Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Улучшение экструзии высокой вязкости микрокристаллов для времени решены серийный Фемтосекундный кристаллографии в рентгеновских лазеров

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/59087
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 3,4, 3,4, 1,5, 1
1Division of Biology and Chemistry - Laboratory for Biomolecular Research, Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division - SwissFEL, Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Department of Biology, ETH Zürich

Summary

Успех эксперимента кристаллографии времени решены серийный Фемтосекундный зависит от эффективного образца доставки. Здесь мы описываем протоколы для оптимизации экструзионных бактериородопсин микрокристаллов от инжектора микро экструзии высокой вязкости. Методология опирается на пример гомогенизации с Роман трехходовой стяжки и визуализации с помощью высокоскоростной камеры.

Abstract

Высокой вязкости микро экструзии инжекторы резко сократили потребление образца в серийный Фемтосекундный кристаллографических экспериментов (SFX) на свободных электронах рентгеновских лазеров (XFELs). Далее ряд экспериментов с использованием света driven протонного насоса бактериородопсин создали эти форсунки в качестве предпочтительного варианта доставить кристаллы для кристаллографии (TR-SFX) время решена серийный Фемтосекундный решить структурные изменения белки, после photoactivation. Чтобы получить несколько структурных снимки высокого качества, важно для сбора больших объемов данных и обеспечить Распродажа кристаллов между каждый насос лазерного импульса. Здесь мы подробно описать, как мы оптимизировали экструзии бактериородопсин микрокристаллов для нашей недавно TR-SFX экспериментов в Linac последовательной источник света (ССК). Цель метода – оптимизировать экструзии для стабильного и непрерывного потока при сохранении высокой плотности кристаллов для увеличения скорости на которых данные могут быть собраны в TR-SFX эксперимент. Мы достичь этой цели путем подготовки липидный кубической фазы с равномерное распределение кристаллов с помощью Роман трехходовой шприца сцепного устройства, затем регулируя состав образец, основанный на инструментальных замерах стабильности экструзии, с высокоскоростной установки камеры. Методология может быть адаптирована для оптимизации потока микрокристаллов других. Установка будет доступна для пользователей данного объекта Новый швейцарский бесплатно электронах.

Introduction

Серийный Фемтосекундный кристаллографии (SFX) является структурной биологии техника, которая использует уникальные свойства свободных электронах рентгеновских лазеров (XFEL) для определения структуры комнатной температуре от тысячи микрометра размера кристаллов при опережающего большую часть излучения ущерб «дифракционный до разрушения» принцип1,2,3.

В времени решены расширение SFX (TR-SFX) фемтосекундных импульсов от XFEL используются для изучения структурных изменений в белки4,5. Протеин интереса активируется с оптического излучения (или другого действия триггера) накануне расстрела XFEL в установки насоса зонд. Точно управляя задержку между насоса и датчика импульсов, целевого белка могут быть захвачены в разных государствах. Молекулярные фильмы структурных изменений за одиннадцать порядков в время продемонстрировать мощь новых источников XFEL для изучения динамики нескольких белка цели6,,78,9, 10,11,12,13. Главным образом метод присоединяется к динамической спектроскопические и статические структурные методы в одну, обеспечивая мельком динамики белков в вблизи атомных резолюции.

Простые системы для TR-SFX может содержать эндогенного триггера активации с фото чувствительных компонентов, как сетчатки в бактериородопсин (bR)9,10, хромофоры фотосистемы II12,13, фотоактивного желтый белка (Рур)6,7 обратимо фотопереключаемых флуоресцентный белок11, или окиси углерода photolyzable в миоглобина8. Захватывающие вариации техника все еще в развитии полагаться на смеси и внедрить схемы14,15 для изучения ферментативных реакций или электрического поля используется, чтобы вызвать структурные изменения16. Учитывая, что XFEL источники были доступны лишь на несколько лет и экстраполяции прошлых успехов в будущем, метод показывает потенциал как реальная игра чейнджер в отношении нашего понимания того, как функция белков.

Поскольку биологические образцы уничтожаются путем одного контакта с высокой мощности XFEL пульс, необходимы новые подходы к кристаллография протеина. Среди этих процедур способность расти большое количество единообразных микрокристаллов необходимо развитых17,18,19. Чтобы включить сбор данных на XFEL, эти кристаллы должны доставлено, отбрасываются и затем вновь для каждого импульса XFEL. Учитывая, что XFELs огонь полезная импульсов на 10-120 Гц, поставки образца должны быть быстрой, стабильной и надежной, сохраняя также кристаллы нетронутыми и ограничения потребления. Среди наиболее успешных решений — инжектор микро экструзии высокой вязкости, который обеспечивает непрестанно потокового столбца комнатной температуре кристалл Ладена липидный кубической фазы (LCP) через импульсного рентгеновского луча20. Случайным образом ориентированных кристаллах, внедренной в поток LCP, которые перехватываются XFEL импульсов точечных рентгеновских лучей на детектор, где записывается дифракционный рисунок. LCP был естественным выбором для доставки средних образца, как часто используется как средство роста для мембранных белков кристаллы17,21,22,23, еще других высоковязких перевозчик СМИ 24,25,26,27,28,,2930 и31 растворимые белки также были использованы в инжектор. Во время определения структуры мембранных белков13,32 G белка-рецепторы (GPCR)33,34, в том числе успешно SFX с высокой вязкостью инжектор 35,,3637, с качеством данных, достаточных для родной фазирования38,39 во время как время, так и примеры эффективной. В настоящее время, эти форсунки более регулярно используются для измерения комнатной температуры в синхротрона источников28,30,40,41 , а также в ходе более технически требуя TR-SFX эксперименты в XFELs9,10,13,42.

Сопоставимых TR-SFX эксперименты проводились с использованием других типов инжектор как жидкой фазы доставки в потоке сосредоточены сопла6,7,12, однако, этот метод требует белка суммы не доступны для многих биологически интересных задач. Для определения статического структур с использованием вязких экструзии среднее потребление 0,072 мг белка на 10000 индексированных дифракционные текстуры по сравнению с 9.35 mg для Жидкоструйный насадки были зарегистрированы (то есть, около 130 раз больше образца эффективное)20. Высокая вязкость инжектор было показано, быть жизнеспособными образца доставки устройство для TR-SFX пока только жертвуя некоторые из этого образца эффективности43. В Ногли et al. (2018)10, например, образец потребления был около 1,5 мг на 10000 индексированных шаблонов, который выгодно отличается от аналогичных TR-SFX экспериментов с использованием PYP, где потребление среднего образца была значительно выше, с 74 мг белка на 10 000 индексированные моделей6. Высокая вязкость инжекторов таким образом имеют явные преимущества при ограничении количества белка доступны или когда кристаллы выращивают непосредственно в LCP.

Для TR-SFX с использованием высокой вязкости Инжекторы для получения наиболее достоверных данных несколько технических вопросов необходимо решать: скорость потока должна оставаться выше минимального критического значения; хит ставка должна поддерживаться на уровне, который не отображают медленно сбора данных (например, более чем на 5%); и образец должен быть доставлен без чрезмерных потрясений. В идеале, уже выполнены эти условия задолго до запланированного TR-SFX эксперимент, чтобы максимально эффективно использовать имеющееся время XFEL. Pricipally, замедление в потоке LCP может позволить зондирующего кристаллов, которые были активированы с более чем одной оптической лазерного импульса и результат в смешанных активных государств, или зондирования перекачиваемого материала, когда материал umpumped ожидается в пучке. Дополнительное преимущество инъекций предварительного тестирования, что время простоя во время сбора данных на XFEL свернуто как время отводится для замены засоренные сопла, изменения не прессовать образцы, и другие задачи обслуживания уменьшается.

Здесь мы представляем способ оптимизировать поставки образца для TR-SFX сбора данных с высокой вязкостью микро экструзии инжектор. Для простоты описанных методов не полагайтесь на доступ к источнику рентген, хотя работа Синхротронное излучение29 представит дополнительную информацию на ожидаемые хит ставки и кристалл дифракции. Наши протоколы были разработаны для оптимизации эксперименты для захвата сетчатки изомеризации в Протон насос бактериородопсин10 и осуществляется в два этапа, начиная с подготовки образцов кристалл для экструзии, следуют контроля экструзии с помощью высокоскоростной камеры установки. На первом этапе кристалл Ладена LCP смешивается с дополнительные LCP, низкой перехода температуры липиды или другие добавки, чтобы убедиться, что окончательный смесь подходит для доставки в демонстрационной среде без забивания или замедления. Новый шприц трехходовой стяжку был разработан для улучшить однородность смешивания производительности и образца. Второй этап состоит из теста экструзии, записанная с помощью высокоскоростной камеры непосредственно измерить стабильность скорости экструзии. После анализа видео данных можно внести изменения протокола Подготовка образца для улучшения экспериментальных результатов. Эти процедуры могут быть адаптированы для подготовки других белков TR-SFX сбора данных, с минимальными изменениями и будет способствовать эффективному использованию ограниченных XFEL beamtime. С новой XFEL зал просто начиная44,их эксплуатации45 и передачи последовательных данных, основанных на инжектор методов сбора synchrotrons28,30,40,41 , в ближайшие несколько лет несомненно будет продолжать оказывать захватывающее новое понимание структурной динамики все более широкий спектр белковых мишеней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. белки кристалл пробоподготовки

  1. Около 30 минут, прежде чем образец должен быть введен, нагрузка 50 мкл кристалл Ладена monoolein на основе LCP в 100 мкл шприца.
  2. Для инъекций при атмосферном давлении: нагрузки 10 мкл жидкий парафин в задней части второго шприца. Держа шприц вертикально, высылать пузырьков воздуха из шприца.
    1. Для инъекций в вакуумной среде: нагрузка 5 мкл MAG 7,9 и 5 мкл жидкий парафин в задней части второго шприца. Держа шприц вертикально, высылать пузырьков воздуха из шприца.
  3. Подключите шприц с парафином/MAG 7.9 в стяжкой Стандартный шприц, очищать воздух от стяжку, осторожно нажимая на поршень до небольшой объем (< 1 мкл) парафин/липидов виден на кончике иглы стяжку.
  4. Соединить образца шприц шприц стяжку, заботясь, чтобы не вводить каких-либо воздуха в выборку. Смесь липидов/парафин, передав образец материала через стяжка несколько раз.
  5. Загрузите 20 мкл готовые LCP (27% PEG, 100 мм Соренсен рН 5,6 + MO) в другой шприц 100 мкл. Удаление пузырьков воздуха при необходимости.
  6. Удалите пустой шприц из стяжку и придаем готовые LCP кристалл, содержащие шприц, используя стандартный шприц стяжку. Передайте образец в стяжкой 100 раз.
    Примечание: Образец смешивания может нагреть образца слегка46. Смешивание должно осуществляться медленными темпами где температура образца могут быть проведены достаточно постоянным.
  7. Проверьте образец для прозрачности против источника света. Если сформировалась четко однородной LCP, перейдите к шагу 1.9.
  8. Для приведения примера в кубической фазы, 3 мкл monoolein и смешать 50 раз (как описано выше). Повторите эту процедуру, только до тех пор, пока прозрачной фаза сформировала избежать избытка monoolein.
    Примечание: Формирование LCP температуры зависит от47 и наилучшие результаты достигаются чуть выше 20 ° C. Количество дополнительных monoolein необходимо будет зависеть от объема остаточного осадителя раствора, перенесенных из кристаллизации.
  9. Как предварительный тест для образца жесткость (как ожидалось от LCP фазу) и выдавить способности, отсоедините пустой шприц из шприца стяжку и, держа шприц вертикально, выдавить небольшое количество образца (< 2 мкл) через стяжку. Если экструдированные образца образует вертикальный цилиндр, образец готов для тестирования экструзии.
  10. Отрегулируйте общий объем выборки 100 мкл, добавив более готовые LCP (как в шаге 1.5).
  11. Придаем образца шприц и две пустые шприцы трехходовой шприц стяжку (очистка воздуха от стяжки как раньше). Смешайте по крайней мере 50 раз (или до однородной) путем передачи половины образца в втором шприц и затем нажав обе половинки образца в третьем шприц одновременно.
  12. Поместите шприц, содержащего смешанный образец под микроскопом стерео для проверки равномерное распределение кристаллов.

2. Тестирование образца экструзии с помощью высокоскоростной камеры установки

  1. Определение экспериментальных параметров.
    1. Выберите размер сопла для теста.
      Примечание: Размеры сопла, как правило, 50 или 75 мкм внутренний диаметр (ID), но любой размер примерно 30-100 мкм, что ID могут быть рассмотрены. Выбор основан на баланс между среднее время засорения, фон рассеяния, образец потребления и хит скорость.
    2. Расчет оптимального потока скорость на основе размера экспериментальных лазерного пятна (диаметр2 1/e) и схема сбора данных (например, чередующиеся светлые и темные) который будет использоваться в XFEL.
    3. Вычислить требуемый расход (Equation 1) образца от оптимального потока скорость (Equation 2) и выбранную насадку диаметром (Equation 3):
      Equation 4
      Определить скорость потока (Equation 5), должны быть введены в насос ВЭЖХ, основанный на коэффициент усиления (Equation 6) инжектора.
      Equation 7
      Вычислить максимальное давление (Equation 8) от номинального давления сопла фитинги (Equation 9) и коэффициент усиления инжектора (Equation 10):
      Equation 11
  2. Установка высокой вязкости экструзии инжектор для автономного использования, как показано на рисунке 1.
    Примечание: Инжектор функции с помощью гидравлические экструзионные руководствовался ВЭЖХ насос и используется совместно течет оболочка газ гелий контролируется регулятором газа. Насос и регулятор установки не обсуждаются в настоящем Протоколе. Смотрите главу 4 в Джеймс (2015)48 для подробного руководства.
    1. Очистить насос и все линии воды обеспечить подачу точны. Очистите стадии гидравлические форсунки.
    2. Смонтируйте инжектор (или камера) на сцене три оси для облегчения разработки и фокус для высокоскоростной видео. Оставьте пространство вокруг точки инъекции для объектива, освещение, Светоотражающий экран и небольшой стакан поймать отработанного образца.
    3. Строить «Макетные сопла» (пустой резервуар с насадкой прилагается) и установить его на инжектор для облегчения позиционирования, фокус и освещение.
    4. Подключите высокоскоростной камеры с кончик насадки вблизи координационным центром цели.
    5. Расположите Светоотражающий экран позади форсунки и отрегулировать освещение для фронт свет сопла.
    6. Включите и подсоедините к камере с помощью прилагаемого программного обеспечения. С живой видео работает для визуальной обратной связи расположите кончик насадки в центре кадра и привести его в фокус с этапа 3 оси.
    7. Отрегулируйте освещение до сопла отчетливо видна и фон равномерно освещенные.
  3. Настройка камеры записывать высокоскоростной покадровой видео.
    1. Набор кадров до 1000 fps. Установите разрешение 512 x 512 пикселей.
    2. С временем экспозиции, теперь установленные частоты кадров, отрегулируйте уровень освещенности до сопла является видимым (то есть, не под- или переэкспонированных). Переместите кончик насадки, чтобы он центрируется слева направо и расположен в верхней трети кадра.
    3. Запуск любой фон коррекции или баланс белого операций.
    4. Установка камеры в режиме покадровой. Установить интервал для 30 s и повторяется до 40 раз, установите режим триггера для случайных (или случайного сброса) и введите количество кадров для записи до 1000.
  4. Загрузить резервуар с 20 мкл испытуемого образца и Прикрепите насадку капилляров.
  5. Прикрепите заполненный резервуар на форсунку. Прикрепите газопровода к порту на насадку и начать газового потока.
  6. Вручную заранее поршень, открыв клапан в строку и нажав шприца. Закройте клапан, когда поршень делает твердых контакт с образцом в водохранилище.
  7. Программа насос с вычисляемые и установите максимальное давление рассчитанное значение (см. шаг 2.1.3).
  8. Одновременно запустите насос и записи камеры.
  9. Как выдавливание начинается, отрегулируйте давление газа для повышения стабильности. Увеличение давления газа, если жидкость образуется падение на кончике сопла вместо столбца. Снижение давления при экструзии нарушается из-за чрезмерного сдвига от газового потока, или быстро осциллируя (взбивания).
  10. Контролировать экструзии (10 мин, как правило, достаточно, чтобы признать условие однородный поток) и, когда давление насоса резко сползает вблизи ожидаемого окончания времени, остановить запись, выключите насос, вентиляционные системы давления, открыв предохранительный клапан.
  11. Анализ видео файлов
    Примечание: Образец экструзии, которая является явно неадекватным не требует подробного анализа. Однако это все еще полезно для определения режима сбоя, чтобы образец может быть оптимизирован.
    1. Откройте видео файл с программного обеспечения для анализа (например, Фиджи49) и калибровки средств измерения.
    2. Калибровку измерений, выбрав линию известной длины видео изображения с помощью инструмента выделения строки. Откройте окно Задать масштаб через анализ | Задать масштаб и введите известные расстояние и единицы измерения.
      Примечание: Известный диаметр сопла обеспечивает адекватные калибровки длину для этих измерений.
    3. Искать кадр в видео где есть функция отслеживаются видимым (например, кристалл) экструзии. Запишите номер кадра.
    4. Заранее видео в кадр, где же функция видна, но переехал со своей позиции на предыдущем шаге. Запишите номер кадра.
    5. Используя средство измерения прямой линии, измерьте расстояние от функция начальную и конечную точку через анализ | Мера.
      Примечание: Больше отслеживаются расстояние меньше ошибок в измерении будет влиять на расчеты
    6. Вычислить скорость струи от измеренного расстояния и время, затраченное (количество затраченного кадров, разделенных кадров).
    7. Повторите шаги 2.11.3-2.11.6 несколько раз для каждого сегмента видео.
    8. Построение рядов данных, как показано на рисунке 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Высокой плотности микрокристаллов, включены в вязкой перевозчика среднего для инжектора идеальным исходным материалом для выполнения процедур, описанных здесь (рис. 3). Процедура требует около 50 мкл кристалл Ладена перевозчика для каждого приготовления. Эти могут быть выращены непосредственно в LCP как с bR9,10 используется здесь в качестве примера (рис. 4), или подготовленные с использованием кристаллов, выращенных в обычных пар диффузии установок. Отличное видео руководство для кристаллизации непосредственно в герметичные шприцы можно найти в Ищенко et al. (2016)37. С bR идеальный диаметр кристаллических пластин составляет около 20 мкм как хороший компромисс между властью дифракции и однородной активации лазером насоса. Кристаллы белка, подготовлен с использованием протоколов, как объяснялось выше, были использованы для сбора данных TR-SFX на bR насоса протона, который выявил сверхскоростной изменения, которые происходят после поглощения фотонов (рис. 5).

После подготовки образца, используя трехходовой муфта (рис. 6AB), визуальный осмотр образцов материала в шприц показывает однородности (рис. 6 cD) и Микроскоп изображения образца смешанного образца, как в шприц и на слайде, можно подтвердить плотность кристаллов и позволяет для измерения размеров кристалл, кристалл распределения размеров и кристалл плотности. Образец находится в кубической фазы, когда ясно доставки средних (рис. 7) и вязкой. Мутная смеси являются свидетельством того, что образец находится в губке фазы или пластинчатой фазы, но не являются окончательными, как кристалл высокой плотности может заслонить ясности Кус. Краткий тест низкого давления для идентификации этапа жидкого Губка может осуществляться потянув поршень шприца от образца в задней части шприц. Ламеллярные фазы могут быть легко идентифицированы посредством ее двулучепреломления с поляризованной световой микроскопии. Эти тесты, в сочетании с тестом до экструзии обычно достаточно, чтобы оправдать тест в инжектор.

Высокая частота XFELs требует скорости потока, что невозможно адекватно наблюдать с низкой кадров скорость камеры. Таким образом, характеристика экструзионного делается с помощью высокоскоростной камеры (в сочетании с высоким увеличением объектива), который может записывать покадровой видео. Видео данных высокоскоростной в том, что кадры записываются на 1000 fps, а также промежуток времени, в том, что видео записывается для 1 s каждые 30 s. Эта схема сбора данных позволит для сбора данных в ходе всего образца испытания (около 10 минут) без создания неуправляемой видео файлов. Даже с этой сокращенного набора данных размер, видео файлы могут быть свыше 50 ГБ. Следует позаботиться о том, чтобы убедиться, что адекватного хранения для сохранения видео данных перед началом теста.

В ходе испытания струи (рис. 1) образец следует выдавливать длинные (более чем 200 мкм) непрерывный столбец LCP, которая движется почти постоянной скоростью (рис. 2). Образцы, которые запускаются в режиме капает указывают, что вязкость образцов является слишком низким (рис. 2). Образцы можно часто восстановлены и смешивается с более monoolein или парафин адаптироваться вязкости. Образцы, которые формируют столбца следует протестировать с помощью высокоскоростной камеры. Данные из записи должен показать, что экструзии остается выше минимальной скорости, продиктовано ваши экспериментальные параметры. Скорость экструзии определяется путем измерения линейное расстояние, функция в потоке LCP проходимое за количество кадров. Экструзии медленного падения, которые могут быть отнесены к аномальным Сабо ордер переаттестации. Если они сохраняются выброс следует улучшить, добавок, таких как парафин, уменьшая плотность кристаллов или выбрав большего диаметра сопла. Кристаллы, обычно не выросли в вязкой среде (например, диффузии паров) может быть peletted путем центрифугирования и включены в LCP или других перевозчиков, вязкой. Примеры содержатся в разделе предыдущие публикации24,25,26,27,29,30.

Figure 1
Рисунок 1: высокоскоростной камеры установки скамейке. Фотография типичная Настольная установка с основных частей помечены. Этап 3 оси обеспечивает гибкость в обрамление и фокусировка изображения. Инжектор (показано с насадкой и водохранилище прилагается) монтируется вертикально и непосредственно перед объектива. Освещение в этом примере предоставляется одно волокно света освещает образца от оси и обеспечивая яркие поле на экране. Образец смонтирован и освещенные таким образом обеспечивает изображение как на врезные б. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: высокоскоростной камеры тестирования и анализа данных. На фото выше, два испытания экструзии LCP. Тест А показывает bR кристаллы в LCP выдавливания в режиме капает, указывающий, что образец не оптимизирована. Испытания B показывает LCP экструзии, образуя непрерывный столбец LCP где кристаллы могут отслеживаться, и можно вычислить скорость экструзии. В этом примере кристалл, встроенные в столбце LCP (50 мкм в диаметре) перемещает 301 мкм в 8 мс (37,6 мм/сек). Отображаются два набора данных из различных препаратов бактериородопсин кристаллов в LCP. Четыре (или больше) точки данных из каждой второй высокоскоростной камеру замедленной съемки видео (1 s записи каждые 30 s) были построены. Большой разброс между точками данных, взятых из одной второй период сбора данных указывают краткосрочных скорости. В то время как скользящее среднее течение всего данных серии показывает больше колебания в потоке. Лучшие серии от плохо экструзии образца (высокий шанс для легкие загрязнения с двумя подряд насос лазерных импульсов), и нижней серии от образец, который выполняется оптимально. Горизонтальные пунктирная линия указывает скорость экструзии поставленной через насос ВЭЖХ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: блок-схема подготовки образца. Подготовка образца начинается с высокой плотностью кристаллов белков, встроенных в LCP. Образец затем смешивается с низкой перехода температуры липидов, парафин и подготовил LCP, до тех пор, пока образец вступает в кубической фазы и проходит ряд небольших тестов для указания, что образец будет выталкивать в инжектор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: бактериородопсин кристаллы как исходного материала. Кристаллы выращивают в газонепроницаемый шприцы (A), с ЛКП, погруженный в осадителя раствора. Кристаллизация оптимизирована для высокой плотности кристаллов с возможно узкий гранулометрический (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: структурные изменения в бактериородопсин. TR-SFX раскрывает ультра-быстрых изменений в структуре бактериородопсин протонного насоса. Вот фото модель bR, производный от TR-SFX данных, полученных из кристаллов, подготовлен с использованием протоколов, описанные в этой работе. Панели слева показана модель с подчеркнул особенности в кармане сетчатки привязки. Правая панель показывает изменения в сетчатки от фемтосекунд миллисекунд. Этот показатель был воспроизведен из Nogly et al. (2018)10 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: муфта 3 х. Муфта 3 путь является снижение мертвых-Y громкость для совместимости с газонепроницаемым шприцы. 3D визуализации стяжку, показать взорвалась Ассамблея (A), и представление транспарентной, показаны смешивания канал (B). На рисунке показана кристалл неоднородного распределения после смешивания с стандартным автосцепки (C) и результирующая подвеска после смешивания в три пути автосцепки (D). Смешивание осуществляется путем нажатия примерно половину образца в другой шприц (E) и затем нажав обе половинки в оставшиеся шприц вместе, как показано в синие стрелки (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: тестирование индикаторов Предварительный впрыск. В ходе подготовки проб несколько небольших испытания используется для указания, что образец находится в фазе и адекватно вязкой. Оптическая прозрачность является одним из показателей, что образец, вероятно в кубической фазы. (A) мутная образец показан в шприц. (B) образец ясно показано, Примечание выпускные линии видны через образец несмотря на высокую плотность микро кристаллов. Когда матрица липидов в кубической фазы, он по-прежнему твердых как когда под никакого стресса. Низкого давления испытание проводится путем вытягивать шприц от задней части образца. Когда образец слишком жидкости как (индикативный этапа Губка) образец расширяет для заполнения тома (C). В результате положительных же теста (D) образца статичный несмотря на выведены поршень. Наконец макро масштабе экструзии тест выполняется нажатием небольшое количество образца через шприц стяжку. Капелька, образуя на кончик насадки (E) или быстро изгиба цилиндра LCP указывает на образец, который не является достаточно вязкая. Если образец выдавливаются, образует цилиндр, который остается вертикально со временем (F), то образец может заранее высокоскоростной камеры испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TR-SFX метод с вязкой экструзии инжектор оказалась жизнеспособной техники для исследования структурной динамики бактериородопсин9,10 и фотосистемы II13 и теперь, похоже, готов для изучения белков, вождение другие биологические процессы фото как свет driven ионного транспорта или сензорное воспринятие5,50. Чтобы максимизировать успех TR-SFX сбора данных на бактериородопсин были разработаны протоколы, описанные выше, однако мы считаем, может выступать в качестве шаблона для оптимизации сбора данных на другие образцы. Таким образом большая часть драгоценных beamtime в настоящее время потеряли из-за засорения или плохой пример экструзии вместо этого могут быть использованы для сбора более точных данных на больше времени задержки.

Наиболее трудным и критический шаг в протоколе является добавлением небольших количеств monoolein, который приносит матрице липидов в кубической фазы (шаг 1.8). Трудность заключается в тонкости фазового перехода и негативные последствия на образце, когда monoolein добавляется в избытке.

Изменения в методологии должны осуществляться с учетом различных белковых кристаллов. Они не могут быть совместимы с же добавок или сумма или необходимости смешивания. С другой стороны ломать кристаллы на более мелкие куски во время процесса смешивания не может поставить под угрозу качество дифракции и может даже улучшить струйная например когда длинные иглы ворваться в короткие фрагменты. Различные добавки могут быть заменены вместо парафин, который добавляется для улучшения потока скорость стабильности9. MAG 7.9/9,7 добавляется для предотвращения trasnistion пластинчатые фазу, которая может возникнуть при инъекции в вакуумной среде20 (как endstation CXI в ССК), но может быть опущен, если эксперимент проводится при атмосферном давлении. В нашем опыте многие кристаллы, растворимые белки могут быть стабильно включены в LCP, но несколько иронически мембранный белок кристаллы, непосредственно не выращивается в липидный мезофаз часто растворяются предположительно потому, что моющие средства извлекаются из хрусталя в среду липидов, как окружающий их. В таких случаях он должен попытаться полностью заменить LCP с29,27,25,26,30с альтернативной вязкой перевозчик24,.

Изменения в высокоскоростной камеры тест может вместить образцов, где кристаллы не являются видимыми в пределах перевозчик. Например можно настроить освещение для записи видео с помощью поляризованной световой микроскопии. Это приведет к Двулучепреломление кристаллы (как свечение), а также показывает части матрицы липидов, которые находятся в стадии Двулучепреломление пластинчатые.

Изменения в сторону, важно, что белок кристалл подготовки максимально соответствовать следующим критериям. Кристаллы должны оптимально размер максимально дифракции при сведении к минимуму засорения инжектора. Кристалл плотность должна быть достаточно высокой, чтобы принести хит ставке, достаточной для собирать полные наборы данных, но не настолько плотным, чтобы поставить под угрозу стабильность струи (плотность, что является слишком высокой, обычно может быть разбавлен; в случае bR, корректировка хит ставка 10-30% обычно worke d хорошо). Матрица липидов должны быть приведены в кубической фазы, и кристалл подвеска должна быть однородной.

TR-SFX проводит важные преимущества перед другими методами время решена кристаллографии как Лауэ дифракции, потому что: радиационного повреждения ограничена из-за «дифракционный до разрушения» методология, TR-SFX имеет широкую время резолюции над много заказов масштабы и вплоть до диапазона фемтосекундные, маленькие кристаллы позволяют лучше photoactivation, и photocycles проценты не нужно быть обратимыми.

TR-SFX в XFEL с использованием высокой вязкости инжектор имеет существенные преимущества над Жидкоструйный инжектор с точки зрения экономии образца. Например, напрямую сравнивать PYP6 и bR10, свидетельствует о сокращении на коэффициент 50 за то же количество собранных дифракционного изображения. Струи жидкости с другой стороны имеют преимущество в том, что поток является быстрый и сбора данных работает на полной скорости (чередующихся темных и светлых кадров), безотносительно к стабильности скорость потока инжектор (или светлое загрязнение в темной рамки). В то время как вязкой струи добавить новые вызовы, стоит учесть, что Жидкоструйный TR-SFX использует количество белков, которые могут быть абсолютно необоснованным производить для многих биологически соответствующих систем.

В настоящее время вязкой Пробоподготовка для TR-SFX ограничивается кристалл совместимость с доставкой среднесрочной. Хотя там было несколько альтернативных вязкой перевозчиков реализована, ни были найдены на работу для всех случаев. Кроме того поставки образца с высокой вязкостью инжектор всегда будет предметом засорение, или замедление даже с optomozation, используя этот протокол. Еще одним ограничением методики при присущие сокращение в посещаемом разбавления образца довести его до optomised extrudability.

В будущем TR-SFX методы может распространяться от белковых мишеней с естественным хромофоры для тех, кто с синтетическими фотореле. Измерения времени решены на реакции, которые не могут быть photoactivated должны полагаться на смешивание, температура прыжок, электрических полей или других технологий активации, которые еще должны быть адаптированы к последовательным кристаллографии. Сочетание этих срабатывания технологий вместе с возросшей доступности XFEL beamtime со временем, заложит основу понять Структурная динамика функции протеина на атомарном уровне.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют не конфликтующие интересы.

Acknowledgments

Мы признаем Гебхард Шертлера, Рафаэль Абела и Крис Milne для поддержки использования высокой вязкости инжекторов в PSI. Ричард Neutze и его команда признаны для обсуждения времени решены Кристаллография и поставки образца с помощью форсунок высокой вязкости. Для финансовой поддержки, мы признаем, Швейцарский Национальный научный фонд для грантов 31003A_141235, 31003A_159558 (для и.с.) и PZ00P3_174169 (для п.н.). Этот проект получил финансирование от Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы под Грант Мари-Склодовская-Кюри соглашение № 701646.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mosquito LCP Syringe Coupling TTP labtech store 3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl Hamilton HA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl Hamilton HA-81265
Monoolein Nu-Chek Prep, Inc. M-239
7.9 MAG Avanti Polar Lipids Inc. 850534O
50% w/v PEG 2000 Molecular Dimensions MD2-250-7
Paraffin (liquid) Sigma-Aldrich 1.07162
High speed camera Photron Photron Mini AX
High magnification lens Navitar 12X Zoom Lens System
Three axis stage ThorLabs PT3/M
Fiber light Thorlabs OSL2
Fused silica fiber Molex/Polymicro TSP-505375
Lite touch ferrule IDEX LT-100
ASU high viscosity injector Arizona State University Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pump Shimadzu LC-20AD
Electronic gas regulator Proportion Air GP1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  5. Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718 (2015).
  6. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  7. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
  8. Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
  9. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  10. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), eaat0094 (2018).
  11. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
  12. Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
  13. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  14. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  15. Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , In submiss 1364-1366 (2014).
  16. Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
  17. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  18. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
  19. Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
  20. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309 (2014).
  21. Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
  22. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  23. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
  24. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
  25. Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703 (2017).
  26. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
  27. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484 (2016).
  28. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  29. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
  30. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
  31. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
  32. Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621 (2014).
  33. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  34. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  35. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
  36. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  37. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
  38. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292 (2016).
  39. Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
  40. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  41. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
  42. Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585 (2017).
  43. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
  44. Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602 (2017).
  45. Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
  46. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
  47. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
  48. James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
  49. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  50. Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).

Tags

Химия выпуск 144 время решена серийный кристаллографии липидный кубической фазы бактериородопсин мембранных белков высокой вязкости инжектор трехходовой стяжку рентгеновский лазер на бесплатный eletron
Улучшение экструзии высокой вязкости микрокристаллов для времени решены серийный Фемтосекундный кристаллографии в рентгеновских лазеров
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

James, D., Weinert, T., Skopintsev,… More

James, D., Weinert, T., Skopintsev, P., Furrer, A., Gashi, D., Tanaka, T., Nango, E., Nogly, P., Standfuss, J. Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers. J. Vis. Exp. (144), e59087, doi:10.3791/59087 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter