Summary
ההצלחה של ניסוי קריסטלוגרפיה הפמטו-זמן לפתור שנייה טורי תלויה משלוח הדגימה היעילה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים כדי למטב את ההבלטה של bacteriorhodopsin microcrystals של מזרק מיקרו-הבלטה צמיגות גבוהה. המתודולוגיה מתבססת על מדגם המגון עם מצמד-כיוונית הרומן והדמיה עם מצלמה במהירות גבוהה.
Abstract
צמיגות גבוהה מיקרו-הבלטה מרססים באופן דרמטי הפחיתו צריכת מדגם בניסויים לחקר הגבישים בפמטושניות טורי (SFX)-רנטגן לייזר אלקטרונים חופשיים (XFELs). סדרה של ניסויים באמצעות את bacteriorhodopsin משאבת הפרוטונים מונחה אור נוסף הקמנו מרססים אלה כאפשרות המועדפת לספק קריסטלים עבור קריסטלוגרפיה זמן לפתור בפמטושניות טורי (TR-SFX) לפתור את השינויים המבניים של חלבונים לאחר photoactivation. כדי לקבל מספר מבניים תמונות באיכות גבוהה, זה חיוני כדי לאסוף כמויות גדולות של נתונים ולהבטיח סיווג של הגבישים בין כל פולס לייזר המשאבה. כאן, אנו מתארים בפרוטרוט איך אנחנו אופטימיזציה ההבלטה של bacteriorhodopsin microcrystals עבור ניסויים TR-SFX האחרונה שלנו-Linac קוהרנטי אור מקור (LCLS). מטרת השיטה היא לייעל את ההבלטה זרימה יציבה ורציפה תוך שמירה על צפיפות גבוהה של גבישים כדי להגביר את הקצב-אילו נתונים ניתן לאסוף ב- TR-SFX הניסוי. אנו להשיג מטרה זו על-ידי הכנת שלב מעוקבים lipidic עם התפלגות הומוגנית של גבישים באמצעות מזרק 3 חלקים הרומן צימוד המכשיר ואחריו התאמת הרכב הדגימה על סמך מדידות של יציבות ההבלטה עם למהירויות גבוהות כיוונון המצלמה. המתודולוגיה ניתן להתאים כדי לייעל את זרימת microcrystals אחרים. ההתקנה תהיה זמינה עבור משתמשים של המתקן החדש שוויצרי לייזר אלקטרונים בחינם.
Introduction
קריסטלוגרפיה בפמטושניות טורי (SFX) היא טכניקה ביולוגיה מבנית המנצלת את תכונותיו הייחודיות של רנטגן לייזר אלקטרונים חופשיים (XFEL) כדי לקבוע את טמפרטורת החדר מבנים מתוך אלפי גבישים בגודל מיקרומטר תוך לעומת רוב הנזק קרינה ע י2,31,עקרון "עקיפה לפני החורבן".
סיומת זמן לפתור של SFX (TR-SFX), הפולסים הפמטו-שנייה מ XFEL משמשים ללמוד שינויים מבניים חלבונים4,5. החלבון עניין מופעל עם לייזר אופטי (או מפעיל פעילות אחרת) רגע לפני שנורה על ידי XFEL בתוך מלכודת משאבת-בדיקה. על ידי שליטה בדיוק העיכוב בין פולסים משאבת, בדיקה, ניתן ללכוד את חלבון המטרה במצבים שונים. סרטים מולקולרית של שינויים מבניים מעל 11 סדרי גודל בזמן להדגים את הכוח של מקורות XFEL חדש ללמוד את הדינמיקה של מספר חלבונים מטרות6,7,8,9, 10,11,12,13. ב־1995, השיטה מצטרף הטכניקות מבניים ספקטרוסקופיות וסטטיים דינמי לתוך אחד, המספק הצצה לתוך הדינמיקה חלבון-ליד ברזולוציה אטומית.
מערכות פשוטות עבור TR-SFX עשויים להכיל בגורם מפעיל אנדוגני של הפעלת עם מרכיב צילום רגיש כמו רשתית תוך9,bacteriorhodopsin (bR)10, הן את photosystem השנייה12,13, חלבון photoactive צהוב (PYP)6,7 הפיכה photoswitchable חלבון פלואורסצנטי11, או של חד-תחמוצת הפחמן photolyzable מיוגלובין8. וריאציות מרגש של הטכניקה עדיין בפיתוח להסתמך על תמהיל ולהזריק14,ערכות15 ללמוד אנזימטיות או שדה חשמלי המשמש לזירוז שינויים מבניים16. בהתחשב בכך מקורות XFEL היו זמינים רק במשך כמה שנים, חיוץ אחרי הצלחות לעתיד, השיטה מראה פוטנציאל אמיתי למשחקים לגבי הבנתנו כיצד הפונקציה חלבונים.
כי דגימות ביולוגיות נהרסים על ידי החשיפה יחיד בחזקה גבוהה XFEL הדופק, גישות חדשות חלבון קריסטלוגרפיה היו נחוצים. בין הניתוחים, היכולת לגדל כמויות גדולות של microcrystals אחיד צריך להיות מפותח17,18,19. כדי לאפשר איסוף נתונים-XFEL, גבישים אלו חייב להיות מסר, שנמחקו, חידש אז לכל פעימה XFEL. בהתחשב בכך XFELs אש פולסים שמישים ב- 10-120 הרץ, משלוח הדגימה חייב להיות מהיר, יציב ואמין, תוך כדי שמירה גם הקריסטלים שלמים ולא הגבלת הצריכה. בין הפתרונות המוצלחים ביותר הוא מזרק מיקרו-הבלטה צמיגות גבוהה, אשר מספק של continiously הזרמת עמודה של טמפרטורת החדר עמוסי קריסטל lipidic מעוקבים שלב (LCP) על פני קרן רנטגן פעמו20. קריסטלים מונחה באופן אקראי, מוטבע נחל כזיב LCP, נקלטים הפיזור פולסים XFEL רנטגן על גבי גלאי שבו נרשם תבנית עקיפה. LCP היה בחירה טבעית עבור מדיום משלוח הדגימה כפי הוא משמש לעתים קרובות כאמצעי לצמיחה עבור ממברנה חלבון קריסטלים17,21,22,23, מדיה נושאת עדיין אחרים צמיגות גבוהה 24,25,26,27,28,29,30 ו חלבונים מסיסים31 גם שימשו את מזרק. SFX עם מזרק צמיגות גבוהה הצליחה במהלך קביעת מבנה הממברנה חלבונים13,32 כולל G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs)33,34, 35,36,37, עם איכות הנתונים מספיק עבור ילידי בהדרגה38,39 בעת היותו בזמן והן מדגם יעיל. כיום, מרססים אלה משמשות באופן שגרתי יותר עבור מדידות טמפרטורת החדר-סינכרוטרון מקורות28,30,40,41 , כמו גם יותר טכנית בדרישה TR-SFX ניסויים ב XFELs9,10,13,42.
ניסויים TR-SFX דומות בוצעו באמצעות סוגים אחרים מזרק נוזל שלב משלוח זרם ממוקד זרבובית6,7,12, עם זאת, שיטה זו דורשת כמויות חלבון אינו זמין עבור רבים מטרות מעניינות מבחינה ביולוגית. מצפני מבנים סטטי באמצעות ההבלטה צמיגה הצריכה הממוצעת של 0.072 מ"ג חלבון לכל 10,000 עקיפה אינדקס דפוסי בהשוואה 9.35 מ"ג עבור המטוס נוזלי חרירי דווחו (קרי, על פי 130 יותר מדגם יעיל)20. מזרק צמיגות גבוהה הוכח להיות מכשיר משלוח הדגימה קיימא TR-SFX בלבד ללא צורך להקריב חלק זו הדגימה יעילות43. ב- Nogly et al. (2018)10, לדוגמה, דוגמת צריכת היה בערך 1.5 מ"ג לכל 10,000 דפוסים סדורים באינדקס, אשר משווה לטובה כדי ניסויים TR-SFX דומים באמצעות את PYP איפה צריכת ממוצע המדגם היה גבוה בהרבה עם-74 מ ג חלבון לכל 10,000 נפש דפוסים סדורים באינדקס6. מרססים צמיגות גבוהה ולכן יש יתרונות ברורים כאשר מגבילה כמות חלבון זמין או כאשר גבישים גדלים ישירות LCP.
TR-SFX באמצעות צמיגות גבוהה מרססים להניב הנתונים הכי אמין מספר בעיות טכניות צריך להתייחס: מהירות הזרימה צריך להישאר מעל ערך קריטי מינימלי; hit-הקצב צריך להישמר ברמה כזו אינה מציגה את איסוף הנתונים איטית (למשל, גדול מ- 5%); מדגם חייב להינתן ללא שיבושים מוגזמת. באופן אידיאלי, תנאים אלה מתקיימים כבר זמן רב לפני ניסוי TR-SFX מתוזמן לשימוש זמין XFEL זמן בצורה יעילה ככל האפשר. Pricipally, האטה בזרם LCP עשוי לאפשר חיטוט קריסטלים הופעלו עם פולס לייזר אופטי אחד או יותר, התוצאה במצבים מעורבים פעילים, או לחטט חומר שאוב כאשר החומר umpumped צפויה הקרן. יתרון נוסף של הזרקת מראש בדיקה היא השבתה בעת איסוף הנתונים ב- XFEL הוא ממוזער כזמן הועבר החלפת חרירים סתומים, שינוי החוצה ללא הבלטת ממד דגימות, משימות תחזוקה אחרות מצטמצם.
כאן, אנו מציגים שיטה כדי למטב את משלוח מדגם TR-SFX איסוף הנתונים עם מזרק מיקרו-הבלטה צמיגות גבוהה. פשטות, השיטות המתואר אינם סומכים על גישה למקור רנטגן, למרות העבודה הפרעות לקרן החלקיקים סינכרוטרון29 לספק מידע נוסף אודות המחירים הכה צפוי ואת קריסטל עקיפה. הפרוטוקולים שלנו פותחו כדי למטב את הניסויים כדי ללכוד isomerization רשתית במשאבות פרוטונים bacteriorhodopsin10 , מתבצעת בשני שלבים החל בהכנת הדגימות קריסטל לשחול ואחריו ניטור ההבלטה באמצעות התקנה מצלמה במהירות גבוהה. בשלב אחד, LCP עמוסי קריסטל מעורב עם LCP נוספים, מעבר נמוכה טמפרטורת שומנים או תוספים אחרים כדי להבטיח שהתערובת הסופית מתאימה עבור משלוח לסביבה מדגם ללא סתימת או האטה. מצמד-כיוונית מזרק חדש פותחה על מנת לשפר ערבוב ביצועים ודגימת הומוגניות. השלב השני מורכב מבחן ההבלטה שהוקלט על ידי מצלמה מהירה למדוד ישירות את יציבות מהירות ההבלטה. לאחר הניתוח של נתוני וידאו, התאמות שניתן יהיה בפרוטוקול הכנה הדגימה כדי לשפר את תוצאות הניסוי. הליכים אלה ניתן להתאים להתכונן לחלבונים אחרים TR-SFX איסוף נתונים, עם שינויים מינימליים, ויתרום בשימוש היעיל beamtime XFEL מוגבל. עם מתקנים XFEL חדשים רק מתחיל שלהם44,מבצע45 , ומעבר של שיטות איסוף נתונים טורי מבוססי מזרק synchrotrons28,30,40,41 , בשנים הקרובות ימשיכו בוודאי לספק תובנות חדשות מרגשות דינמיקת פעם-מגוון רחב יותר של מטרות חלבונים מבניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חלבון הכנת הדוגמא קריסטל
- כ 30 דקות לפני המדגם הוא כדי להיות מוזרק, טען 50 µL של monoolein עמוסי קריסטל מבוססת LCP מזרק µL 100.
- עבור הזרקה בלחץ אטמוספרי: עומס 10 µL של שמן פראפין לחלק האחורי של מזרק השני. מחזיק את המזרק אנכית, לגרש את בועות האוויר של המזרק.
- להזרקה לתוך סביבת ואקום: 5 טען µL של MAG 7.9 ו µL 5 של שמן פראפין לחלק האחורי של מזרק השני. מחזיק את המזרק אנכית, לגרש את בועות האוויר של המזרק.
- לחבר את המזרק עם פרפין/מאג 7.9 כדי מצמד מזרק רגיל, לטהר את האוויר מן מחבר בהקשת בעדינות על הבוכנה עד נפח קטן (< 1 µL) של פרפין/השומנים מוצגת בקצה המחט מצמד.
- לחבר את המזרק מדגם מחבר מזרק, מקפיד לא מציגים את כל האוויר לתוך הדגימה. מערבבים את השומנים/הפרפין על-ידי העברת החומר מדגם באמצעות מחבר מספר פעמים.
- לטעון µL 20 של LCP מעורבבים מראש (27% פג, 100 מ מ pH סורנסן 5.6 + מו) לתוך מזרק נוסף µL 100. הסר את בועות האוויר לפי הצורך.
- הסר את המזרק ריק מחבר וחבר LCP מעורבבים מראש את הקריסטל המכיל מזרק באמצעות מצמד מזרק רגיל. להעביר את הדגימה דרך מחבר 100 פעמים.
הערה: מדגם ערבוב עשוי לחמם את הדגימה מעט46. ערבוב צריך להיעשות בקצב איטי שבו הטמפרטורה של המדגם יכולים להיות מוחזקים קבוע למדי. - בדיקת המדגם לצורך שקיפות נגד מקור של אור. אם LCP ברור הומוגנית הקימה, עבור לשלב 1.9.
- להביא את הדגימה אל השלב מעוקב, להוסיף 3 µL של monoolein ומערבבים על פי 50 (כמתואר לעיל). חזור על הליך זה רק עד שלב שקוף הקימה כדי להימנע מעודף monoolein.
הערה: היווצרות של LCP הטמפרטורה תלוי47 , התוצאות הטובות ביותר מושגות מעט מעל 20 מעלות צלזיוס. צריך יהיה תלוי כמות monoolein נוספים באמצעי האחסון של פתרון precipitant שיורית הנישאת התגבשות. - כצעד מקדים לבדוק מדגם נוקשות (כצפוי מהשלב LCP) ויכולת הבלטה, לנתק את המזרק ריק של מחבר מזרק וללחוץ, מחזיק את המזרק אנכית, כמות קטנה של המדגם (< 2 µL) דרך מחבר. אם המדגם מעוקם טפסים של גליל זקוף, אז המדגם הוא מוכן לבדיקה ההבלטה.
- לכוון את עוצמת הקול הכולל לדוגמה כדי 100 µL על-ידי הוספת LCP יותר מעורבבים מראש (כמו שלב 1.5).
- לצרף את המזרק לדוגמה, שני מזרקים ריק מחבר מזרק-כיוונית (טיהור האוויר של מחבר כמו בעבר). לערבב לפחות 50 פעמים (או עד הומוגניות) על-ידי העברת מחצית המדגם לתוך המזרק השנייה ולאחר מכן הקשה על שני החצאים של המדגם לתוך המזרק השלישי בו זמנית.
- מקם את המזרק המכיל המדגם מעורב תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא התפלגות הומוגנית של גבישים.
2. בדיקות ההבלטה מדגם באמצעות התקנה מצלמה במהירות גבוהה
- קביעת פרמטרים ניסיוני.
- בחר את גודל החרירים עבור הבדיקה.
הערה: גודל החרירים בדרך כלל 50 או 75 מיקרומטר קוטר פנימי (ID), אבל בכל גודל של בערך 30-100 מיקרומטר מזהה עשויים להיחשב. הבחירה מבוססת על איזון בין זמן סתימת מרושע, רקע פיזור, דוגמת צריכת להיט-קצב. - לחשב את מהירות זרימה אופטימלית, על פי ניסיוני לייזר בגודל נקודה (קוטר 1/e-2 ) נתונים אוסף ערכת (למשל, רציף בהירה וכהה) שבה ייעשה בהם XFEL.
- לחשב את קצב הזרימה הרצויה (
) של המדגם של מהירות זרימה אופטימלית (
), קוטר הנחיר שנבחר (
):
לקבוע את קצב הזרימה (
) אשר יוזנו במשאבה HPLC בהתבסס על הגורם הגברה (
) של מזרק.
לחשב את הלחץ המירבי (
) הלחץ מדורג ביחס זרבובית (
), הגורם הגברה של מזרק (
):
- בחר את גודל החרירים עבור הבדיקה.
- כיוונון של מזרק ההבלטה צמיגות גבוהה לשימוש לא מקוון, כפי שמוצג באיור 1.
הערה: הפונקציות מזרק על-ידי ההבלטה הידראולי מופעל על ידי משאבת HPLC, ומשתמש נדן גז הליום שותף זורם נשלט על ידי הרגולטור גז. התקנה משאבת, הרגולטור לא נידונות פרוטוקול זה. ראה פרק ארבע ג'יימס (2015)48 עבור מדריך מפורט.- ניקוי המשאבה ואת כל קווי המים על מנת להבטיח ש-flowrates מדויקות. נקה את הבמה הידראולי של מזרק.
- הר של מזרק (או המצלמה) על הבמה שלושה צירים כדי להקל על מסגור ונוחות עבור קטעי וידאו במהירות גבוהה. להשאיר שטח סביב נקודת זריקה של העדשה אובייקטיבי, תאורה, מסך רפלקטיביים ו חבית קטנה כדי לתפוס את הדגימה בילה.
- לבנות "זרבובית דמה" (המאגר ריק עם זרבובית מצורף) ולהתקין אותו על מזרק כדי להקל על מיקום, פוקוס ו תאורה.
- לטעון את המצלמה במהירות גבוהה עם קצה הזרבובית ליד נקודת המוקד של המטרה.
- מקם את המסך רעיוני מאחורי מזרק ולהתאים את התאורה הקדמית-לאור הזרבובית.
- הפעל ולאחר לחבר המצלמה עם התוכנה המסופקת. עם וידאו חי פועל לקבלת משוב חזותי, מקם קצה הזרבובית במרכז של המסגרת, ולהביא אותה לידי פוקוס עם הבמה שלושה צירים.
- להתאים את התאורה עד הזרבובית. ברור הרקע מואר באופן שווה.
- קביעת התצורה של המצלמה כדי להקליט וידאו בצילום מואץ במהירות גבוהה.
- הגדרת קצב מסגרות ל 1000 fps. הגדר רזולוציה 512 x 512 פיקסלים.
- עם הזמן החשיפה עכשיו שקבע את קצב המסגרות, להתאים את רמת תאורה עד הזרבובית יהיה גלוי (קרי, לא תחת- או overexposed). מיקום מחדש הזרבובית עצה כך ממורכזת לשמאל וממוקם בשליש העליון של המסגרת.
- הפעל כל רקע תיקון או פעולות איזון לבן.
- להגדיר את המצלמה במצב זמן לשגות. קביעת מרווח זמן כדי 30 s וחוזר 40 פעמים, הגדר את מצב הגורם המפעיל אקראי (או איפוס אקראי) והזן מספר המסגרות להקליט עד 1000.
- לטעון את המאגר עם µL 20 המדגם המבחן ולצרף הזרבובית נימי.
- לצרף המאגר מלא מזרק. חבר צינור הגז ליציאה על הזרבובית ולהתחיל את זרימת הגז.
- מראש באופן ידני את הבוכנה על-ידי פתיחת המסתם בשורה והקשה את המזרק. סגור את השסתום כאשר הבוכנה. יוצר קשר מלא עם הדגימה בתוך המאגר.
- לתכנת את המשאבה עם קצב הזרימה מחושב והגדר את הלחץ המקסימלי המחושב (ראה שלב 2.1.3).
- במקביל התחילו המשאבה ואת ההקלטה המצלמה.
- כמו ההבלטה מתחיל, להתאים את לחץ הגז כדי להגביר את היציבות. להגדיל לחץ גזים אם הנוזל טפסים טיפה בקצה הצינור במקום עמודה. ירידה בלחץ אם ההבלטה שבור בגלל הטיה מוגזמת של זרימת הגז, או מהבהב במהירות (המלקות).
- לפקח על ההבלטה (10 דקות בדרך כלל מספיק כדי לזהות מצב זרימה הומוגנית) כאשר הלחץ משאבת רמפות בחדות למעלה ליד שעת הסיום הצפוי, לעצור את ההקלטה, כבה את המשאבה, לפרוק את הלחץ במערכת על-ידי פתיחת כי שסתום ההקלה שבור.
- ניתוח של קבצי וידאו
הערה: הבלטה מדגם זה בפשטות לקוי אינו דורש ניתוח מפורט. עם זאת, עדיין שימושי לזהות את מצב כשל כך אולי ניתן למטב את הדגימה.- פתח את קובץ הווידאו עם התוכנה ניתוח (למשל, פיג'י49), לכייל בכלי המדידה.
- כיילו את המידות על-ידי בחירת קו אורך הידוע התמונה בעזרת הכלי בחירה קו. פתח את החלון ' קבע קנה מידה ' ויה נתח | לקבוע קנה מידה , הזן את המרחק ידוע, את יחידות המידה.
הערה: קוטר הזרבובית ידועים מספק אורך כיול נאותה של מדידות אלה. - למצוא מסגרת וידאו שבו יש מאתריהם תכונה גלוי (למשל, גביש) ב ההבלטה. רשום את מספר מסגרת.
- לקדם את הוידאו למסגרת שבו התכונה אותו גלוי אך עברה ממיקומו בשלב הקודם. רשום את מספר מסגרת.
- בעזרת הכלי מדידה קו ישר, למדוד את המרחק מן ההתחלה תכונה קצה באמצעות נתח | מדד.
הערה: ככל המרחק מאתריהם, פחות שגיאות במדידה ישפיעו על החישובים - לחשב את מהירות המטוס מן המרחק נמדד הזמן שחלף (מספר מסגרות שחלף מחולק framerate).
- חזור על צעדים 2.11.3-2.11.6 כמה פעמים עבור כל קטע הווידאו.
- להתוות סדרת נתונים כמו באיור 2.
) של המדגם של מהירות זרימה אופטימלית (
), קוטר הנחיר שנבחר (
):
) אשר יוזנו במשאבה HPLC בהתבסס על הגורם הגברה (
) של מזרק.
) הלחץ מדורג ביחס זרבובית (
), הגורם הגברה של מזרק (
):
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חומר המוצא האידיאלי ההליכים המתוארים כאן (איור 3) הינם צפיפות גבוהה של microcrystals שולבו המוביל צמיגה בינונית עבור מזרק. ההליך דורש כ-50 µL קריסטל נושאת לאדן עבור כל הכנה. אלה יכולים להיות גדל ישירות LCP כמו עם bR9,10 משמש כאן, כדוגמה (איור 4), או שהוכנו באמצעות גבישים שגידלו ב אדי קונבנציונאלי דיפוזיה setups. מדריך וידאו מעולה התגבשות ישירות במרקים gastight ניתן למצוא ב- Ishchenko et al. (2016)37. עם bR, הקוטר אידיאלי של הלוחות גבישי הוא בסביבות 20 μm כמו פשרה טובה בין כוח עקיפה והפעלה הומוגנית על ידי לייזר משאבה. חלבון קריסטלים, שהוכנו באמצעות הפרוטוקולים כפי שהוסבר לעיל, שימשו לאיסוף נתונים TR-SFX-bR משאבת הפרוטונים אשר חשף את השינויים מרביים להתרחש לאחר פוטון ספיגה (איור 5).
לאחר הכנת הדוגמא באמצעות מחבר-כיוונית (איור 6AB), בדיקה ויזואלית של החומר מדגם במזרק מציג תמונות הומוגניות (איור 6CD), מיקרוסקופ דוגמת המדגם מעורבת, הן מזרק, בשקופית, באפשרותך לאשר את הצפיפות של הקריסטלים, מאפשר מדידות של קריסטל בגדלים הפצה גודל קריסטל, קריסטל צפיפות. המדגם הוא בשלב מעוקב שבהם אמצעי המשלוח אינו ברור (איור 7), צמיגה. תערובות עכורים אינדיקציה המדגם הנמצא ספוג שלב או שלב מחליפי, אבל הם לא חד משמעי כמו צפיפות גבוהה קריסטל עשוי לטשטש את הבהירות LCPs. מבחן קצר בלחץ נמוך כדי לזהות את השלב ספוג נוזלי יכול להתבצע על ידי משיכת הבוכנה מזרק מן המדגם בחלק האחורי של המזרק. שלב מחליפי ניתן לזהות בקלות דרך שבירה שלה כפולה עם מיקרוסקופ אור מקוטב. בדיקות אלה בשילוב עם בדיקת טרום ההבלטה הן בדרך כלל מספקות להצדיק את מבחן ב- מזרק.
שיעור החזרות גבוהים XFELs דורש מהירות הזרימה זה לא יכול להיות שנצפו בצורה הולמת עם מצלמות קצב מסגרות נמוך. לכן, אפיון הבלטה נעשית בעזרת מצלמה במהירות גבוהה (מצמידים עדשה בהגדלה) שיכולות לצלם צילומי הווידאו. נתוני וידאו הוא מהיר כי מסגרות נרשמים ב 1000 fps ולאחר זמן לשגות גם כי הסרטונים תוקלט 1 s כל 30 s. ערכת איסוף נתונים זו יאפשר איסוף נתונים במהלך הבחינה מדגם כולו (כ- 10 דקות) ללא יצירת קבצי וידאו דעי. אפילו עם ערכת נתונים מופחתת זו עדיין ייתכן מעל 50 GB בגודל, וידיאו. צריך לקחת כדי להבטיח אחסון נאותים זמין לשמירת נתוני וידאו לפני תחילת הבחינה.
במהלך הבדיקה סילון (איור 1), המדגם צריך הבלטת עמודה רציף ארוך (יותר מ-200 מיקרומטר) של LCP שזז במהירות כמעט קבוע (איור 2). דוגמאות הפועלות במצב נוטף לציין צמיגות מדגם הוא נמוך מדי (איור 2). דוגמאות יכולים לעתים קרובות להיות התאושש מעורבב עם monoolein או פרפין להסתגל צמיגות יותר. דוגמאות כי הטופס עמודה צריך להיבדק עם המצלמה במהירות גבוהה. נתוני ההקלטה צריך להראות כי ההבלטה נשאר מעל מהירות מינימליסטית שמכתיבה את הפרמטרים ניסיוני. מהירות ההבלטה נקבעת על ידי מדידת המרחק ליניארי שתכונה בזרם LCP נוסע על מספר מסגרות. Slow-downs שחול זה ניתן לייחס כפכפים חריגה צו שגוי. אם הם ימשיכו לטוס צריך להשתפר על ידי תוספים כמו פרפין, על-ידי הפחתת הצפיפות של קריסטלים, או על-ידי בחירת זרבובית של קוטר גדול יותר. גבישים שגידלו בדרך כלל לא במדיום צמיגה (למשל, אדי דיפוזיה) יכול להיות peletted על ידי צנטריפוגה, שולבו LCP או אחרים נושאות צמיגה. ראו דוגמאות, הקודם פרסומים24,25,26,27,29,30.
איור 1: הגדרת ספסל המצלמה במהירות גבוהה- תצלום של מלכודת benchtop טיפוסי עם החלקים עם התווית. הבמה שלושה צירים מספק גמישות מסגור ומיקוד התמונה. מזרק (מוצג עם זרבובית, מאגר מצורף) נטענה באופן אנכי, ישירות מול העדשה המטרה. התאורה בדוגמה זו מסופק על ידי אור סיב יחיד מאירה את הדגימה מהציר ומספק שדה בהיר על המסך. מדגם ולהזמין מואר בדרך זו מספקת תמונה דומה שיבוץ B. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: בדיקת המצלמה במהירות גבוהה וניתוח הנתונים. בתמונה לעיל הן שתי בדיקות ההבלטה LCP. מבחן A מציג bR קריסטלים LCP הבלטת ממד ב מצב נוטף המציין כי המדגם אינו ממוטב. בדיקת B מראה ההבלטה LCP ויוצרים עמודה רציפה של LCP שבו ניתן לעקוב קריסטלים, ניתן לחשב מהירות ההבלטה. בדוגמה זו, קריסטל משובצים בעמודה LCP (קוטר 50 מיקרומטר) נע מיקרומטר 301 8 מילי-שניות (37.6 מ מ/s). מוצגים בשתי ערכות נתונים של תכשירים שונים של גבישים bacteriorhodopsin LCP. נקודות נתונים ארבעה (או יותר) של כל שנייה של המצלמה במהירות גבוהה זמן לשגות וידאו (1 s של הקלטה בכל 30 s) שורטטו. מרווח גדול בין נקודות הנתונים שנלקחו יחיד תקופת איסוף הנתונים השני מצביעים על וריאציה מהירות לטווח קצר. בעוד ממוצע נע מעל סדרת הנתונים כולה מראה את תנודות יותר בזרם. סדרת העליון מתוך מדגם extruding לקוי (סיכוי גבוה עבור זיהום אור עם שתי פעימות לייזר משאבת ברציפות), הסדרה התחתונה היא מתוך מדגם לבצע בצורה אופטימלית. הקו המנוקד אופקי מציין את ערכת מהירות ההבלטה היעד באמצעות המשאבה HPLC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מדגם הכנת תרשים זרימה- הכנת הדוגמא מתחיל עם צפיפות גבוהה של חלבון קריסטלים נעוץ LCP. המדגם ואז מעורבב עם המעבר נמוכה טמפרטורת השומנים, פרפין, מוכן LCP עד המדגם מגיע לשלב מעוקב, עובר סדרה של בדיקות קטנות כדי לציין כי המדגם הבלטת ב מזרק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: גבישים Bacteriorhodopsin כמתחילה חומר. קריסטלים גדלים במזרקים גז חזק (א), עם LCP שקוע הפתרון precipitant. התגבשות ממוטב צפיפות גבוהה של קריסטלים עם התפלגות גודל יכול להיות צר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מבנה משתנה ב bacteriorhodopsin. TR-SFX מגלה שינויים אולטרה מהיר במבנה של bacteriorhodopsin משאבת פרוטונים. הנה בתמונה דגם של bR נגזר TR-SFX נתונים שהושגו מקריסטלים שהוכנו באמצעות פרוטוקולים המתוארים בעבודה זו. החלונית השמאלית מציגה את המודל עם תכונות מסומנות בכיס איגוד ברשתית. החלונית ' נכון ' מציג את השינויים הרשתית מ femtoseconds כדי אלפיות השניה. איור זה שוחזר מ Nogly et al. (2018)10 בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: מחבר משולשת. מחבר-כיוונית הוא מופחת נפח המלח Y מערבל תוכנן עבור תאימות עם מזרקים gastight. הדמיות תלת-ממד של מחבר, הצג תצוגה מורחבת של הרכבה (א), תצוגה שקוף מראה ערבוב ערוץ (ב). האיור מציג של התפלגות קריסטל inhomogeneous לאחר ערבוב עם מחבר רגיל (C), ההשעיה תוצאות לאחר ערבוב עם מחבר-כיוונית (D). ערבוב מושגת על ידי דוחף בערך כמחצית המדגם לתוך מזרק נוסף (E), ואז דוחף את שני החצאים לתוך המזרק הנותרים יחד כפי שהודגמה בעזרת החצים הכחולים (נ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: אינדיקטורים בדיקות טרום ההזרקה. במהלך הכנת הדוגמא, מספר בדיקות קטנות הם השתמשו כדי לציין שגודל המדגם הוא בשלב, שלמאחה צמיגה. בהירות אופטית היא סימן אחד כי המדגם יש סבירות גבוהה בשלב מעוקב. (א) דגימת עכורים מוצג במזרק. (ב) מדגם ברור מוצג, שים לב הקווים הסיום גלוי דרך הדגימה למרות הצפיפות גבוהה של מיקרו קריסטלים. כאשר המטריצה השומנים בשלב מעוקב, זה נשאר מוצק דמוי כאשר תחת אין לחץ. מבחן בלחץ נמוך מבוצעת על ידי משיכת המזרק לההגיע לאחור של המדגם. כאשר המדגם הוא גם נוזל דמוי (מרמז על השלב ספוג) הדגימה מתרחבת כדי למלא את עוצמת הקול (C). בתוצאה חיובית של הבדיקה אותו (ד), המדגם נשאר סטטי למרות הבוכנה מופנמים. לבסוף, מבחן ההבלטה של מאקרו סרגל מתבצעת על ידי לחיצה על כמות קטנה של דגימה באמצעות מחבר מזרק. Droplet ויוצרים את הטיפ זרבובית (E) או צילינדר במהירות כיפוף של LCP מציין מדגם שאינו מספיק צמיגה. אם הדגימה extrudes, צורות גליל, אשר נשאר זקוף לאורך זמן (נ), ולאחר מכן המדגם עשוי לקדם לניסויים המצלמה במהירות גבוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת TR-SFX עם מזרק ההבלטה צמיגה הוכיחה להיות טכניקה מעשית ללימודי dynamics מבנית של bacteriorhodopsin9,10 ו- photosystem II13 , עכשיו נראה מוכן ללמוד חלבונים נהיגה השני תהליכים ביולוגיים תמונה כגון מונחי-אור יון תחבורה או חושית5,50. הפרוטוקולים שתוארו לעיל נועדו למקסם את ההצלחה של TR-SFX איסוף נתונים על bacteriorhodopsin, אך אנו מאמינים יכול לשמש כתבנית כדי למטב את איסוף הנתונים על דגימות אחרות. בדרך זו, הרבה beamtime היקר כרגע איבד בגלל סתימת או ההבלטה מדגם המסכן יכול לשמש במקום לאסוף נתונים טוב יותר עיכובים זמן נוסף.
השלב הכי קשה, קריטי בפרוטוקול הוא התוספת של כמויות קטנות של monoolein המביאה המטריקס השומנים לשלב מעוקב (שלב 1.8). הקושי טמון בדקויות של שלב המעבר ואת ההשפעה השלילית על הדגימה כשנוספת monoolein עודף.
שינויים המתודולוגיה לישם כדי להכיל את גבישי חלבונים שונים. אלה לא עשוי להיות תואם עם התוסף אותו או את הסכום או ערבוב נדרש. מצד שני, שבירת קריסטלים לחתיכות קטנות יותר במהלך תהליך ערבוב אולי לא מתפשרים באיכות עקיפה ולשפר את יכולה אפילו לטוס למשל כאשר מחטים ארוכות לפרוץ קטעים קצרים יותר. תוספים שונים יכול שיוחלפו במקום פרפין, שמתווסף כדי לשפר את יציבות מהירות זרימה9. מג 7.9/9.7 נוסף כדי למנוע את trasnistion לשלב מחליפי שעלולות להתרחש בעת הזרקת לתוך ואקום סביבות20 (כמו endstation CXI-LCLS), אבל יכול להיות מושמט אם הניסוי נעשה בלחץ אטמוספרי. מניסיוננו, קריסטלים רבים של חלבונים מסיסים שניתן stably לשלב LCP, ובכל זאת באופן אירוני משהו חלבון ממברנלי קריסטלים לא ישירות גדל lipidic mesophases לעיתים קרובות מתמוסס ככל הנראה בגלל חומרי ניקוי המחולצים הקריסטל לתוך הסביבה השומנים כמו הסובבים אותם. במקרים כאלה, זה צריך להישפט לגמרי להחליף LCP מנשא חלופי צמיגה24,25,26,27,29,30.
שינויים כדי לבדוק את המצלמה במהירות גבוהה יכולים להכיל דוגמיות איפה הקריסטלים אינם גלויים בתוך המנשא. לדוגמה, ניתן להגדיר תאורה להקליט וידאו באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב. זה יגרום גבישים birefringent להופיע (זוהר), גם חושף חלקים של המטריקס השומנים הנמצאים בשלב מחליפי birefringent.
שינויים הצידה, זה קריטי כי הכנת קריסטל חלבון לפגוש כמה שיותר הקריטריונים הבאים. הקריסטלים צריך להיות בגודל אופטימלי כדי למקסם עקיפה תוך מזעור מזרק סתימת. צפיפות קריסטל צריך להיות גבוה מספיק להניב להיט-שיעור מספיק כדי לאסוף את הנתונים סטים, אבל לא כל כך צפופה כדי לסכן את יציבות סילון (בדרך כלל יכולים להיות מדולל; צפיפות גבוהה מדי. במקרה של bR, התאמת קצב כניסות של 10-30% בדרך כלל וכל יח טוב). המטריקס השומנים טיכסו לשלב מעוקב, ההשעיה קריסטל צריכה להיות הומוגנית.
TR-SFX מחזיקה יתרונות חשובים על טכניקות אחרות קריסטלוגרפיה זמן לפתור כמו עקיפה לאווה כי: ניזקי קרינה מוגבלת בשל המתודולוגיה "עקיפה לפני החורבן", TR-SFX בעלת רזולוציה זמן רחב על הזמנות רבות של גודל עד הטווח הפמטו-שנייה, גבישים קטנים לאפשר photoactivation טוב יותר, photocycles של עניין לא צריך להיות הפיך.
TR-SFX-XFEL באמצעות על מזרק צמיגות גבוהה יש יתרונות רבים על פני מזרק סילון נוזלי מבחינת החיסכון הדגימה. ישירות השוואת PYP6 ו bR10, לדוגמה, מצביע על ירידה על ידי הגורם של 50 עבור אותה כמות של תמונות דיפרקציה שנאספו. מטוסי סילון נוזלי לעומת יש יתרון בכך הזרימה מהירה ומופעל, איסוף נתונים במהירות מלאה (לסירוגין מסגרות הכהים), ללא קשר מזרק זרם מהירות יציבות (או זיהום אור במסגרות כהה). בעוד המטוס צמיגה להוסיף אתגרים חדשים, זה שווה לשקול כי סילון נוזלי TR-SFX משתמשת בכמות החלבון שייתכן בהחלט סבירה לייצר עבור מערכות רבות רלוונטי מבחינה ביולוגית.
כיום, דגימה צמיגה הכנה TR-SFX מוגבל על ידי קריסטל תאימות עם המדיום משלוח. אמנם היו מספר נשאים צמיגה חלופי מיושם, לא נמצאו לעבודה בכל המקרים. בנוסף, משלוח הדגימה עם מזרק צמיגות גבוהה תמיד יהיה סתימת, או מאט אפילו עם optomozation באמצעות פרוטוקול זה. הגבלה נוספת של הטכניקה היא צמצום הטבועה אחוזי ההצלחה כאשר דילול לדוגמה כדי להביא extrudability optomised.
בעתיד, ניתן להאריך TR-SFX שיטות של חלבון מטרות עם טבעי הן לאלה עם photoswitches סינתטי. מדידות זמן לפתור על תגובות שלא ניתן photoactivated חייבת להסתמך על ערבוב, טמפרטורה-לקפוץ, שדות חשמליים או טכנולוגיות אחרות ההפעלה צריך עדיין להיות מותאם קריסטלוגרפיה טורי. שילוב של טכנולוגיות אלה מפעילה יחד עם זמינות מוגברת של XFEL beamtime ויל, לאורך זמן, להניח את היסודות כדי להבין את הדינמיקה מבנית של וחלבון לתפקד ברמה האטומית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין אינטרסים סותרים.
Acknowledgments
אנו להכיר Gebhard Schertler, רפאל אבלה, כריס מילן לתמיכה השימוש צמיגות גבוהה מרססים בבית PSI. ריצ'רד Neutze והצוות שלו הם הכירו לדיונים על זמן לפתור קריסטלוגרפיה ומשלוח הדגימה באמצעות מרססים צמיגות גבוהה. עבור תמיכה כספית, אנו להכיר הקרן השוויצרית הלאומית למדע עבור מענקים 31003A_141235, 31003A_159558 (ל. י. ס), PZ00P3_174169 (כדי P.N.). הפרויקט זכה למימון המחקר של האיחוד האירופי אופק 2020 ותוכנית חדשנות תחת המענק מארי-Sklodowska-קירי הסכם לא 701646.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
References
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
- Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
- Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
- Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
- Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
- Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
- Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
- Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
- Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
- Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
- Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
- Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
- Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309 (2014).
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
- Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703 (2017).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
- Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484 (2016).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
- Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
- Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
- Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621 (2014).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
- Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292 (2016).
- Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
- Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
- Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585 (2017).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
- Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602 (2017).
- Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
- James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).
