternativas implementadas, não foram encontrados para trabalhar para todos os casos. Além disso, entrega de amostra, com um injector de alta viscosidade estará sempre sujeita à obstrução, ou retardando mesmo com optomozation usando este protocolo. Outra limitação da técnica é a inerente redução na taxa de acerto quando diluir a amostra para trazê-lo para o extrudability de optomised.
No futuro, métodos TR-SFX podem ser estendidos de alvos de proteína com cromóforos naturais para aqueles com photoswitches sintético. Medições de tempo-resolvido em reações que não podem ser fotoativados devem contar com a mistura, salto de temperatura, campos elétricos ou outras tecnologias de ativação que ainda têm de ser adaptados a cristalografia serial. Uma combinação destas tecnologias desencadeante juntamente com o aumento da disponibilidade de beamtime XFEL irá, ao longo do tempo, estabelecer as bases para entender a dinâmica estrutural da função da proteína em nível atômico.
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Disclosures
Os autores declaram não há conflito de interesses.
Acknowledgments
Reconhecemos a Gebhard Schertler, Rafael Abela e Chris Milne para apoiar o uso de injetores de alta viscosidade para o PSI. Richard Neutze e sua equipe são reconhecidos por discussões sobre tempo-resolvido cristalografia e entrega de amostra usando injetores de alta viscosidade. Apoio financeiro, reconhecemos o Swiss National Science Foundation para subsídios 31003A_141235, 31003A_159558 (de J.S.) e PZ00P3_174169 (para referência). Este projeto recebeu financiamento do União Europeia, Horizonte 2020 programa de pesquisa e inovação sob a concessão de Marie Sklodowska-Curie acordo n 701646.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
References
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