Summary
Denne protokollen skisserer eksperimentelle prosedyrer for å karakterisere genomet-omfattende endringer i nivåer av histone post-translasjonell endringer (PTM) oppstår i forbindelse med overuttrykte proteiner knyttet ALS og Parkinsons Saccharomyces cerevisiae modeller. Etter SDS side separasjon oppdages personlige histone PTM nivåer med endring-spesifikke antistoffer via Western blotting.
Abstract
Nevrodegenerative sykdommer, slik som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sykdom (PD), føre til tap av hundretusener av liv hvert år. Effektive behandlingstilbud kunne stoppe sykdomsprogresjon mangler. Til tross for omfattende sekvensering i store pasientgrupper forbli fleste ALS og PD tilfeller uforklarlig av genetiske mutasjoner alene. Epigenetics mekanismer, som den post-translasjonell modifikasjonen av histone proteiner, kan være involvert i neurodegenerative sykdom etiologien og progresjon og føre til nye mål for farmasøytiske intervensjon. Pattedyr i vivo og in vitro modeller av ALS og PD er kostbare og ofte krever langvarig og arbeidskrevende eksperimentelle protokoller. Her skissere vi en praktisk, rask og kostnadseffektiv tilnærming til å bestemme genomet-omfattende endringer i histone endring nivåer ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae som modellsystem. Denne protokollen gir omfattende etterforskning epigenetic endringer koblet til nevrodegenerative proteinopathies som bekrefte tidligere funn i annen modellsystemer samtidig betydelig utvide vår kunnskap om den neurodegenerative sykdom epigenome.
Introduction
Nevrodegenerative sykdommer er ødeleggende sykdommer med liten eller ingen behandlingstilbud tilgjengelig. Blant disse er amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sykdom (PD) spesielt forferdelig. Ca 90% av ALS og PD anses sporadisk, skjer uten familiehistorie med sykdommen, mens de resterende kjøre i familier og er vanligvis knyttet til et bestemt gen mutasjon1,2. Interessant, er begge disse sykdommer assosiert med protein mislocalization og aggregering3,4,5,6. For eksempel smeltet i sarkomspesialitet (FUS) og TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) er RNA bindende proteiner som mislocalize til cytoplasma og samlet i ALS7,8,9,10, 11,12, mens α-synuclein er komponenten prinsippet av proteinaceous aggregater kalt Lewy organer i PD5,13,14,15.
Til tross for omfattende genomet hele association i store pasientgrupper forbli det overveldende flertallet av ALS og PD uforklarlig genetisk. Kan epigenetics spille en rolle i neurodegenerative sykdom? Epigenetics omfatter endringer i genuttrykk oppstår endringer i underliggende DNA sekvens16. En viktigste epigenetic mekanisme innebærer innlegg translasjonsforskning endringene (PTMs) av histone proteiner16. I eukaryote celler, er genetisk materiale tett pakket inn i chromatin. Lagerenheten chromatin er nucleosome, består av 146 base par DNA pakket rundt en histone octamer, består av fire histones (to eksemplarer hvert av histones H2A, H2B H3 og H4)17. Hver histone har en N-terminal hale som stikker ut av nucleosome og kan bli endret med tillegg av ulike kjemiske moieties, vanligvis på lysin og arginin rester18. Disse PTMs er dynamisk, som betyr at de enkelt kan legges og fjernet, og inkluderer grupper som acetylation og metylering fosforylering. PTMs kontrollere tilgjengeligheten av DNA til transcriptional maskiner, og dermed hjelpe kontroll gene expression18. For eksempel histone acetylation reduserer styrken på elektrostatisk samspillet mellom svært grunnleggende histone protein og negativt ladde DNA ryggraden, slik at genene pakket acetylated histones å være mer tilgjengelig og dermed svært uttrykt19. Flere nylig, bemerkelsesverdig biologisk spesifisiteten av bestemt histone PTMs og kombinasjoner har ført til histone koden hypotesen20,21 i som proteiner som skrive, slette og lese histone PTMs alle handle sammen slik modulere genuttrykk.
Gjær er et svært nyttig eksempel å studere neurodegeneration. Viktigere, er mange neuronal mobilnettet baner bevart fra gjær til mennesker22,23,24. Gjær recapitulate cytotoksisitet fenotyper og protein inkluderinger på overuttrykte Fu, TDP-43 eller α-synuclein,22,,23,,24,,25,,26. Faktisk har Saccharomyces cerevisiae modeller av ALS blitt brukt til å identifisere genetiske risikofaktorer i mennesker27. Videre gjær overexpressing menneskelige α-synuclein tillatt for karakterisering av Rsp5 nettverket som druggable mål å forbedre α-synuclein toksisitet i neurons28,29.
Her beskriver vi en protokoll utnytte Saccharomyces cerevisiae å oppdage genomet hele histone PTM filendringer tilknyttet nevrodegenerative proteinopathies (figur 1). Bruk av S. cerevisiae er meget attraktivt på grunn av dens lette av bruk, lave kostnader, og hastighet i forhold til andre in vitro og dyr modeller av neurodegeneration. Utnytte tidligere utviklet ALS og PD modeller22,23,25,26, vi har overexpressed menneskelige FUS TDP-43 og α-synuclein i gjær og avdekket distinkte histone PTM omveltningene i forbindelse med hver proteinopathy30. Protokollen som beskriver vi her kan gjennomføres på mindre enn to uker fra transformasjon til dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transformere S. cerevisiae med nevrodegenerative proteinopathy-assosiert protein konstruksjoner
- Vokse vill type (WT) 303 gjær i gjær ekstrakt pepton druesukker (YPD) buljong natten med risting (200 rpm) på 30 ° C.
- Etter 12−16 h vekst, fortynne gjær til en optisk tetthet på 600 nm (OD600) på 0,25 med YPD. 10 mL av gjær flytende kultur vil være nødvendig for hver transformasjon forberede 50 mL av gjær flytende kultur fem transformasjoner tilsvarer Fu, TDP-43, en synuclein, og vektor bare (ccdB) konstruksjoner, samt en negativ kontroll transformasjon uten DNA.
- Vokse gjær med agitering på 30 ° C til en OD600 mellom 0.60 og 0,80 er nådd. Dette tar vanligvis 4−6 h.
- Tretti minutter før gjær vekst er fullført, linearize plasmider konstruksjoner.
Merk: Plasmider konstruksjoner her må integreres direkte i genomet, og dermed linearization kreves før transformasjon.- Beregne volumet av plasmider lager som utgjør 1 µg. trekk fra dette volumet fra 44 µL beregne mengden nuclease gratis H2O nødvendig.
- Legge til nuclease gratis H2O, 5 µL 10 x begrensning enzym bufferen (Tabell for materiale), 1 µL av NheI begrensning enzym (Tabell for materiale) og riktig mengde plasmider (beregnet i trinn 1.4.1) i et microcentrifuge rør. Bland godt av pipettering opp og ned og ruge på 37 ° C i 15 min. Plasmider er nå linearisert og klar for transformasjon.
- Etter gjær når kultur en OD600 av 0,6 0,8, høste celler i en 50 mL konisk rør og Nedspinning 850 x g ved 4 ° C i 3 min. Forkast nedbryting.
- Vask celle pellet i 10 mL steril H2O og sentrifuge 850 x g på 4 ° C for 3 min. Forkast nedbryting. Gjenta 3 x for totalt fire vasker.
- Ved starten av den tredje vasken, tine og koke 10 µL av laks sæd DNA per transformasjon reaksjon for 5 min på oppvarming blokk.
- Resuspend celle pellet i 100 µL av dH2O per transformasjon og delt inn i passende antall microcentrifuge rør. For fem transformasjoner, resuspend pellets til 500 µL av dH2O og delt likt inn i fem separate microcentrifuge rør.
- Sentrifuge for 5 min på 850 x g ved romtemperatur (RT) og Fjern alle gjenværende vann.
- Legge til, i følgende rekkefølge, 50 µL av sterile H2O, 240 µL av 50% polyetylenglykol (PEG), 36 µL av 1 M LiAc, 10 µL av laks sæd DNA, 20 µL av lineær plasmider DNA (eller nuclease gratis vann for noen DNA kontroll transformeringer). Bland godt etter hvert tillegg og vortex kort etter alle transformasjon komponenter har blitt lagt.
- Inkuber transformasjon reaksjoner på 42 ° C i 20 min.
Merk: Utføre denne inkubasjon i et vannbad for mer konsekvent temperaturkontroll. - Sentrifuge 470 x g på RT for 5 min. Forkast nedbryting og resuspend hver celle pellet i 200 µL av sterile H2O.
- Plate gjær suspensjon på selektiv media plater og spredt med bølgende perler eller spreder. Inkuber plater i 2−3 dager på 30 ° C.
Merk: Syntetisk brukerdefinert (SD)-hans plater brukes for plasmider beskrevet her.
2. kartlegging kolonien vekst undertrykkelse og lagring i glyserol aksjer
- Vaksinere enkelt kolonier fra transformasjon platene i 5 mL selektiv medier med 2% raffinose. Vokse i en shaker på 30 ° C over natten. Velg minst 12 kolonier per transformasjon.
Merk: Ingen kolonier forventes i "ingen DNA" transformasjon kontroll plate. - Sterilisere pin-frogger med etanol, etterfulgt av flammende.
- For hver kultur, aliquot 100 µL av mettet celle suspensjon i den første raden av en 96-brønns plate. Legge til 200 µL av sterile H2O i alle brønnene tilstøtende godt kolonnene. For 1:5 føljetong fortynninger, legge 50 µL fra den første kolonnen i den tilstøtende kolonnen bak med flerkanals pipetter. Bland godt av pipettering. Deretter legge 50 µL fra den andre kolonnen til den tredje kolonnen og blanding av pipettering. Gjenta dette for resten av platen.
- Plate gjær ved å plassere frogger i en 96-brønns plate og deretter stempling ved jevnt og forsiktig å trykke ned på selektiv media plater med og uten galaktose. Ruge på 30 ° C i 2−3 dager.
Merk: SD-hans-og SGal-hans brukes for plasmider beskrevet her. - For FUS TDP-43 og en synuclein transformasjoner, identifisere kolonien viser de fleste vekst undertrykkelse i nærvær av galaktose. Velg denne kolonien fra SD-hans plate og vaksinere i 10 mL selektiv medier med 2% raffinose for overnatting vekst. Vector kontroll, velge en koloni viser ingen vekst undertrykkelse i nærvær av galaktose.
- For å forberede glyserol aksjer, kombinere 0,5 mL av mettet flytende kultur med 0,5 mL 50% glyserol. Blande av pipettering opp og ned og fryse på-80 ° C.
Merk: Glyserol aksjer kan lagres i opptil ett år på-80 ° C.
3. overuttrykte nevrodegenerative proteinopathy tilknyttet proteiner i S. cerevisiae
- Frosne glyserol aksjer, nytt strek gjær på histidin, 2% glukose agar selektiv media plater og ruge på 30 ° C i 2−3 dager.
- Vaksinere enkelt koloniene for overuttrykte modeller og kontroll i 5 mL histidin selektiv flytende medium med 2% raffinose. Vokse med skjelvende (200 rpm) på 30 ° C over natten.
- Vokse 100 mL væske kultur for hver av overuttrykte modeller og kontroller (FUS TDP-43 og vektor kontrollere, en synuclein og vektor).
- Forberede 100 mL kultur i selektiv medier med 2% galaktose.
- Måle OD600 overnatting kulturer og beregne mengden natten kultur som trengs for å gjengi overuttrykte kulturer på en start OD600 på 0,3. Vanligvis kommer overnatting kulturer en OD600 av 0.9−10, krever ca 5 mL av natten kultur starte 100 mL frisk kultur.
- Indusere protein overuttrykte av voksende gjær på galaktose media (se trinn 3.3.1) for 5 h (FUS og TDP-43) eller 8 timer (en synuclein) med skjelvende på 30 ° C.
- Måle OD600 i hver kultur på slutten av innledningsperioden. Standardisere alle celletall til laveste OD600 verdi. Høste kultur i 50 mL rør av sentrifugering 850 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting.
Merk: Hvis OD600 verdiene målt på slutten av induksjon er 0.654 og 0.984, henholdsvis for 100 mL en synuclein kultur og 100 mL kontroll kultur, høste 95 mL av en synuclein kultur og 67.1 mL kontroll kulturen. - Resuspend pellets i 1 mL steril dH2O for hver 10 mL kultur dyrket. Dele pellet jevnt ved aliquoting 1 mL av cellen rørets i microcentrifuge rør. For eksempel hvis starter med 100 mL kultur, resuspend pellets i 10 mL steril dH2O og dele den inn i 10 microcentrifuge rør.
- Sentrifuge 850 x g i 5 min på 4 ° C, og deretter fjerner nedbryting. Fest fryse celle pellets i flytende nitrogen og store på-80 ° C.
Merk: Cellen pellets kan lagres ved-80 ° C i opptil ett år.
4. celle lyse og vestlige blotting å oppdage histone post-translasjonell endringer
- Cellen lysis
- Tine gjær celle pellets på is og resuspend celle pellets i 100 µL av dH2O.
- Legge til 300 µL av 0,2 M NaOH og 20 µL av 2-mercaptoethanol celle-rørets. Resuspend av pipettering opp og ned.
- Ruge celler på is 10 min og deretter virvel 3200 x g på en tabletop sentrifuge for 30 s på RT. Forkast nedbryting.
- Resuspend celle pellet i 100 µL av 1 x lasting fargestoff og kok i 10 minutter på oppvarming blokk.
Merk: Oppskriften på 6 x lasting fargestoff finnes i Tabellen for materiale.
- Natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel gelelektroforese og membran overføring
- Forberede gel kammer ved å plassere to gels i en gel holderen og fylling indre kammer til toppen med kjører buffer og fylle utenfor kammeret til to-gel linje merket.
- Last 15 µL av eksempel fra trinn 4.1.4 per brønn i en 10-og 12% polyakrylamid gel. Lastes inn 5 µL av protein stigen kjørefelt.
- Kjøre gel for ca 45 min fra 150 V eller til lasting fargestoff foran når bunnen av gel.
- Mens gel kjører, forberede membran overføring av soaking fiber pads (to per gel) overføring buffer (Tabell for materiale) og soaking polyvinylidene fluor (PVDF) membran i metanol. Skyll membran overføring buffer før overføring.
Merk: PVDF membranen bør kuttes til størrelsen på gel og bruke en PVDF membran for hver gel overføres. - Montere, semi-tørr overføring apparater celle, overføring "sandwich": fra bunnen elektrode, sted (1) presoaked fiber pad, (2) presoaked og skylles PVDF membran, (3) gel fra trinn 4.2.3 og (4) en andre presoaked fiber pad.
Merk: Sørg for å unngå luftbobler i overføringen "sandwich." Forsiktig kast "sandwich" med serologisk Pipetter å tvinge ut bobler. Når gel er plassert over PDVF membran, må ikke å flytte den. - Utføre protein overføre ved å sette kraftforsyning til 150 mA 1t (for en "sandwich").
- Oppdagelsen av histone PTMs med endring spesifikke antistoffer
- Fjern membran fra overføring apparater. Skyll kort med dH2O.
- Alternativt, sjekk overføring av proteiner med Ponceau-S flekken ved å helle nok Ponceau-S flekken for å dekke membran i en liten plast og rugende på RT med mild risting for 30−60 s. fjerne Ponceau-S flekken og skyll med dH2O til bakgrunnen flekken forsvinner og protein band er synlig for det blotte øye. Fortsette å skylle med dH2O inntil alle flekker er fjernet fra membranen.
- Blokkere membran av rugende blot 1t på RT med milde rocking med tris bufret saltvann (SS) blokkerer buffer (Tabell for materiale) i en liten flekker. Bruke nok blokkerer buffer for å dekke blot.
Merk: Pass på å plassere membran oppreist i boksen flekker slik at siden membranen som proteiner ligger ikke vender. - Inkuber blot i boksen flekker over natten med en histone endring-spesifikke antistoffer reaktive mot gjær på 4 ° C. Fortynne antistoffer TBS blokkerer buffer henhold til produsentens spesifikasjoner. Også ta en riktig kjernefysiske lasting kontroll, for eksempel anti-totalt H3 oppvokst i en annen vert arter endring-spesifikke antistoffer. For eksempel hvis leter etter H3S10ph med et anti-H3S10ph antistoff i kanin, kan du bruke et anti-totalt H3 antistoff i mus som en lasting. Gjenta dette for hver blot etter behov.
Merk: Antistoff fortynninger kan gjenbrukes for totalt tre ganger innen en måned. Lagre dem på 4 ° C. - Vask membranen 4 x i house-laget TBS + 0,1% polysorbat 20 (TBST) i 5 min med rocking på RT.
- Inkuber blot med fluorescerende sekundære antistoffer i produsenten angitt fortynninger (esel anti-kanin 680 og esel anti-mus) 1t på RT.
Merk: Fluorescerende sekundære antistoffer må beskyttes mot lys under både lagring og bruk. Utfører inkubasjon i mørke plast bokser eller dekk med aluminiumsfolie. - Vask membran 4 x med TBST for 5 min og vask med TBS for 5 min mens rocking på RT.
- Visualiser klatt på en fluorescerende Western blot tenkelig system for 2 min. visualisere anti-kanin 680 og anti-musen 800 sekundære antistoffer i 800 nm og 700 nm kanaler, henholdsvis.
Merk: Gjentak utføres uavhengig fra avsnitt 1. Er det nødvendig å kontrollere at antistoff signal svaret innenfor området som signal svaret er lineær for riktige data tolkning i disse eksperimentene.
- Fjern membran fra overføring apparater. Skyll kort med dH2O.
5. analyse og statistikk
- Åpne bilde av blot i en tenkelig programvare (Tabell for materiale). Anskaffe rå tettheten av endring-spesifikke band i vektor kontroll, TDP-43, og Fu (eller vektor kontroll og en synuclein) prøver, ved å tegne et rektangel som rammer bandet i analyse-modus.
- Gjenta trinn 5.1 for lasting kontroll band.
Merk: Det vil være en lasting kontrollere band og en endring-spesifikke i hver prøve. - Beregne relative tettheten av endring-spesifikke bandene ved hvert band med tettheten av tilsvarende bandet vektor kontroll prøven. Dette normaliserer dataene til kontrollen vektor.
- Beregne relative tettheten av lasting kontroll bandet ved hvert band med tettheten av tilsvarende lasting kontroll bandet vektor kontroll prøven.
- Beregne justert relative tettheten av hvert band ved endring-spesifikke bandet relativ tetthet over relativ tetthet av lasting kontroll bandet for hvert utvalg. Nå kan dataene visualiseres i histogram-skjemaet.
Merk: For enkel behandling, trinn 5.3-5.5 kan gjøres i et regneark (Ekstra fil). - Etter flere uavhengige gjentak, kjøre Welch's T-tester mellom to control prøvene og den aktuelle proteinopathy modell (kontroll mot Fu, kontroll versus TDP-43 og kontroll mot en synuclein) med p = 0,05 som cut-off for betydning .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Illustrere denne metoden, vil vi dra nytte av nylig publiserte resultatene30. WT menneskelige Fu og TDP-43 var overexpressed 5 h, mens WT α-synuclein var overexpressed 8 h. En ccdB konstruksjon ble brukt som en vektor negativ kontroll. Figur 2 viser vekst undertrykkelse i faste og flytende kulturer. Gjær ble slaktet som beskrevet og vestlige blotting med endring-spesifikke antistoffer ble utført. Anti-totalt H3 ble brukt som en lasting. En betydelig reduksjon i nivåene av H3S10ph og H3K14ac er tydelig i Fu overuttrykte modellen (figur 3ab). Det er betydelig økning i nivåene av acetylation på H4K12 og H4K16 i TDP-43 overuttrykte modell som ikke overholdes i enten FUS eller α-synuclein overuttrykte modell (Figur 3 cd). Det er også signifikant nedgang i nivåer av H3K36me2 og H2BT129ph i α-synuclein overuttrykte modell (figur 3ef).
Slik viser at endringen i histone PTMs samsvarer med mengden uttrykk for nevrodegenerative proteinopathy protein, stilles uttrykk for FUS ved å fremkalle protein uttrykk i varierende grad av galaktose (figur 4a). Galaktose er blandet med sukker i skiftende forhold slik at den totale konsentrasjonen av sukker er konstant på 2%, men mengden av galaktose er endret som resulterer i en rekke protein uttrykk nivå. I S. cerevisiae, metaboliseres sukrose sakte til glukose, som undertrykker galaktose induksjon31. Derfor sukrose verken aktiverer eller skjuler galaktose induksjon. Jo lavere beløp av galaktose brukt til å indusere Fu overuttrykte, ble mindre toksisitet observert i både faste og flytende kultur (figur 4bc). Viktigere, lavere nivået av Fu overuttrykte, mindre omfanget av reduksjonen i H3S10ph nivåer (Figur 4 d-f).
Figur 1: Methodoverview for karakterisering av endringer i histone post-translasjonell modifikasjoner koblet til neurodegenerative sykdom proteinopathies gjær modeller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: toksisitet knyttet overuttrykte nevrodegenerative proteinopathy-relaterte proteiner i gjær modeller. Småblødninger analyser viser cellen levedyktighet for gjær overexpressing vektor kontroll, TDP-43, Fu eller α-synuclein i nærvær av glukose (en) eller galaktose (b). (c) vekst kurve illustrerer celle levedyktighet i flytende kultur under galaktose induksjon. Feilfelt viser ± standardavviket. n = 3 for hver stamme. Gjentak resultatet helt uavhengig eksperimenter. Data tilpasset med tillatelse fra Chen, K. et al. Neurodegenerative sykdom Proteinopathies er koblet til forskjellige Histone Post-translational endring landskap. ACS kjemiske nevrovitenskap. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: endringer i histone post-translasjonell endringer knyttet overuttrykte nevrodegenerative proteinopathy-relaterte proteiner i gjær modeller. En Fu proteinopathy modell viser reduserte nivåer av (en) H3S10ph, n = 6, og (b) H3K14ac, n = 3. Derimot TDP-43 proteinopathy modell viser økte nivåer av (c) H4K12ac, n = 3, og (d) H4K16ac, n = 6, mens α-synuclein modell viser reduserte nivåer av (e) H3K36me2, n = 3, og (f) H2BT129ph, n = 7. Feilfelt viser + standardavvik. *, p < 0,05, ***, p < 0,001. Gjentak resultatet helt uavhengig eksperimenter. Data tilpasset med tillatelse fra Chen, K. et al. Neurodegenerative sykdom Proteinopathies er koblet til forskjellige Histone Post-translational endring landskap. ACS kjemiske nevrovitenskap. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: omfanget av nedgang i H3S10ph nivåer er knyttet til nivået av Fu overuttrykte. (en) tegneserie illustrasjon av sukrose og galaktose forhold til å justere mengden Fu overuttrykte. (b) Spotting analyser viser cellen levedyktighet i nærvær av varierende grad av galaktose. (c) vekst kurve i flytende kultur viser cellen levedyktighet i nærvær av varierende grad av galaktose. Feilfelt viser ± standardavvik. (d) representant immunoblots viser at FUS protein nivået stiger som cellene er utsatt for øker prosenter av galaktose. Phosphoglycerate kinase (PGK) ble brukt som en lasting. (e) representant immunoblots viser tilsvarende nedgang i H3S10ph nivåer med økende prosenter av galaktose. (f) kvantifisering histogram av (e). n = 3 for hvert vilkår. Feilfelt viser + standardavviket for kvantifisering diagram. Gjentak resultatet helt uavhengig eksperimenter. Data tilpasset med tillatelse fra Chen, K. et al. Neurodegenerative sykdom Proteinopathies er koblet til forskjellige Histone Post-translational endring landskap. ACS kjemiske nevrovitenskap. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her gir en enkel, hensiktsmessig og kostnadseffektiv måte å kategorisere genomet hele histone PTM endringer korrelert med nevrodegenerative proteinopathies. Det finnes andre modeller av ALS og PD, som i vitro modeller humane cellelinjer og Trouble32, S. cerevisiae fortsatt attraktive på grunn av sin brukervennlighet. For eksempel gjær modeller krever ikke bruk av steril hette, eller de krever intensiv trening som går langs med celle kultur arbeid. Videre er reagensene dyrking gjær også mye rimeligere enn pattedyr celle kultur forsyninger. Gjær modeller har blitt utnyttet til ikke bare avsløre de domene determinantene av protein aggregering22,23,24,25,26, men også har ført til avdekke genetisk risiko faktorer ALS27, samt modifikatorer protein aggregering toksisitet22. Videre har sletting av Set3, medlem av histone deacetylase kompleks, blitt funnet for å redusere TDP-43 toksisitet gjær33. Interessant, er våre funn i gjær med nyere rapporter på histone endring endringer i begge en Fu musemodell og en menneskelig SH-SY5Y Fu overuttrykte modell34,35. Videre nylig oppdaget endringer i DNA metylering mønstre rundt viktige PD gener, som SNCA og PARK2, støtte en rolle for epigenetics i PD36,37.
Her viser vi at disse gjær modellene kan også brukes til å oppdage hvordan nevrodegenerative proteinopathies sammen med epigenome30. Vi finner at forskjellige endringer i histone modifikasjoner er knyttet til hver proteinopathy modell. Protokollen skissert her tillater oss å bekrefte tidligere funn i andre modellsystemer. Mest bemerkelsesverdig, denne metoden har økt vår forståelse av epigenomic panorama nevrodegenerative sykdommer. Det utvidede settet med modifikasjoner presenteres her kunne avdekke romanen histone forfatter og viskelær mål for farmakologisk intervensjon. Disse resultatene markere mulige bidrag av histones PTMs og epigenetics i patologi ALS PD og andre nevrodegenerative sykdommer og kan gi romanen veier for behandling av disse sykdommene.
Spesiell omsorg må tas i trinn 1,9 og 1,10 når transformere gjær til overexpress nevrodegenerative proteinopathies. Nærmere bestemt legge reagenser i riktig rekkefølge under trinn 1,10 er nødvendig for å sikre høy transformasjon effektivitet. Videre er det svært viktig å plukke kolonien viser de fleste vekst undertrykkelse i galaktose. Man bør også være forsiktig ved montering Western sandwich. Utilsiktet tillegg av bobler mellom gel og membran vil sperre for overføring av protein og gi blokk flekker på blot som kan hindre dataanalyse.
En begrensning av denne protokollen er at antistoffer er begrenset til bare bindende og oppdager en eller to histone endringer samtidig. Det er også avgjørende for riktig standardisere prøver etter protein overuttrykte (trinn 3.4−3.6). Helt fjerne alle vekst medier sikrer at hver celle pellet vind opp resuspended i samme volum. Tilsvarende er det viktig å nøye aliquot samme mengde celle suspensjon i microcentrifuge rør (trinn 3.4). Hvis utvalgene ikke er riktig standardiserte, er det vanskelig å trekke noen konklusjoner fra endringer på histone PTM nivåer. Dette problemet vil bli synlig i avvik på nivåene av lasting kontroll av Western blot (inndelingen 4.2). For å bøte på dette kan en SDS side gel lastet med relevante eksempler være Coomassie farget, slik at for protein bandet kvantifisering av prøvene (del 5) og påfølgende re standardisering av eksempler basert på hvor mye protein tilstede på hvert utvalg.
Avslutningsvis lar denne protokollen for analyse av histone PTM endre forbundet med overuttrykte proteiner relatert til nevrodegenerative proteinopathies bare mindre enn to uker, fra transformasjon til statistisk analyse. Bortsett fra aktivering studiet av proteinopathies forbundet med nevrodegenerative sykdommer, kan denne generelle protokollen brukes å studere histone PTM endringer i noen gjær overuttrykte modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Royena Tanaz, Huda Yousuf og Sadiqa Taasen for teknisk hjelp. Vi er svært takknemlig til Prof James Shorter for sjenerøs levering av reagenser og intellektuell hjelp i utformingen av sukrose tuning eksperimenter. Gjær plasmider var en sjenerøs gave fra Prof Aaron Gitler (inkludert 303Gal-Fu; Addgene plasmider # 29614). Brooklyn College og den avanserte Science Research Center (CUNY) samt en NIH NINDS avansert postdoktor overgang Award (K22NS09131401) støttet M.P.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
- Beitz, J. M.
- Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
- Poewe, W., et al.
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
- Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
- King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
- Spillantini, M. G., et al.
- Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A.
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
- Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
- Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
- Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
- Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
- Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
- Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
- Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
- Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
- Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).
