Summary
Dit protocol beschrijft experimentele procedures karakteriseren van genoom-brede veranderingen in de niveaus van Histon posttranslationele modificaties (PTM) die zich voordoen in verband met de overexpressie van eiwitten ALS en Parkinson in zijn gekoppeld Saccharomyces cerevisiae modellen. Na SDS-pagina de scheiding, worden individuele Histon PTM niveaus gedetecteerd met wijziging-specifieke antilichamen via het westelijke bevlekken.
Abstract
Neurodegeneratieve ziekten, zoals Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de ziekte van Parkinson (PD), leiden tot het verlies van honderden duizenden levens per jaar. Effectieve behandelingsopties kunnen stoppen progressie van de ziekte ontbreken. Ondanks de inspanningen van de uitgebreide rangschikken in grote populaties van de patiënt blijven de meeste ALS en PD gevallen onverklaarbare door genetische mutaties alleen. Epigenetica mechanismen, zoals de posttranslationele wijziging van Histon eiwitten, kunnen worden betrokken in de etiologie van neurodegeneratieve ziekte en de progressie en leiden tot nieuwe streefcijfers voor farmaceutische interventie. Zoogdieren in vivo en in vitro modellen van ALS en PD zijn duur en vereisen vaak langdurige en moeizame experimentele protocollen. We schetsen hier, een praktische, snelle en kosteneffectieve aanpak bij de vaststelling van genoom-brede wijzigingen in Histon wijziging niveaus met behulp van Saccharomyces cerevisiae als een modelsysteem. Dit protocol voorziet in uitgebreide onderzoeken naar de epigenetische veranderingen verbonden met neurodegeneratieve proteinopathies die eerdere bevindingen in verschillende modelsystemen bevestigen terwijl aanzienlijk uitbreiden van onze kennis van de neurodegeneratieve ziekte epigenome.
Introduction
Neurodegeneratieve ziekten zijn verwoestende ziekten met weinig tot geen behandelingsopties beschikbaar. Onder deze zijn Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de ziekte van Parkinson (PD) bijzonder verschrikkelijk. Ongeveer 90% van de gevallen van ALS en PD worden beschouwd als sporadisch, die zich zonder familiegeschiedenis van de ziekte, terwijl de resterende gevallen uitgevoerd in gezinnen en in het algemeen zijn gekoppeld aan een specifiek gen mutatie1,2. Interessant, zijn beide van deze ziekten geassocieerd met de eiwitten mislocalization en aggregatie3,4,5,6. Bijvoorbeeld, gesmolten in Sarcoom (FUS) en TAR DNA-bindende eiwit 43 (TDP-43) zijn RNA-bindende proteïnen die mislocalize naar het cytoplasma en samen te voegen in ALS7,8,9,10, 11,12, terwijl α-synuclein het principe onderdeel van eiwithoudende aggregaten Lewy organen genoemd in PD5,13,14,15 is.
Ondanks de inspanningen van de uitgebreide genoom-brede vereniging in grote populaties van de patiënt blijven de overgrote meerderheid van ALS en PD gevallen onverklaarbare genetisch. Epigenetica een rol kan spelen in neurodegeneratieve ziekte? Epigenetica omvat wijzigingen in genexpressie voorkomen zonder veranderingen aan onderliggende DNA-sequentie16. Een belangrijkste epigenetische mechanisme omvat de post-vertalende wijzigingen (PTMs) van Histon eiwitten16. In eukaryote cellen, is genetisch materiaal strak verpakt in chromatine. De basiseenheid van de chromatine is de nucleosoom, bestaande uit 146 basenparen van DNA gewikkeld rond een Histon octamer, bestaande uit vier paar histonen (in tweevoud elke histonen H2A, H2B, H3 en H4)17. Elke Histon heeft een N-terminal staart dat steekt uit de nucleosoom en kan worden gewijzigd door de toevoeging van verschillende chemische wordt, meestal op lysine en arginine residuen18. Deze PTMs zijn dynamisch, wat betekent dat zij gemakkelijk kunnen worden toegevoegd en verwijderd en groepen zoals acetylation, methylering en fosforylering. PTMs controle van de toegankelijkheid van DNA voor de transcriptionele machines, en aldus bijdragen tot het besturingselement gen expressie18. Bijvoorbeeld, histone acetylation vermindert de sterkte van de elektrostatische interactie tussen het eiwit zeer fundamentele histone en de negatief geladen DNA ruggengraat, waardoor de genen ingepakt door geacetyleerd histonen meer toegankelijk te maken en dus zeer 19uitgedrukt. Meer recentelijk, de opmerkelijke biologische specificiteit van bepaalde Histon PTMs en combinaties daarvan heeft geleid tot de Histon code hypothese20,21 in welke eiwitten die schrijven, wissen en lezen Histon PTMs alle in concert handelen moduleren genexpressie.
Gist is een handig model te bestuderen neurodegeneratie. Nog belangrijker is, zijn veel neuronale cellulaire routes bewaard uit gist tot mens22,23,24. Gist recapituleren cytotoxiciteit fenotypes en eiwit insluitsels op overexpressie van FUS, TDP-43 of α-synuclein22,23,24,25,26. In feite, hebben Saccharomyces cerevisiae modellen van ALS zijn gebruikt ter identificatie van de genetische risicofactoren in mens27. Bovendien, gist menselijke α-synuclein toegestaan voor de karakterisatie van het Rsp5-netwerk als een druggable doel om te verzachten van α-synuclein toxiciteit in neuronen28,29overexpressing.
Hier beschrijven we een protocol exploitatie van Saccharomyces cerevisiae voor het detecteren van genoom-brede Histon PTM wijzigingen neurodegeneratieve proteinopathies (Figuur 1) is gekoppeld. Het gebruik van S. cerevisiae is zeer aantrekkelijk vanwege zijn gebruiksgemak, lage kosten, en snelheid in vergelijking met andere modellen van het in vitro en dierlijk van neurodegeneratie. Gebruik te maken van eerder ontwikkeld ALS en PD modellen22,23,25,26, we hebben overexpressie menselijke FUS TDP-43 en α-synuclein in gist en ongedekte verschillende Histon PTM veranderingen in verbinding met elke proteinopathy30. Het protocol dat wij hier beschrijven kan worden afgerond in minder dan twee weken van transformatie tot data-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het transformeren van S. cerevisiae met neurodegeneratieve proteinopathy-geassocieerde proteïne constructies
- Groeien wild type (WT) 303 gist in gist extract pepton dextrose (YPD) Bouillon overnachting met schudden (200 rpm) bij 30 ° C.
- Na 12−16 h van groei, Verdun gist om een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,25 met YPD. Zoals 10 mL vloeibare gist-cultuur nodig zal zijn voor elke transformatie, 50 mL vloeibare gist-cultuur voorbereiden op vijf transformaties overeenkomt met FUS, TDP-43, a-synuclein, en vector enige (ccdB) constructies, evenals een transformatie van de negatieve controle zonder DNA.
- Groeien gist met agitatie bij 30 ° C tot een OD600 tussen 0.60 en 0,80 is bereikt. Dit duurt over het algemeen 4−6 h.
- Dertig minuten voordat gist groei voltooid is, linearize plasmide constructies.
Opmerking: De plasmide-constructies gebruikt hier rechtstreeks in het genoom geïntegreerd moeten worden, en vandaar linearisatie is vereist voorafgaand aan de transformatie.- Berekening van de omvang van de voorraad van de plasmide dat bedragen naar 1 µg. Subtract dit volume vanaf 44 µL voor het berekenen van het bedrag van de nuclease gratis H2O nodig.
- Nuclease gratis H2O, 5 µL van 10 x restrictie-enzym buffer (Tabel of Materials), 1 µL van het restrictie-enzym van de NheI (Tabel van materialen) en de juiste hoeveelheid plasmide (berekend in stap 1.4.1) toevoegen aan een microcentrifuge buis. Meng door omhoog en omlaag pipetteren en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Het plasmide is nu gelineariseerde en klaar voor transformatie.
- Na de gist bereikt cultuur een OD600 van 0,6-0,8, oogst cellen in een conische tube van 50 mL en de spin naar beneden bij 850 x g bij 4 ° C voor 3 min. Discard supernatant.
- Cel pellet in 10 mL steriele H2O en centrifugeer bij 850 x g bij 4 ° C gedurende 3 min. Discard supernatant wassen. Herhaal 3 x voor een totaal van vier wast.
- Aan het begin van de derde wash, ontdooien en kook 10 µL van zalm sperma DNA per transformatie reactie gedurende 5 minuten op een blok van de verwarming.
- Resuspendeer de pellet cel in 100 µL van dH2O per transformatie en splitsen in het juiste aantal microcentrifuge buizen. Voor vijf transformaties, resuspendeer de pellet in 500 µL van dH2O en gelijkmatig opgesplitst in vijf afzonderlijke microcentrifuge buizen.
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 850 x g bij kamertemperatuur (RT) en verwijderen van alle resterende water.
- Toevoegen, in de volgende volgorde, van 50 µL van steriele H2O, 240 µL van 50% polyethyleenglycol (PEG), 36 µL van 1 M LiAc, 10 µL van zalm sperma DNA, 20 µL van gelineariseerde plasmide DNA (of nuclease gratis water voor geen DNA controle transformatie). Meng grondig na elke toevoeging en vortex kort nadat alle onderdelen van de transformatie hebt toegevoegd.
- Incubeer transformatie reacties bij 42 ° C gedurende 20 min.
Opmerking: Verrichten deze incubatie in een waterbad van meer consequente temperatuurcontrole. - Centrifugeer bij 470 x g bij RT voor 5 min. Discard supernatant en resuspendeer de pellet van elke cel in 200 µL van steriele H2O.
- Plaat gist schorsing voor selectieve media platen en verspreid dit met glooiende kralen of strooier. Incubeer de platen 2−3 dagen bij 30 ° C.
Opmerking: Synthetische gedefinieerde (SD)-zijn platen worden gebruikt voor de plasmiden die hier worden beschreven.
2. landmeetkunde kolonie groei onderdrukking en opslag in glycerol voorraden
- Inoculeer enkele kolonies van transformatie platen in 5 mL selectieve media, aangevuld met 2% raffinose. Groeien in een roteerapparaat bij 30 ° C's nachts. Selecteer ten minste 12 kolonies per transformatie.
Opmerking: Geen kolonies worden verwacht in de "geen DNA" plaat voor de controle van de transformatie. - Pin-frogger met ethanol, gevolgd door de vlammen te steriliseren.
- Voor elke cultuur, aliquoot 100 µL van verzadigde celsuspensie in de eerste rij van een 96-wells-plaat. Voeg 200 µL van steriele H2O in alle putjes van de aangrenzende goed kolommen. Toevoegen voor seriële verdunningen 1:5, 50 µL uit de eerste kolom naar de aangrenzende kolom achter met meerkanaals Pipetteer. Meng door pipetteren. Vervolgens toevoegen 50 µL van de tweede kolom naar de derde kolom en meng door pipetteren. Herhaal dit voor de rest van de plaat.
- Plaat gist door frogger in een 96-wells-plaat en dan stempelen door zacht en gelijkmatig op selectieve media platen met en zonder galactose. Incubeer bij 30 ° C gedurende 2−3 dagen.
Opmerking: SD-Hsi en SGal-zijn platen worden gebruikt voor de plasmiden die hier worden beschreven. - Voor FUS TDP-43 en a-synuclein transformaties, de kolonie weergeven van de meeste groei onderdrukking in aanwezigheid van galactose te identificeren. Selecteer deze kolonie van de SD-Hsi plaat en in selectieve media, aangevuld met 2% raffinose voor overnachting groei 10 mL beënten. Kies voor de vectorbestrijding, een kolonie worden getoond geen groei onderdrukking in aanwezigheid van galactose.
- Ter voorbereiding van glycerol voorraden, 0,5 mL van de verzadigde vloeistof cultuur te combineren met 0,5 mL 50% glycerol. Meng door omhoog en omlaag pipetteren en bevriezen bij-80 ° C.
Opmerking: Glycerol voorraden kunnen worden opgeslagen tot een jaar bij-80 ° C.
3. overexpressie van neurodegeneratieve proteinopathy geassocieerde eiwitten in S. cerevisiae
- Uit bevroren glycerol voorraden, opnieuw strijk gist op histidine, 2% glucose agar selectieve media platen en Incubeer bij 30 ° C voor de 2−3 dagen.
- Inoculeer enkele kolonies voor elk van de overexpressie modellen en controle in 5 mL histidine selectieve vloeibare media aangevuld met 2% raffinose. Groeien met schudden (200 rpm) bij 30 ° C's nachts.
- 100 mL liquid cultuur groeien voor elk van de overexpressie modellen en besturingselementen (FUS, TDP-43 en vector controle; a-synuclein en vector controle).
- 100 mL van de cultuur in selectieve media, aangevuld met 2% galactose voor te bereiden.
- De OD-600 voor overnachting culturen meet en berekent het bedrag van girale cultuur moest renderen overexpressie culturen op een startende OD600 van 0.3. Overnachting culturen zal meestal een OD600 van 0.9−10, die ongeveer 5 mL overnachting cultuur om te beginnen met 100 mL vers cultuur bereiken.
- Eiwit overexpressie veroorzaken door een groeiende gist op galactose media (zie stap 3.3.1) voor 5 h (FUS en TDP-43) of 8 h (a-synuclein) met schudden bij 30 ° C.
- Maatregel OD600 van iedere cultuur aan het einde van de inductieperiode. Alle punten van de cel en de laagste waarde van de OD600 standaardiseren. Cultuur in 50 mL tubes oogsten door centrifugatie bij 850 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Vloeistof wordt weggeworpen.
Opmerking: Als de OD600 waarden gemeten aan het eind van de inductie 0.654 en 0.984, respectievelijk voor 100 mL per-synuclein cultuur en 100 mL van een cultuur zijn, oogsten 95 mL van de per-synuclein cultuur en 67.1 mL van de cultuur van de controle. - Resuspendeer de pellet in 1 mL steriele dH2O voor elke 10 mL van de cultuur uitgegroeid. Pellet gelijkmatig verdeeld door aliquoting cel resuspensie 1 mL in buizen van de microcentrifuge. Bijvoorbeeld, als beginnend met 100 mL van de cultuur, resuspendeer de pellet in 10 mL steriele dH2O en verdelen het in 10 microcentrifuge buizen.
- Centrifugeer bij 850 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C, dan verwijderen van de bovendrijvende substantie. Module bevriezen cel pellets in vloeibare stikstof en winkel bij-80 ° C.
Opmerking: Cel pellets kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor maximaal één jaar.
4. cel lysis en westelijke bevlekken om te detecteren Histon posttranslationele modificaties
- Lysis van de cel
- Gist cel pellets op ijs ontdooien en resuspendeer cel pellets in 100 µL van dH2O.
- Om de cel resuspensie, voeg 300 µL van 0,2 M NaOH en 20 µL van 2-mercaptoethanol. Resuspendeer door pipetteren omhoog en omlaag.
- Incubeer de cellen op het ijs gedurende 10 minuten en vervolgens Centrifugeer bij 3200 x g op een tafelblad centrifuge voor 30 s op RT. Discard supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 100 µL van 1 x laden kleurstof en kook gedurende 10 minuten op een blok van de verwarming.
Opmerking: Het recept voor 6 x laden kleurstof kan gevonden worden in de Tabel van materialen.
- Polyacrylamide-gel-elektroforese van natrium dodecyl sulfaat en membraan overbrengen
- Voorbereiding gel kamer door het plaatsen van twee gels in een gel houder en vulling binnenkamer naar de top met buffer uitgevoerd en vullen de buiten zaal tot de maatstreep aan twee-gel lijn.
- Laden 15 µL van monster uit stap 4.1.4 per putje in de polyacrylamidegel van een 10-well-12%. De eiwit ladder lane, geladen 5 µL.
- Stel gel voor ongeveer 45 min op 150 V of totdat de onderkant van de gel laden kleurstof voorzijde bereikt.
- Tijdens het uitvoeren van de gel voorbereiden membraan overdracht door vezel pads (twee per gel) onderdompelen in overdracht buffer (Tabel van materialen) en Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride membraan onderdompelen in methanol. Spoel membraan in overdracht buffer vóór de overdracht.
Opmerking: Het membraan PVDF moet worden teruggebracht tot de grootte van de gel en gebruik één PVDF membraan voor elke gel worden overgebracht. - Monteren, op semi-droge overdracht apparaat cel, een overdracht 'sandwich': van onder de elektrode, (1) presoaked vezel pad, (2) presoaked en gespoeld PVDF-membraan, (3) gel uit stap 4.2.3 en (4) een tweede presoaked vezel pad te plaatsen.
Opmerking: Zorg ervoor om te voorkomen dat luchtbellen in de overdracht 'sandwich'. Zacht broodje 'sandwich' met serologische Pipetteer te dwingen uit bubbels. Zodra de gel is geplaatst op de top van het PDVF-membraan, zorg ervoor niet te verplaatsen. - Verrichten van eiwit overdracht door aggregaat op 150 mA voor 1 h (voor een ' sandwich').
- Detectie van Histon PTMs met wijziging specifieke antilichamen
- Membraan van overdracht apparaat verwijderen. Kort spoelen met dH2O.
- Optioneel, overdracht van eiwitten met Ponceau-S vlek controleren door gieten genoeg Ponceau-S vlek te dekken membraan in een kleine plastic doos broeden op RT met zacht schudden voor 30−60 s. verwijderen Ponceau-S vlek en spoel met dH2O totdat achtergrond stain verdwijnt en eiwit bands zijn zichtbaar met het blote oog. Blijven spoelen met dH2O totdat alle vlek is verwijderd van de membraan.
- Blokkeren membraan door vlek voor 1 h bij RT met zachte rockende met tris gebufferde zoutoplossing (TBS) blokkeerbuffer (Tabel van materialen) aan het broeden in een vakje van de kleuring. Gebruik voldoende buffer met blokkerend ter dekking van de vlek.
Opmerking: Wees voorzichtig om de plaats van membraan rechtop in de kleuring vak zodat de kant van de membraan waarin eiwitten liggen is niet naar beneden. - Incubeer vlek in de kleuring vak overnachting met een Histon wijziging-specifieke antilichaam reactief naar gist bij 4 ° C. Verdun het antilichaam in TBS blokkeerbuffer volgens specificaties van de fabrikant. Ook een goede nucleaire laden-besturingselement, zoals anti-totaal H3 groeide op in een andere host-soort uit de wijziging-specifieke antilichaam. Bijvoorbeeld, als indringende voor H3S10ph met een anti-H3S10ph antistof opgegroeid in konijn, een anti-totaal H3 antilichaam aan de orde gesteld in de muis als een besturingselement laden gebruiken. Herhaal dit voor elke vlek zo nodig.
Opmerking: Antilichaam verdunningen kunnen worden hergebruikt voor een totaal van drie keer binnen een maand. Bewaar ze bij 4 ° C. - Wassen van het membraan 4 x in huis-en-klare TBS + 0,1% Polysorbaat 20 (TBST) voor 5 min met rockende op RT.
- Incubeer vlek met fluorescerende secundaire antilichamen in fabrikant opgegeven verdunningen (ezel anti-konijn 680 en ezel-antimuis) gedurende 1 uur op RT.
Opmerking: TL secundaire antilichamen moeten worden beschermd tegen licht tijdens de opslag en het gebruik. Verrichten van incubatie in donkere plastic dozen of dek af met aluminiumfolie. - Wassen membraan 4 x met TBST voor 5 min en wassen met TBS voor 5 min tijdens het rocken op RT.
- Visualiseren vlek op een fluorescerende westelijke vlek imaging systeem voor 2 min. visualiseren de anti-konijn 680 en anti-muis 800 secundaire antilichamen in de 800 nm en 700 nm kanalen, respectievelijk.
Opmerking: Replicatieonderzoeken worden onafhankelijk uitgevoerd vanaf sectie 1. Het is noodzakelijk om te verifiëren dat de antistofrespons signaal is binnen het bereik via welke de signaal-reactie lineaire voor de juiste data interpretatie in deze experimenten wordt.
- Membraan van overdracht apparaat verwijderen. Kort spoelen met dH2O.
5. data analyse en statistiek
- Open afbeelding van vlek in een denkbaar software (Tabel van materialen). Verwerven van de ruwe dichtheid van monsters van de wijziging-specifieke banden in de vector controle, TDP-43, FUS (of vectorbestrijding en a-synuclein), door het tekenen van een rechthoek die de band in de analyse modus frames.
- Herhaal stap 5.1 voor het laden van controle banden.
Opmerking: Zal er een laad controle van de band en de band van een specifieke wijziging in elk monster. - Bereken de relatieve dichtheid van de wijziging-specifieke banden door te delen elke band door de dichtheid van de bijbehorende band in de vector controlemonster. Dit normaliseert de gegevens aan de vectorbestrijding.
- Bereken de relatieve dichtheid van de lading controle band door te delen elke band door de dichtheid van de corresponderende laden controle band in de vector controlemonster.
- Berekenen van de gecorrigeerde relatieve dichtheid van elke band door te delen van de relatieve dichtheid van de wijziging-specifieke band over de relatieve dichtheid van de lading controle band voor elk monster. Nu, kunnen de gegevens worden gevisualiseerd in histogram vorm.
Opmerking: Voor het gemak van de verwerking, stappen 5.3-5.5 kunnen worden gedaan in een werkblad (Aanvullende bestand). - Na meerdere onafhankelijke replicaten, run Welch's T-tests tussen de twee controlemonsters en de juiste proteinopathy model (control versus FUS control versus TDP-43 en control versus een-synuclein) met p = 0.05 als de cutoff voor betekenis .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ter illustratie van deze methode, zullen we gebruik maken van de onlangs gepubliceerde resultaten30. WT menselijke FUS en TDP-43 waren overexpressie voor 5 h, terwijl WT α-synuclein was overexpressie gedurende 8 uur. Een ccdB constructie werd gebruikt als een vector negatieve controle. Figuur 2 toont groei onderdrukking in vaste en vloeibare culturen. Gist is gekapt zoals beschreven en westelijke bevlekken met wijziging-specifieke antilichamen werd uitgevoerd. Anti-totaal H3 werd gebruikt als een besturingselement laden. Een significante daling in de niveaus van H3S10ph en H3K14ac is herkenbaar in de FUS overexpressie model (Figuur 3ab). Er zijn aanzienlijke stijging van de niveaus van acetylation op H4K12 en H4K16 in de TDP-43 overexpressie model die worden niet waargenomen in hetzij de FUS of α-synuclein overexpressie model (Figuur 3 cd). Er zijn ook significante dalingen in de niveaus van H3K36me2 en H2BT129ph in de α-synuclein overexpressie model (figuur 3ef).
Om aan te tonen dat de verandering in Histon PTMs met de hoeveelheid van de uitdrukking van de neurodegeneratieve proteinopathy eiwit correleert, kan de expressie van FUS worden afgestemd door inducerende eiwituitdrukking in verschillende niveaus van galactose (figuur 4a). Galactose wordt gemengd met sacharose in wisselende verhoudingen zodanig zijn dat de totale concentratie van suiker constant op 2 is %, maar de hoeveelheid galactose wordt gewijzigd, wat resulteert in een scala van expressie eiwitniveaus. Sacharose is in S. cerevisiae, langzaam gemetaboliseerd tot glucose, die galactose inductie31 onderdrukt. Vandaar, sacharose activeert noch onderdrukt galactose inductie. Hoe lager de hoeveelheid galactose gebruikt voor het opwekken van FUS overexpressie, werd de minder toxiciteit waargenomen in zowel vaste en vloeibare cultuur (figuur 4bc). Nog belangrijker is, hoe lager het niveau van FUS overexpressie, hoe kleiner de omvang van de verlaging van H3S10ph (Figuur 4 d-f).
Figuur 1: Methodoverview voor de karakterisatie van veranderingen in Histon posttranslationele modificaties verbonden met neurodegeneratieve ziekte proteinopathies in gist modellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: toxiciteit gekoppeld overexpressie van neurodegeneratieve proteinopathy-gerelateerde eiwitten in gist modellen. Spotten tests tonen de levensvatbaarheid van de cellen voor gist overexpressing vectorbestrijding, TDP-43, FUS of α-synuclein in aanwezigheid van glucose (een) of galactose (b). (c) groei curve ter illustratie van de levensvatbaarheid van de cellen in vloeibare cultuur onder galactose inductie. Foutbalken geven de ± standaardafwijking. n = 3 voor elke stam. Duplo's het gevolg zijn van volledig onafhankelijke experimenten. Gegevens aangepast met toestemming van Chen, K. et al. neurodegeneratieve ziekte Proteinopathies zijn verbonden met verschillende Histone Post-translational wijziging landschappen. ACS chemische Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: veranderingen in Histon posttranslationele modificaties overexpressie van neurodegeneratieve proteinopathy-gerelateerde eiwitten in gist modellen gekoppeld. Een FUS proteinopathy model toont aan lagere niveaus van (een) H3S10ph, n = 6, en (b) H3K14ac, n = 3. Omgekeerd, een TDP-43 proteinopathy model toont aan verhoogde niveaus van (c) H4K12ac, n = 3, en (d) H4K16ac, n = 6, terwijl een α-synuclein model verminderde niveaus van (e) H3K36me2, n toont = 3, en (f) H2BT129ph, n = 7. Foutbalken Toon + standaarddeviatie. *, p < 0,05, ***, p < 0,001. Duplo's het gevolg zijn van volledig onafhankelijke experimenten. Gegevens aangepast met toestemming van Chen, K. et al. neurodegeneratieve ziekte Proteinopathies zijn verbonden met verschillende Histone Post-translational wijziging landschappen. ACS chemische Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: omvang van de afname van de niveaus van de H3S10ph is gebonden aan het niveau van FUS overexpressie. (een) Cartoon illustratie van het gebruik van sacharose en galactose ratio's om de hoeveelheid FUS overexpressie af te stemmen. (b) Spotting tests tonen van de levensvatbaarheid van de cellen in de aanwezigheid van verschillende niveaus van galactose. (c) groei curve in vloeibare cultuur tonen van de levensvatbaarheid van de cellen in de aanwezigheid van verschillende niveaus van galactose. Foutbalken geven ± standaardafwijking. (d) vertegenwoordiger immunoblots weergegeven: dat de FUS proteïne niveaus stijgen als cellen worden blootgesteld aan de verhoging van de ratio's van galactose. Fosfoglyceraat kinase (PGK) werd gebruikt als een besturingselement laden. (e) vertegenwoordiger immunoblots weergegeven: bijbehorende dalingen in H3S10ph niveaus met de verhoging van de ratio's van galactose. (f) Quantitation histogram van (e). n = 3 voor elke voorwaarde. Foutbalken geven + standaarddeviatie voor kwantificering grafiek. Duplo's het gevolg zijn van volledig onafhankelijke experimenten. Gegevens aangepast met toestemming van Chen, K. et al. neurodegeneratieve ziekte Proteinopathies zijn verbonden met verschillende Histone Post-translational wijziging landschappen. ACS chemische Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven biedt een eenvoudige, doelmatige en kosteneffectieve manier van het categoriseren van genoom-brede Histon PTM wijzigingen gecorreleerd met neurodegeneratieve proteinopathies. Hoewel er andere modellen van ALS en PD, zoals in vitro modellen menselijke cellijnen en RattenUitrustingen32, S. cerevisiae blijft aantrekkelijk vanwege haar gebruiksgemak. Bijvoorbeeld, gist modellen vereisen geen gebruik van een steriele kap, noch hoeven zij de intensieve opleiding die gaat samen met cel cultuur werk. Bovendien zijn de reagentia voor het kweken van gist ook veel goedkoper dan zoogdiercellen cultuur leveringen. Gist modellen hebben benut om te onthullen van de determinanten van het domein van eiwit aggregatie22,23,24,25,26, maar ook hebben geleid tot blootleggen erfelijk risico factoren in ALS27, evenals modifiers van eiwit aggregatie toxiciteit22. Bovendien is de schrapping van Set3, een lid van de complexe, histone deacetylase gebleken om TDP-43 toxiciteit in gist33. Interessant, zijn onze bevindingen in gist in overeenstemming met de recente rapporten over Histon wijziging wijzigingen in beide een FUS muismodel en in een menselijke SH-SY5Y FUS overexpressie model34,35. Bovendien ontdekte onlangs veranderingen in DNA-methylering patronen rond belangrijke PD genen, zoals SNCA en PARK2, ondersteuning voor een rol voor epigenetica in PD36,37.
Hier, laten we zien dat deze gist modellen kunnen ook worden gebruikt om te ontdekken hoe neurodegeneratieve proteinopathies ermee aan de epigenome30. Wij vinden dat verschillende wijzigingen in histone modificaties geassocieerd met elk model proteinopathy worden. Het protocol hier geschetst kan we bevestigen eerdere bevindingen in andere modelsystemen. Meest opmerkelijk, heeft deze methode versterkt ons inzicht in het epigenomic panorama van neurodegeneratieve ziekte. De uitgebreide reeks wijzigingen voorgesteld hier kon ontdekken roman Histon schrijver en gum dedoelenvoorde farmacologische interventies. Deze resultaten wijzen op de mogelijke bijdrage van histones PTMs en epigenetica in de pathologie van ALS, PD en andere neurodegeneratieve ziekten en nieuwe mogelijkheden kunnen bieden voor behandeling van deze ziekten.
Bijzondere zorg moet worden genomen in stappen 1.9 en 1.10 bij het transformeren van gist neurodegeneratieve proteinopathies overexpress. In het bijzonder de reagentia in de juiste volgorde tijdens stap 1.10 toe te voegen is noodzakelijk hoge transformatie efficiëntie te waarborgen. Bovendien is het zeer belangrijk om te kiezen van de kolonie de meeste groei onderdrukking in galactose weer te geven. Bij montage van de Western sandwich moet ook zorg worden gehouden. Toevallige toevoeging van bubbels tussen de gel en membraan zal blokkeren van overdracht van het eiwit en blok vlekken op de vlek die data-analyse kan belemmeren.
Een beperking van dit protocol is dat antilichamen beperkt worden tot alleen bindend en opsporen van één of twee histone modificaties tegelijk. Het is ook cruciaal voor goed standaardiseren monsters na eiwit overexpressie (stappen 3.4−3.6). Volledig verwijderen van alle groei media ervoor zorgen zal dat elke cel pellet wind up geresuspendeerde in hetzelfde volume. Ook is het belangrijk om zorgvuldig aliquoot evenveel celsuspensie in de microcentrifuge buizen (stap 3.4). Als de monsters zijn niet goed gestandaardiseerd, is het moeilijk om conclusies te trekken uit de wijzigingen op Histon PTM niveaus. Zulk een probleem zou worden herkenbaar in de verschillen op het niveau van de controle van de lading van de westelijke vlek (punt 4.2). Om dit te verhelpen, kan een SDS-pagina gel geladen met relevante monsters Coomassie gekleurd, waardoor eiwitten band kwantificering van de monsters (sectie 5) en latere re standaardisatie van monsters op basis van de hoeveelheid eiwit aanwezig op elk monster worden.
Kortom, zorgt dit protocol voor de analyse van Histon PTM wijzigingen die zijn gekoppeld aan de overexpressie van eiwitten die verband houden met neurodegeneratieve proteinopathies in iets minder dan twee weken, van transformatie tot statistische analyse. Naast het inschakelen van de studie van proteinopathies die zijn gekoppeld aan neurodegeneratieve ziekten, kan deze algemene protocol worden gebruikt om te studeren Histon PTM wijzigingen in ieder model van gist overexpressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Royena Tanaz Huda Yousuf en Sadiqa Taasen voor technische hulp. We zijn zeer dankbaar aan Prof. James Shorter royale voordelevering van reagentia en intellectuele bijstand bij het ontwerpen van sacharose tuning experimenten. Gist plasmiden waren een gulle gift van Prof. Aaron Gitler (met inbegrip van 303Gal-FUS; Addgene plasmide # 29614). Brooklyn College en de Advanced Science Research Center (CUNY) evenals een NIH NINDS geavanceerde postdoctorale overgang Award (K22NS09131401) ondersteund M.P.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
- Beitz, J. M.
- Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
- Poewe, W., et al.
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
- Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
- King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
- Spillantini, M. G., et al.
- Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A.
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
- Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
- Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
- Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
- Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
- Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
- Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
- Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
- Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
- Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).
