Summary
Le succès d’une expérience de cristallographie femtoseconde série temporelle est tributaire de la livraison d’échantillon efficace. Nous décrivons ici les protocoles afin d’optimiser l’extrusion de microcristaux de bactériorhodopsine par un injecteur de micro-extrusion de haute viscosité. La méthodologie s’appuie sur l’homogénéisation des échantillons avec un coupleur de trois voies nouvel et de visualisation avec une caméra à haute vitesse.
Abstract
Haute viscosité micro-extrusion injecteurs ont considérablement réduit la consommation d’échantillon de série femtoseconde cristallographique expériences (SFX) à rayons x lasers à électrons libres (XFELs). Une série d’expériences à l’aide de la bactériorhodopsine de pompe de proton axée sur la lumière ont créé davantage ces injecteurs comme une option privilégiée pour fournir des cristaux pour femtoseconde série temporelle de cristallographie (TR-SFX) résoudre les changements structurels de protéines après photoactivation. Pour obtenir plusieurs instantanés structurels de haute qualité, il est essentiel de recueillir de grandes quantités de données et d’assurer le dégagement de cristaux entre chaque impulsion de laser de pompe. Ici, nous décrivons en détail comment nous avons optimisé l’extrusion de microcristaux de bactériorhodopsine pour nos récentes expériences de TR-SFX à la Source de lumière cohérente Linac (L.I.C.). L’objectif de la méthode consiste à optimiser l’extrusion pour un débit stable et continue tout en conservant une forte densité de cristaux pour augmenter le taux à laquelle les données peuvent être collectées dans un TR-SFX expérimenter. Nous atteindre cet objectif en préparation lipidique phase cubique avec une répartition homogène des cristaux avec une seringue trois voies roman périphérique suivie d’ajuster la composition de l’échantillon basée sur la mesure de la stabilité de l’extrusion prise avec une haute vitesse de couplage configuration de la caméra. La méthode peut être adaptée pour optimiser le flux des autres microcristaux. Le programme d’installation sera disponible pour les utilisateurs de la nouvelle installation Suisse Laser à électrons libres.
Introduction
Femtoseconde série cristallographie (SFX) est une technique de biologie structurale qui exploite les propriétés uniques des rayons x lasers à électrons libres (XFEL) afin de déterminer les structures de la température ambiante des milliers de cristaux de taille micrométrique tout en semant la plupart des les dommages de rayonnement par la « diffraction avant destruction » principe1,2,3.
Dans une extension temporelle de SFX (TR-SFX), les impulsions femtoseconde de XFEL sont utilisées pour étudier les changements structurels en protéines4,5. La protéine d’intérêt est activée avec un laser optique (ou une autre activité trigger) juste avant d’être abattu par XFEL dans une installation de pompe-sonde. Par précisément contrôler le délai entre les impulsions de la pompe et la sonde, la protéine cible peut être capturée dans des États différents. Films moléculaires des changements structuraux onze ordres de grandeur dans le temps de démontrer la puissance des nouvelles sources XFEL pour étudier la dynamique de plusieurs protéines cibles6,7,8,9, 10,11,12,13. Principalement, la méthode rejoint les techniques structurelles dynamiques spectroscopiques et statiques en un seul, fournissant un aperçu dans la dynamique des protéines à près de résolution atomique.
Des systèmes simples pour TR-SFX peuvent contenir un déclencheur endogène d’activation avec un composant photosensibles comme rétinienne à la bactériorhodopsine (bR)9,10, les chromophores photosystème II12,13, protéine jaune photoactif (PP)6,7 réversible ayant protéine fluorescente11, ou un photolyzable le monoxyde de carbone dans la myoglobine8. Excitant les variations de la technique encore en développement dépendent du mix et injectent des schémas14,15 , afin d’étudier les réactions enzymatiques ou un champ électrique utilisé pour induire des changements structurels16. Étant donné que les sources XFEL seulement existent depuis quelques années et en extrapolant au-delà de succès dans l’avenir, la méthode montre potentielle comme un vrai jeu-changeur en ce qui concerne notre compréhension de la façon dont la fonction de protéines.
Parce que les échantillons biologiques sont détruites par une seule exposition à une forte puissance impulsion XFEL, nouvelles approches pour la cristallographie des protéines ont été nécessaires. Parmi ces procédures, la capacité de croître de grandes quantités de microcristaux uniforme devait être développés17,18,19. Pour activer la collecte de données à un XFEL, ces cristaux doit être livrés, mis au rebut et ensuite renouvelé à chaque impulsion XFEL. Étant donné que XFELs feu utilisables impulsions à 10 à 120 Hz, livraison d’échantillon doit être rapide, stable et fiable, tout en également maintenant les cristaux intacte et limitante la consommation. Parmi les solutions les plus réussies est un injecteur de micro-extrusion de haute viscosité, qui délivre un très streaming radiographie faisceau pulsé20colonne de température ambiante chargés de cristal lipidique phase cubique (LCP). Les cristaux orientés au hasard, intégré dans le flux de la LCP, qui sont interceptés par l’éparpillement d’impulsions XFEL radiographies sur un détecteur où un patron de diffraction est enregistré. LCP est un choix naturel pour une moyenne de livraison échantillon tel qu’il est fréquemment utilisé comme un milieu de croissance pour membrane protein cristaux17,21,22,23, encore d’autres support de haute viscosité 24,25,26,27,28,29,30 et31 de la protéines solubles ont également été utilisés dans l’injecteur. SFX avec l’injecteur haute viscosité a réussi au cours de la détermination de la structure de la membrane protéines13,32 dont G (RCPG) des récepteurs couplés aux protéines33,34, 36, 35,37, avec la qualité des données suffisante pour native "phasage"38,39 tout en étant à temps et l’échantillon efficace. Actuellement, ces injecteurs sont plus couramment utilisés pour les mesures de la température ambiante à rayonnement synchrotron sources28,30,40,41 ainsi que pendant plus techniquement exigeant des expériences de TR-SFX à XFELs9,10,13,,42.
Des expériences de TR-SFX comparables ont été réalisées en utilisant d’autres types d’injecteur comme phase liquide livraison dans un flux axé buse6,7,12, cependant, cette méthode nécessite des quantités de protéines n’est pas disponibles pour un grand nombre cibles intéressantes sur le plan biologique. Pour la détermination des structures statiques à l’aide de l’extrusion visqueuse une consommation moyenne de 0,072 mg de protéines par diffraction de 10 000 indexé par rapport à 9,35 mg pour le jet de liquid les buses ont été signalés (c'est-à-dire, environ 130 fois plus d’échantillon efficace)20. L’injecteur haute viscosité s’est avéré être un dispositif d’administration échantillon viable pour TR-SFX tout en seulement sacrifiant certains de cet échantillon efficacité43. Dans Nogly et coll. (2018)10, par exemple, consommation d’échantillon était environ 1,5 mg par 10 000 modèles indexées, qui se compare favorablement à des expériences similaires de TR-SFX en utilisant le PP où la consommation moyenne d’échantillon était beaucoup plus élevée avec 74 mg de protéine pour 10 000 habitants 6de patrons indexée. Injecteurs de haute viscosité ont donc des avantages manifestes lorsque la quantité de protéines disponibles est limité, ou lorsque les cristaux est cultivées directement en LCP.
Pour TR-SFX en utilisant haute viscosité injecteurs de céder les données plus fiables plusieurs questions techniques doivent être abordés : la vitesse d’écoulement doit rester supérieur à une valeur critique minimale ; le taux de succès doit être maintenu à un niveau qui ne rend pas la collecte de données lente (par exemple, supérieure à 5 %) ; et l’échantillon doit être livré sans perturbations excessives. Idéalement, ces conditions sont déjà remplies bien avant une expérience TR-SFX régulier d’utiliser le temps disponible de XFEL aussi efficacement que possible. Exploitation, un ralentissement du flux de LCP peut permettre de sonder les cristaux qui ont été activés avec plus d’une impulsion laser optique et provoquer des États actifs mixtes, ou matériau pompé de palpage lorsqu’umpumped matériel est attendu dans le faisceau. Un autre avantage d’injection pré-test est que les temps d’arrêt au cours de la collecte de données à un XFEL est minimisée comme temps relégué au remplacement des injecteurs bouchés, changeant des échantillons non-extrusion, et autres tâches de maintenance est réduite.
Nous présentons ici une méthode pour optimiser la livraison d’échantillon pour la collecte de données TR-SFX avec un injecteur de micro-extrusion de haute viscosité. Pour plus de simplicité, les méthodes décrites ne comptent pas sur l’accès à une source de rayons x, même si le travail à une source de rayonnement de synchrotron29 pourrait fournir des informations complémentaires sur le taux de succès escomptés et diffraction de cristal. Nos protocoles ont été développés pour optimiser les expériences pour capturer une isomérisation rétinienne dans la pompe à protons bactériorhodopsine10 et sont réalisés en deux phases, commençant par la préparation des échantillons de cristaux pour l’extrusion suivie par l’extrusion de surveillance en utilisant une configuration de caméra à grande vitesse. Dans la première phase, le LCP chargés de cristal est mélangé avec LCP supplémentaire, lipides de transition basse température ou d’autres additifs pour assurer que le mélange final est adapté pour la livraison dans l’environnement de l’échantillon sans colmatage ou ralentissement. Un nouveau coupleur seringue trois voies a été développé pour améliorer l’homogénéité mélange de performance et d’échantillon. La deuxième phase se compose d’un test d’extrusion enregistré par une caméra rapide de mesurer directement la stabilité de vitesse d’extrusion. Suite à l’analyse des données vidéo, effectuer le réglage du protocole de préparation d’échantillon pour améliorer les résultats expérimentaux. Ces procédures peuvent être adaptés pour préparer d’autres protéines pour la collecte de données TR-SFX, avec des modifications minimes et contribueront à une utilisation efficace des beamtime XFEL limitée. Avec de nouvelles installations XFEL juste de commencer leur opération44,45 et le transfert des méthodes de collecte de données série axée sur l’injecteur à synchrotrons28,30,40,41 , les années à venir sûrement continuera à fournir passionnantes nouvelles connaissances sur la dynamique structurale d’une gamme toujours plus grande des protéines cibles.
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Protocol
1. préparation des échantillons de Crystal protein
- Environ 30 min avant que l’échantillon doit être injecté, charge 50 µL de cristal-laden monooléine base LCP dans une seringue en 100 µL.
- Pour injection à la pression atmosphérique : charge 10 µL de paraffine liquide à l’arrière d’une deuxième seringue. En tenant la seringue verticalement, expulser les bulles d’air de la seringue.
- Pour l’injection dans l’environnement sous vide : charge 5 µL de MAG 7,9 et 5 µL de paraffine liquide à l’arrière d’une deuxième seringue. En tenant la seringue verticalement, expulser les bulles d’air de la seringue.
- Connecter la seringue avec paraffine/MAG 7,9 à un coupleur seringue standard, purger l’air du coupleur en appuyant doucement sur le piston jusqu'à ce qu’un petit volume (< 1 µL) de paraffine/lipide est visible à l’extrémité de l’aiguille du coupleur.
- Connecter la seringue de l’échantillon pour le coupleur de la seringue, en prenant soin de ne pas introduire d’air dans l’échantillon. Mélanger dans la lipide/paraffine en passant de l’échantillon à travers le coupler plusieurs fois.
- Dans une autre seringue de 100 µL de charger 20 µL de LCP prémélangée (27 % PEG, 100 mM pH Sorensen 5.6 + MO). Enlever les bulles d’air si nécessaire.
- Retirez la seringue vide le coupleur et fixez le LCP prémélangée à la seringue à l’aide d’un coupleur de seringue standard cristallifères. Passer l’échantillon à travers le coupleur 100 fois.
Remarque : Exemple de mélange peut chauffer l’échantillon légèrement46. Mélange doit être fait à un rythme lent où la température de l’échantillon peut être tenue relativement constante. - Inspecter l’échantillon pour la transparence contre une source de lumière. Si un LCP transparent homogène est formée, passez à l’étape 1.9.
- Amener l’échantillon dans la phase cubique, ajouter 3 µL de monooléine et mélanger 50 fois (comme décrit ci-dessus). Répétez cette procédure jusqu'à ce qu’une phase transparente a formé pour éviter un excès de monooléine.
Remarque : La formation de la LCP est dépendante de la température47 et obtenir les meilleurs résultats sont atteints légèrement au-dessus de 20 ° C. Le montant des monooléine supplémentaire nécessaires dépendra du volume de solution precipitant résiduelle reporté de cristallisation. - Au préalable tester la rigidité de l’échantillon (comme prévu dès la phase LCP) et extrudez-capacité, détacher la seringue vide de l’attelage de la seringue et, tenant la seringue verticalement, déposez une petite quantité d’échantillon (< 2 µL) par l’intermédiaire de l’attelage. Si l’échantillon extrudé forme un cylindre vertical, puis l’échantillon est prêt pour les essais d’extrusion.
- Ajustez le volume total de l’échantillon à 100 µL en ajoutant plus prémélangée LCP (comme à l’étape 1.5).
- Fixer la seringue de l’échantillon et deux seringues vides au coupleur seringue trois voies (purger l’air de l’attelage comme avant). Mélanger au moins 50 fois (ou jusqu'à homogénéité) en passant la moitié de l’échantillon dans la deuxième seringue puis en pressant les deux moitiés de l’échantillon dans la seringue troisième simultanément.
- Placer la seringue contenant l’échantillon mélangé au microscope stéréo pour vérifier une répartition homogène des cristaux.
2. essai d’Extrusion d’échantillon en utilisant une configuration de caméra haute vitesse
- Détermination des paramètres expérimentaux.
- Sélectionnez la taille de la buse pour le test.
Remarque : Les tailles de buse sont généralement 50 ou 75 µm diamètre interne (ID), mais n’importe quelle taille d’environ 30 à 100 µm ID peut être considéré comme. Sélection est basée sur un équilibre entre le temps moyen de colmatage, diffusion de fond, échantillon consommation et taux de succès. - Calculer la vitesse d’écoulement optimale basée sur la taille du spot laser expérimental (diamètre de2 1/e) et le schéma de collecte de données (p. ex., entrelacée de lumière et sombre) qui servira à XFEL.
- Calculer le débit souhaité (
) de l’échantillon de la vitesse d’écoulement optimale (
) et le diamètre du gicleur choisi (
) :
Déterminer le débit (
) qui doit être entré à la pompe HPLC basée sur le coefficient d’amplification (
) de l’injecteur.
Calculer la pression maximale (
) de la pression nominale de l’aménagement de la buse (
) et le coefficient d’amplification de l’injecteur (
) :
- Sélectionnez la taille de la buse pour le test.
- Programme d’installation de l’injecteur d’extrusion de haute viscosité pour utilisation hors connexion, comme illustré à la Figure 1.
Remarque : Les fonctions de l’injecteur par extrusion hydraulique alimenté par une pompe HPLC et utilise une gaine de gaz hélium fluide conjointement contrôlée par un régulateur de gaz. L’installation de la pompe et le régulateur ne sont pas abordées dans le présent protocole. Consultez le chapitre quatre de James (2015)48 pour un manuel détaillé.- Purger la pompe et toutes les canalisations d’eau afin d’assurer les débits sont exactes. Purger la scène hydraulique de l’injecteur.
- Monter l’injecteur (ou l’appareil photo) sur une scène en trois axes pour faciliter le cadrage et mise au point pour les vidéos à grande vitesse. Laisser un espace autour du point d’injection pour l’objectif, l’illumination, écran réfléchissant et un petit bécher pour attraper l’échantillon irradié.
- Construire une buse « factice » (un réservoir vide avec une buse attaché) et installez-le sur l’injecteur pour faciliter le positionnement, le focus et illumination.
- Monter la caméra à grande vitesse avec la buse près du point focal de l’objectif.
- Positionnez l’écran réfléchissant derrière l’injecteur et régler l’éclairage pour la lumière avant la buse.
- Allumez et vous connecter à l’appareil photo avec le logiciel fourni. Avec une vidéo en direct en cours d’exécution pour la rétroaction visuelle, placer l’extrémité de la buse dans le centre de l’image et l’emmener en mise au point avec la scène de trois axes.
- Régler l’éclairage jusqu'à ce que la buse soit bien visible et de l’arrière-plan est éclairé uniformément.
- Configuration de la caméra d’enregistrer des vidéos time-lapse à grande vitesse.
- Set de framerate à 1000FPS. La valeur de résolution 512 x 512 pixels.
- Avec le temps de pose maintenant fixé par la cadence, ajustez le niveau d’éclairement jusqu'à ce que la buse est visible (c'est-à-dire, non sous- ou surexposées). Repositionner la buse afin qu’il soit centré de gauche à droite et se trouve dans le tiers supérieur du cadre.
- Exécuter des opérations de balance des blancs ou de correction de fond.
- Mettre en place la caméra en mode Time-lapse. Un intervalle défini à 30 s et se répète à 40 fois, définir le mode de déclenchement aléatoire (ou reset aléatoire) et entrez le nombre d’images à enregistrer à 1000.
- Charger le réservoir avec 20 µL de l’échantillon et fixez l’embout capillaire.
- Fixer le réservoir rempli à l’injecteur. Fixez le tuyau de gaz dans le port de la buse et démarrer le flux de gaz.
- Manuellement, faire avancer le piston en ouvrant la vanne en ligne en appuyant sur la seringue. Fermer le robinet quand le piston fait un contact solid avec l’échantillon dans le réservoir.
- Programmer la pompe avec le débit calculé et sélectionner la pression maximale à la valeur calculée (voir étape 2.1.3).
- En même temps, démarrer la pompe et l’enregistrement de la caméra.
- Comme l’extrusion commence, régler la pression du gaz pour accroître la stabilité. Augmenter la pression du gaz si le liquide forme une goutte à l’extrémité de la buse au lieu d’une colonne. Réduire la pression si l’extrusion est cassée en raison du cisaillement excessif de l’écoulement de gaz, ou oscille rapidement (fouet).
- Surveiller l’extrusion (10 min est habituellement assez pour reconnaître une condition d’écoulement homogène) et, lorsque la pression de la pompe rampes brusquement vers le haut près de l’heure de fin prévue, arrêter l’enregistrement, arrêter la pompe et évacuer la pression du système en ouvrant la vanne de décharge.
- Analyse des fichiers vidéo
Remarque : Extrusion d’échantillon qui est clairement insuffisante ne requiert pas une analyse détaillée. Toutefois, il est toujours utile d’identifier le mode de défaillance afin que l’échantillon peut être optimisé.- Ouvrez le fichier vidéo avec le logiciel d’analyse (p. ex., Fidji49) et étalonner les instruments de mesure.
- Étalonner les mesures en sélectionnant une ligne de longueur connue dans l’image vidéo avec l’outil de sélection de ligne. Ouvrez la fenêtre de l’Échelle définie via Analyze | Définissez l’échelle et entrez la distance connue et les unités de mesure.
Remarque : Le diamètre connu de la buse offre une longueur de calibrage adéquat pour ces mesures. - Trouver un cadre dans la vidéo où il y a une fonctionnalité traçable visible (par exemple, un cristal) dans l’extrusion. Notez le numéro de châssis.
- Avancez la vidéo à un cadre où la même fonctionnalité est visible, mais a déplacé de sa position dans l’étape précédente. Notez le numéro de châssis.
- À l’aide de l’outil de mesure de ligne droite, mesurez la distance entre le début caractéristique et le point de terminaison via Analyze | Mesure.
Remarque : Plus la distance traçable, les moins d’erreurs de mesure affectera les calculs - Calculer la vitesse de réaction de la distance et le temps écoulé (le nombre de frames écoulés divisé par framerate).
- Répétez les étapes 2.11.3-2.11.6 plusieurs fois pour chaque segment de la vidéo.
- Tracer des séries de données comme dans la Figure 2.
) de l’échantillon de la vitesse d’écoulement optimale (
) et le diamètre du gicleur choisi (
) :
) qui doit être entré à la pompe HPLC basée sur le coefficient d’amplification (
) de l’injecteur.
) de la pression nominale de l’aménagement de la buse (
) et le coefficient d’amplification de l’injecteur (
) :
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Representative Results
Le produit de départ idéal pour les procédures décrites ici (Figure 3) sont des densités élevées de microcristaux incorporé dans le milieu visqueux porteur pour l’injecteur. La procédure nécessite environ 50 µL du transporteur en charge de cristal pour chaque préparation. Ceux-ci peuvent être cultivés directement en LCP comme avec le bR9,10 utilisé ici, à titre d’exemple (Figure 4), ou préparés à l’aide de cristaux dans les configurations de diffusion de vapeur classiques. Un excellent guide vidéo à cristallisation directement dans des seringues étanches au gaz se trouvent dans Ishchenko et coll. (2016)37. Avec bR, le diamètre idéal des plaques cristallines est autour de 20 μm comme un bon compromis entre le pouvoir de diffraction et homogène d’activation par le laser de pompe. Des cristaux de protéines, préparés en utilisant des protocoles comme expliqué ci-dessus, ont été utilisés pour recueillir des données de TR-SFX sur le bR de pompe de proton qui a révélé les changements ultrarapides qui apparaissent après l’absorption de photons (Figure 5).
Après préparation de l’échantillon à l’aide de l’attelage de trois voies (Figure 6 aB), une inspection visuelle de l’échantillon dans la seringue montre des exemples d’images homogénéité (Figure 6D) et microscope de l’échantillon mélangé, aussi bien dans le seringue et sur une diapositive, peut confirmer la densité des cristaux et permet pour les mesures des tailles de cristal, distribution de taille de cristal et la densité de cristal. L’exemple se trouve dans la phase cubique lorsque le moyen de livraison est clair (Figure 7) et visqueux. Mélanges de troubles sont une indication que l’échantillon est dans une éponge phase ou phase lamellaire, mais ne sont pas concluants, comme densité haute cristallerie peut obscurcir la clarté LCPs. Un bref test à basse pression pour cerner la phase liquide éponge peut être effectué en tirant sur le piston de la seringue de l’échantillon à l’arrière de la seringue. Phase lamellaire peut être facilement identifié par sa biréfringence avec microscopie polarisée. Ces tests couplés avec un test avant extrusion sont généralement suffisantes pour justifier un test dans l’injecteur.
Le taux de redoublement élevés de XFELs nécessite une vitesse d’écoulement qui ne peut être adéquatement respectée avec caméras taux images basse. Par conséquent, la caractérisation de l’extrusion se faite à l’aide d’une caméra haute vitesse (couplée à une lentille de grossissement élevé) qui peut enregistrer des vidéos time-lapse. Données vidéo sont à grande vitesse dans ce cadres sont enregistrées à 1000FPS et aussi de time-lapse que vidéo est enregistrée pour 1 s toutes les 30 s. Ce système de collecte de données permettra la collecte de données lors de l’essai de l’ensemble de l’échantillon (environ 10 min) sans créer de fichiers vidéo ingérables. Même avec cet ensemble de données réduit la taille fichiers vidéo peuvent encore être dépassant les 50 Go. Il faut pour assurer l’entreposage adéquat n’est disponible pour enregistrer des données vidéo avant le début de l’épreuve.
Pendant l’essai de jet (Figure 1), l’échantillon doit s’écouler une colonne continue de long (plus de 200 µm) de LCP qui se déplace à une vitesse presque constante (Figure 2). Exemples qui fonctionnent en mode dégoulinant indiquent que la viscosité de l’échantillon est trop faible (Figure 2). Échantillons peuvent souvent être récupérés et mélangés avec plus de monooléine ou de paraffine pour adapter la viscosité. Les échantillons qui forment une colonne doivent être testés avec la caméra à grande vitesse. Données de l’enregistrement doivent démontrer que l’extrusion reste supérieure à une vitesse minimale dictée par vos paramètres expérimentaux. Vitesse d’extrusion est déterminée en mesurant la distance linéaire qu'une fonctionnalité dans le flux LCP se déplace sur un certain nombre de cadres. Ralentissements extrusion que l'on peut attribuer aux sabots anormales garantissent un nouvel essai. S’ils persistent jet devrait être amélioré par des additifs comme la paraffine, en réduisant la densité des cristaux ou en sélectionnant une buse de diamètre plus grande. Les cristaux ne poussent pas habituellement dans un milieu visqueux (p. ex., diffusion de la vapeur) peuvent être peletted par centrifugation et incorporé dans LCP ou d’autres transporteurs visqueux. Pour obtenir des exemples, voir précédentes publications24,25,26,27,29,30.
Figure 1 : configuration de caméra haute vitesse banc. Une photo d’une installation typique de benchtop avec les pièces essentielles étiqueté. L’étape trois axes apporte une flexibilité de cadrage et mise au point de l’image. L’injecteur (montré avec la buse et le réservoir attaché) est monté verticalement et directement en face de la lentille de l’objectif. L’illumination dans cet exemple est fournie par une lumière seule fibre illuminant l’échantillon hors axe et en fournissant un champ lumineux sur l’écran. Un échantillon monté et illuminé de cette manière fournit une image semblable à celui de médaillon B. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse de données et de tests de caméra rapide. Sur la photo ci-dessus sont deux tests d’extrusion de LCP. Essai A présente cristaux bR LCP extrusion dans un mode dégoulinant, qui indique que l’échantillon n’est pas optimisé. Test B montre extrusion LCP formant une colonne continue de LCP où les cristaux peut être suivis, et vitesse d’extrusion peut être calculée. Dans cet exemple, un cristal incorporé dans la colonne LCP (50 µm de diamètre) déplace 301 µm en 8 ms (37,6 mm/s). Deux ensembles de données des différentes préparations de cristaux de bactériorhodopsine en LCP sont indiqués. Quatre (ou plus) des points de données de chaque seconde de vidéo time-lapse caméra haute vitesse (1 s d’enregistrer toutes les 30 s) ont été tracées. Un grand écart entre les points de données tirées d’une seule seconde période de collecte de données indiquent la variation de vitesse à court terme. Alors qu’une moyenne mobile sur les séries de données entière montre les fluctuations plus longtemps dans le flux. La série d’albums fait auprès d’un échantillon de mal extrusion (possibilité élevée de contamination légère avec deux impulsions de laser de pompe consécutives), et la série bas provient un échantillon exécutés de façon optimale. La ligne pointillée horizontale indique la cible extrusion vitesse réglée par l’intermédiaire de la pompe HPLC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : diagramme de préparation échantillon. Préparation de l’échantillon commence par une forte densité de cristaux de protéines incorporées dans LCP. L’échantillon est ensuite mélangé avec les lipides de transition basse température, paraffine et préparé LCP jusqu'à ce que l’échantillon vient dans la phase cubique et passe une série de petits tests pour indiquer que l’échantillon sera extruder dans l’injecteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : cristaux de Bactériorhodopsine comme matériau de départ. Cristaux est cultivés dans des seringues étanches au gaz (A), avec LCP immergée dans la solution precipitant. La cristallisation est optimisée pour une haute densité de cristaux avec une granulométrie éventuellement étroite (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : changements structurels dans la bactériorhodopsine. TR-SFX révèle ultra rapides changements dans la structure de la bactériorhodopsine de pompe de proton. Voici un modèle de bR tirée des données de TR-SFX obtenues des cristaux préparés en utilisant les protocoles décrits dans cet ouvrage sur la photo. Le panneau de gauche montre le modèle avec des caractéristiques en surbrillance dans la poche de liaison rétinienne. Le panneau de droite montre les changements dans la rétine de femtosecondes millisecondes. Ce chiffre a été reproduit d’après Nogly et coll. (2018)10 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : le coupleur tridirectionnelle. Le coupleur de trois voies est un table de mixage morts-volume Y réduit conçu pour assurer la compatibilité avec des seringues étanches au gaz. Des rendus 3D de l’attelage, montrent une vue éclatée de l’Assemblée (A), et une vue transparente montrant le mixage des canaux b. La figure montre une répartition inhomogène de cristal après avoir mélangé avec le coupleur standard (C) et la suspension obtenue après avoir mélangé dans le coupleur de trois voies (D). Mélange s’effectue en poussant à peu près de la moitié de l’échantillon dans une autre seringue (E) et puis en poussant les deux moitiés dans la seringue en restante ensemble comme indiqué par les flèches bleues (F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : avant injection indicateurs tests. Au cours de la préparation de l’échantillon, plusieurs petits tests sont utilisés pour indiquer que l’échantillon est en phase et suffisamment visqueux. La clarté optique est un indicateur que l’échantillon est probablement dans la phase cubique. (A) un échantillon Turbide est montré dans la seringue. (B) un exemple clair est présenté, noter les graduations visibles à travers l’échantillon malgré la forte densité de micro-cristaux. Lorsque la matrice lipidique est dans la phase cubique, il reste solide comme aucun stress. Un essai à basse pression en tirant sur la seringue de l’arrière de l’échantillon. Lorsque l’échantillon est trop liquide-like (indicative de la phase de l’éponge) l’échantillon se développe pour occuper le volume (C). Dans un résultat positif du test même (D), l’échantillon reste statique malgré le piston retiré. Enfin, un essai d’extrusion macro-échelle se fait en appuyant une petite quantité d’échantillon dans le coupleur de la seringue. Une gouttelette formant à l’extrémité de la buse (E) ou un cylindre rapidement flexion de LCP indique un échantillon qui n’est pas assez visqueux. Si l’échantillon extrude, forme un cylindre qui reste debout dans le temps (F), alors l’échantillon peut-être avancer aux essais caméra à grande vitesse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode TR-SFX avec l’injecteur d’extrusion visqueuse s’est avéré pour être une technique viable pour les études de dynamique des structures de bactériorhodopsine9,10 et photosystème II13 et semble désormais prête à étudier des protéines conduisant l’autre certains processus biologiques photo comme transport ionique axée sur la lumière ou de la perception sensorielle5,50. Les protocoles décrits ci-dessus ont été conçues pour maximiser le succès de la collecte de données TR-SFX sur bactériorhodopsine, pourtant nous croyons peut agir comme un modèle pour optimiser la collecte de données sur d’autres échantillons. Ainsi, actuellement, une grande partie de la beamtime précieux perdu à cause de l’obstruction ou extrusion pauvre échantillon pourrait plutôt servir à collecter des données mieux à plusieurs retards.
L’étape la plus difficile et critique dans le protocole est l’addition de petites quantités de monooléine qui apporte la matrice lipidique dans la phase cubique (étape 1.8). La difficulté réside dans la subtilité de la transition de phase et l’effet négatif sur l’échantillon lorsque monooléine est ajouté en excès.
Modifications apportées à la méthodologie doivent être implémentées pour accueillir des cristaux de protéines différentes. Ce n’est peut-être pas compatibles avec les mêmes additifs ou le montant ou le mélange requis. En revanche, briser les cristaux en petits morceaux pendant le processus de mélange ne peut pas compromettre la qualité de diffraction et peut même améliorer le nettoyage au jet par exemple lors de longues aiguilles casser en fragments plus courts. Différents additifs pourraient se substituer à la place de la paraffine, qui est ajouté pour améliorer le débit vitesse stabilité9. MAG 7,9/9,7 est ajouté afin d’éviter la trasnistion phase lamellaire pouvant survenir lors de l’injection dans des environnements20 (comme l’endstation CXI à L.I.C.) à vide, mais peut être omise si l’expérience est faite à la pression atmosphérique. Dans notre expérience, beaucoup de cristaux de protéines solubles peut être stablement incorporés dans LCP, encore un peu ironiquement protéine membranaire cristaux ne cultivés pas directement dans les mésophases lipidiques souvent dissoudre sans doute parce que les détergents sont extraites du cristal dans l’environnement de type lipidique qui les entourent. Dans ce cas, il devrait être jugé pour remplacer entièrement les LCP avec un autre transporteur visqueux24,25,26,27,29,30.
Modifications à l’épreuve de la caméra à grande vitesse peuvent accueillir des échantillons où les cristaux ne sont pas visibles au sein de l’entreprise. Par exemple, éclairage peut être configuré pour enregistrer des vidéos à l’aide de la microscopie optique polarisée. Cela provoquera des cristaux biréfringents d’apparaître (comme une lueur) et révèle aussi des parties de la matrice de lipides qui se trouvent dans la phase lamellaire BIRÉFRINGENTE.
Modifications de côté, il est essentiel que la préparation de cristaux de protéines répondre autant que possible aux critères suivants. Les cristaux doivent être dimensionnés de façon optimale afin de maximiser la diffraction tout en minimisant les injecteur de colmatage. La densité de cristal doit être suffisamment élevée pour obtenir un taux de succès suffisant pour collecter des ensembles de données complets, mais pas trop dense quant à compromettre la stabilité du jet (une densité trop élevée peut habituellement être diluée ; dans le cas de bR, ajustement à un taux de succès de 10 à 30 % habituellement worke d bien). La matrice lipidique doit être inclue dans la phase cubique, et la suspension de cristal doit être homogène.
TR-SFX tient de grands avantages par rapport aux autres techniques de cristallographie résolue dans le temps comme la diffraction de Laue parce que : radiolésions sont limitée en raison de la méthodologie « diffraction avant destruction », TR-SFX a une résolution temporelle large sur beaucoup de commandes de ampleur et vers le bas pour la gamme femtoseconde, les petits cristaux permettent photoactivation mieux, et l’amenés d’intérêt ne doivent pas être réversible.
TR-SFX à un XFEL utilisant l’injecteur haute viscosité a des avantages significatifs sur un injecteur liquide en termes d’économies de l’échantillon. Comparant directement PP6 et bR10, par exemple, indique une diminution par un facteur de 50 pour la même quantité d’images collectées par diffraction. Jets de liquides ont en revanche un avantage que l’écoulement est rapide et, la collecte de données fonctionne à plein régime (alternance des images claires et foncées), sans tenir compte de la stabilité de vitesse de flux injecteur (ou contamination légère en cadres sombres). Alors que le jet visqueux ajouter de nouveaux défis, il convient de considérer que jet de liquide TR-SFX utilise des quantités de protéines qui peut être tout à fait déraisonnable produire de nombreux systèmes biologiquement pertinentes.
Actuellement, préparation des échantillons visqueux pour TR-SFX est limitée par la compatibilité de cristal avec le milieu de la livraison. Bien qu’il y a eu plusieurs autres transporteurs visqueux mis en place, aucun ont été trouvés à travailler dans tous les cas. En outre, livraison d’échantillon avec un injecteur haute viscosité sera toujours soumis à l’encrassement, ou ralentissement même avec optomozation utilisant ce protocole. Une autre limite de la technique est la réduction inhérente au taux de succès en diluant de l’échantillon pour l’amener à l’extrudabilité optomised.
À l’avenir, méthodes TR-SFX peuvent être prolongées de protéines cibles avec des chromophores naturelles à ceux qui ont photocommutateur synthétique. Résolution temporelle des mesures sur les réactions qui ne peuvent pas être photoactivation doivent s’appuyer sur mélange, sauts de température, des champs électriques ou autres technologies d’activation qui tardent à s’adapter à la cristallographie de la série. Une combinaison de ces technologies de déclenchement ainsi que la disponibilité accrue de XFEL beamtime sera, au fil du temps, jeter les bases pour comprendre la dynamique des structures de la fonction des protéines à l’échelle atomique.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucuns en conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous reconnaissons Gebhard Schertler, Rafael Abela et Chris Milne pour favoriser l’utilisation des injecteurs haute viscosité à la PSI. Richard Neutze et son équipe sont reconnus pour des discussions sur la résolution temporelle de cristallographie et livraison d’échantillon à l’aide d’injecteurs haute viscosité. Soutien financier, nous reconnaissons la Swiss National Science Foundation pour subventions 31003A_141235, 31003A_159558 (à J.S.) et PZ00P3_174169 (pour avis). Ce projet a été financé par la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et le programme d’innovation en vertu de la subvention de Marie-Curie-Sklodowska accord N° 701646.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
References
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