Suksessen til en tid-løst føljetong femtosecond krystallografi eksperiment er avhengig for effektiv utvalg levering. Her beskriver vi for å optimalisere byggesystemer i bacteriorhodopsin microcrystals fra en høy viskositet mikro-ekstrudering injektor. Metodene er avhengig av prøven homogenisering med romanen treveis coupler og visualisering med et høyhastighets kamera.
Høy viskositet mikro-ekstrudering sprøytebrukere har dramatisk redusert eksempel forbruk føljetong femtosecond krystallografisk eksperimenter (SFX) på X-ray gratis elektron lasere (XFELs). En rekke eksperimenter med lys-drevet proton pumpen bacteriorhodopsin har videre etablerte disse sprøytebrukere som foretrukket alternativ å levere krystaller for tid-løst føljetong femtosecond krystallografi (TR-SFX) å løse strukturelle endringer av proteiner etter photoactivation. For å få flere strukturelle øyeblikksbilder av høy kvalitet, er det viktig å samle inn store mengder data og sikre Lagersalg krystaller mellom hver pumpe laser puls. Her beskrive vi i detalj hvordan vi optimalisert byggesystemer i bacteriorhodopsin microcrystals for våre siste TR-SFX eksperimenter på Linac sammenhengende lys kilde (LCLS). Målet med metoden er å optimalisere ekstrudering for en stabil og kontinuerlig flyt samtidig opprettholde en høy tetthet av krystaller til å øke hastigheten på hvilke data kan samles i en TR-SFX eksperimentere. Vi oppnå dette målet ved å forberede lipidic kubikk fase med en homogen fordeling av krystaller bruker en roman treveis sprøyte kopling enheten etterfulgt av justere eksempel sammensetningen basert på målinger for ekstrudering stabilitet tatt med en rask kamerainnstillingene. Metodikken kan tilpasses å optimalisere flyten av andre microcrystals. Oppsettet vil være tilgjengelig for brukere av nye sveitsiske gratis elektron Laser.
Føljetong femtosecond krystallografi (SFX) er en strukturell biologi teknikk som utnytter de unike egenskapene til X-ray gratis elektron lasere (XFEL) til å fastslå romtemperatur strukturer fra tusenvis av mikrometer store krystaller mens outrunning de fleste av stråling skader ved “Diffraksjon før ødeleggelsen” prinsippet1,2,3.
I en tid-løst forlengelse av SFX (TR-SFX) brukes femtosecond pulser fra XFEL å studere strukturelle endringer i proteiner4,5. Protein rundt aktiveres med en optisk laser (eller en annen aktivitet utløser) like før blir skutt av XFEL i en pumpe-sonden oppsett. Ved å kontrollere nøyaktig forsinkelsen mellom pumpe og sonde pulser, kan målet protein fanges i forskjellige stater. Molekylær filmer av strukturelle endringer over elleve størrelsesordener tid viser kraften i de nye XFEL kildene å studere dynamikken i flere protein mål6,7,8,9, 10,11,12,13. Prinsipielt blir metoden dynamisk spektroskopiske og statisk strukturelle teknikker til én, gir et glimt inn protein dynamics på nær Atom løsning.
Enkle systemer for TR-SFX kan inneholde en endogen utløser av aktivisering med et foto-sensitive komponent som retinal i bacteriorhodopsin (bR)9,10, chromophores i photosystem II12,13, fotoaktive gul protein (PYP)6,7 reversibel photoswitchable fluorescerende protein11, eller en photolyzable karbonmonoksid i myoglobin8. Spennende varianter av teknikken fortsatt i utvikling avhengige blanding og injisere ordninger14,15 for å studere enzymatiske reaksjoner eller et elektrisk felt brukt til å indusere strukturendringer16. Gitt at XFEL kilder har bare vært tilgjengelig i noen år og ekstrapolere tidligere suksesser i fremtiden, metoden viser potensial som en ekte spill-veksler med hensyn til vår forståelse av hvordan proteiner-funksjonen.
Fordi biologiske prøver er ødelagt av en enkelt eksponering til en høy effekt XFEL puls, var nye tilnærminger til protein krystallografi nødvendig. Blant disse prosedyrene, muligheten til å vokse store mengder uniform microcrystals måtte være utviklet17,18,19. For å aktivere datainnsamling på en XFEL, må disse krystallene leveres, forkastet, og deretter fornyes for hver XFEL puls. Gitt at XFELs brann brukbare pulser på 10-120 Hz, må prøve levering være rask, stabile og pålitelig, samtidig holde krystallene intakt og begrensende. Blant de mest vellykkede løsningene er en høy viskositet mikro-ekstrudering injektor, som leverer en fabrikkindustrien stadig streaming kolonnen romtemperatur krystall-laden lipidic kubikk fase (LCP) over den pulserende røntgenbilde stråle20. Tilfeldig orientert krystaller, innebygd i LCP strømmen, som er fanget opp av XFEL pulser scatter røntgen på en detektor der et Diffraksjon mønster er lagret. LCP var et naturlig valg for et eksempel levering medium som den brukes ofte som vekst medium for membran protein krystaller17,21,22,23, ennå andre høy viskositet carrier medier 24,25,26,27,28,29,30 og løselig proteiner31 har også vært brukt i injektoren. SFX med høy viskositet injektoren har vært vellykket i strukturen fastsettelse av membran proteiner13,32 inkludert G protein-kombinert reseptorer (GPCRs)33,34, 35,36,37, med kvalitet tilstrekkelig for native innfasing38,39 samtidig både tid og prøve effektiv. Foreløpig disse sprøytebrukere blir brukt mer rutinemessig for rom temperaturmålinger på synchrotron kilder28,30,40,41 og mer teknisk krevende TR-SFX eksperimenter på XFELs9,10,13,42.
Sammenlignbare TR-SFX eksperimenter har blitt utført ved hjelp av andre injektor typer som flytende fase levering i en fokusert munnstykke6,7,12, men denne metoden krever protein beløp ikke tilgjengelig for mange biologisk interessant mål. For bestemmelse av statiske strukturer bruker tyktflytende ekstrudering en gjennomsnittlig forbruk av 0.072 mg protein per 10 000 indekserte Diffraksjon mønstre i forhold til 9.35 mg for flytende jet er dyser rapportert (dvs. ca 130 ganger mer utvalg effektiv)20. Høy viskositet injektoren har vist seg å være en levedyktig eksempel levering enhet for TR-SFX mens bare å ofre noen av denne prøven effektivitet43. I Nogly et al. (2018)10, for eksempel eksempel forbruk var ca 1.5 mg per 10 000 indekserte mønstre, som sammenligner gunstig til lignende TR-SFX eksperimenter med PYP hvor gjennomsnittlig eksempel forbruk var mye høyere med 74 mg protein per 10 000 indekserte mønstre6. Høy viskositet sprøytebrukere har dermed klare fordeler når mengden av protein tilgjengelig begrenser eller krystaller dyrkes i LCP.
For TR-SFX med høy viskositet sprøytebrukere å gi den mest pålitelige data flere tekniske problemer må tas: siden strømmen fart må være over en minimumsverdi for kritiske; hit-prisen bør opprettholdes på et nivå som ikke gjengir datainnsamling langsom (f.eks større enn 5%); og utvalget har leveres uten overdreven avbrudd. Ideelt disse betingelsene oppfylles allerede lenge før en planlagt TR-SFX eksperiment bruke tilgjengelig XFEL gang så effektivt som mulig. Pricipally, en nedgang i LCP strømmen kan sondering krystaller som er aktivert med flere optiske laser puls og resultere i blandet aktive stater eller sondering pumpet materiale når umpumped materiale forventes i strålen. En ekstra fordel av injeksjon pre-tester er at nedetid under datainnsamlingen på en XFEL er minimert som henvist å erstatte dysene, endring ut ikke-ekstrudering prøvene, og andre vedlikeholdsoppgaver reduseres.
Her presenterer vi en metode for å optimalisere eksempel levering for TR-SFX datainnsamling med en høy viskositet mikro-ekstrudering injektor. For enkelhet stole metodene beskrevet ikke på tilgang til en X-ray kilde, selv om arbeid på en synchrotron beamline29 vil gi ytterligere informasjon om forventet hit priser og krystall Diffraksjon. Våre protokoller ble utviklet for å optimalisere eksperimenter for å fange retinal isomerization i proton pumpe bacteriorhodopsin10 og er gjennomført i to faser med krystall prøvene forberedte ekstrudering etterfulgt av overvåking byggesystemer ved hjelp av et høyhastighets kamera oppsett. I fase en blandes krystall-laden LCP med ekstra LCP, lav overgang temperatur lipider eller andre tilsetningsstoffer å sikre den endelige blandingen er egnet for levering i prøven miljøet uten tilstopping eller bremse. En ny tre-veis sprøyte coupler ble utviklet for å forbedre miksing ytelse og prøve homogenitet. Den andre fasen består av en ekstrudering test av et høyhastighets kamera direkte måle ekstrudering hastighet stabiliteten. Etter analyse av videodata, justeringer kan gjøres for eksempel forberedelse protokollen å forbedre eksperimentelle resultater. Disse prosedyrene kan tilpasses for å forberede andre proteiner TR-SFX datainnsamling, med minimal modifikasjoner, og vil bidra til effektiv bruk av begrenset XFEL beamtime. Med nye XFEL fasiliteter bare starte sin drift44,45 og overføring av injektor-baserte serielle data samling metoder til synchrotrons28,30,40,41 , de neste årene vil sikkert fortsette å tilby spennende ny innsikt i strukturelle dynamikken i et stadig bredere utvalg av protein mål.
TR-SFX metoden med tyktflytende ekstrudering injektoren har vist seg for å være en levedyktig teknikk for strukturelle dynamics studier av bacteriorhodopsin9,10 og photosystem II13 og nå synes klar til å studere proteiner kjører andre Foto biologiske prosesser som lys-drevet ion transport eller sensorisk persepsjon5,50. Protokollene beskrevet ovenfor ble utformet for å maksim…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner Gebhard Schertler, Rafael Abela og Chris Milne for å støtte bruk av høy viskositet sprøytebrukere på PSI. Richard Neutze og hans team er anerkjent for diskusjoner om tid-løst krystallografi og prøve levering med høy viskositet sprøytebrukere. For finansiell støtte, vi erkjenner Swiss National Science Foundation for stipend 31003A_141235, 31003A_159558 (til js) og PZ00P3_174169 (til P.N.). Dette prosjektet har mottatt finansiering fra EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet under Marie-Sklodowska-Curie stipendet avtalen ingen 701646.
Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |