Summary
Questo protocollo delinea le procedure sperimentali per caratterizzare il genoma cambiamenti nei livelli di modifiche post-traduzionali degli istoni (PTM) che si verificano in relazione la sovraespressione di proteine associate con ALS e malattia del Parkinson in Modelli di Saccharomyces cerevisiae . Dopo la separazione di SDS-PAGE, vengono rilevati livelli PTM istone individuali con gli anticorpi specifici di modifiche tramite Western blotting.
Abstract
Malattie neurodegenerative quali la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e malattia di Parkinson (MDP), causano la perdita di centinaia di migliaia di vite ogni anno. Mancano opzioni di trattamento efficace in grado di fermare la progressione di malattia. Nonostante gli sforzi di sequenziamento estesa in grandi popolazioni di pazienti, la maggior parte dei casi di SLA e PD rimanga inspiegabile mutazioni genetiche da solo. Meccanismi di Epigenetics, quali la modificazione post-traduzionale delle proteine istoniche, possono essere coinvolti nella progressione e nella eziologia di malattia neurodegenerative e portano a nuovi bersagli per l'intervento farmaceutico. Modelli di mammiferi in vivo e in vitro di ALS e PD sono costosi e richiedono spesso prolungati e laboriosi protocolli sperimentali. Qui, descriviamo un approccio pratico, veloce e conveniente per determinare alterazioni del genoma nei livelli di modifiche dell'istone usando Saccharomyces cerevisiae come sistema modello. Questo protocollo permette di complete indagini cambiamenti epigenetici collegati al proteinopathies neurodegenerative che confermano i risultati precedenti in sistemi diversi modello allargando significativamente la nostra conoscenza della neurodegenerative malattia epigenoma.
Introduction
Le malattie neurodegenerative sono malattie devastanti con poco o nessun opzioni di trattamento disponibili. Tra questi, la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e malattia di Parkinson (MDP) sono particolarmente terribile. Circa il 90% dei casi di SLA e PD sono considerati sporadici, che si verificano senza storia di famiglia della malattia, mentre i restanti casi funzionare in famiglie e sono generalmente collegati a un gene specifico mutazione1,2. Interessante, entrambe queste malattie sono associate con la proteina mislocalization e aggregazione3,4,5,6. Per esempio, fusa nel sarcoma (FUS) e proteina obbligatoria del DNA del catrame-43 (TDP-43) sono proteine che legano RNA che mislocalize nel citoplasma e aggregare in ALS7,8,9,10, 11,12, mentre α-synuclein è il componente di principio di aggregati proteici chiamati corpi di Lewy in PD5,13,14,15.
Nonostante gli sforzi di vasta associazione genome-wide in grandi popolazioni di pazienti, la stragrande maggioranza dei casi di SLA e PD rimanga inspiegabile geneticamente. Può l'epigenetica svolge un ruolo nella malattia neurodegenerative? Epigenetics comprende cambiamenti nell'espressione genica che si verificano senza cambiamenti a sottostante DNA sequenza16. Un meccanismo epigenetico principale comporta le modifiche post traduzionale (PTM) di istone proteine16. Nelle cellule eucariotiche, il materiale genetico è strettamente avvolto nella cromatina. L'unità di base della cromatina è il nucleosoma, composto da 146 paia di basi del DNA avvolto intorno un istone istonico, è composto da quattro coppie di istoni (due copie ciascuno degli istoni H2A, H2B, H3 e H4)17. Ogni istone ha una coda N-terminale che sporge fuori il nucleosoma e può essere modificato con l'aggiunta di vari moiety chimico, solitamente su di residui di lisina e arginina18. Questi PTMs sono dinamici, il che significa che possono essere facilmente aggiunti e rimossi e includere gruppi quali acetilazione, metilazione e fosforilazione. PTMs determinano l'accessibilità del DNA al macchinario trascrizionale e contribuire così controllo gene espressione18. Ad esempio, acetilazione dell'istone riduce la forza di interazione elettrostatica tra le proteine istoniche altamente basici e la spina dorsale del DNA caricata negativamente, permettendo i geni imballati da istoni acetilati di essere più accessibile e quindi altamente espresso19. Più recentemente, la notevole specificità biologica di PTMs particolare istone e loro combinazioni ha portato all'istone codice ipotesi20,21 in quali proteine che scrivere, cancellare e leggere istone PTMs tutti agiscono di concerto per modulano l'espressione genica.
Il lievito è un modello molto utile per studiare la neurodegenerazione. Soprattutto, molte vie cellulari neuronali sono conservate dal lievito per gli esseri umani22,23,24. Lievito ricapitolano citotossicità fenotipi e inclusioni di proteina all'iperespressione di FUS, TDP-43 o α-synuclein22,23,24,25,26. Infatti, i modelli di Saccharomyces cerevisiae di ALS sono stati utilizzati per identificare fattori di rischio genetici in esseri umani27. Inoltre, il lievito che overexpressing umano α-synuclein ammessi per la caratterizzazione della rete Rsp5 come bersaglio trattabili per migliorare la tossicità di α-synuclein in neuroni28,29.
Qui, descriviamo un protocollo sfruttando Saccharomyces cerevisiae per rilevare le modifiche PTM genoma istone connesse con proteinopathies neurodegenerative (Figura 1). L'uso di S. cerevisiae è molto attraente per la sua facilità d'uso, basso costo e velocità rispetto agli altri modelli in vitro ed animali di neurodegenerazione. Sfruttando precedentemente sviluppato ALS e PD modelli22,23,25,26, noi abbiamo sovraespresso umano FUS, TDP-43 e α-synuclein in lievito e scoperte distinte istone PTM trasformazioni che avvengono in connessione con ogni proteinopathy30. Il protocollo che descriviamo qui può essere completato in meno di due settimane dalla trasformazione all'analisi dei dati.
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Protocol
1. trasformare S. cerevisiae con costrutti di proteina associata proteinopathy neurodegenerative
- Crescere il lievito 303 wild type (WT) in brodo di lievito estratto peptone destrosio (YPD) pernottamento con agitazione (200 giri/min) a 30 ° C.
- Dopo 12−16 h di crescita, diluire il lievito a densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,25 con YPD. Come 10 mL di coltura liquida lievito saranno necessari per ogni trasformazione, preparare 50 mL di coltura liquida lievito per cinque trasformazioni corrispondente al FUS, TDP-43, a-sinucleina e vettore unico (ccdB) costrutti, come pure una trasformazione di controllo negativo senza DNA.
- Crescere il lievito con agitazione a 30 ° C fino a quando non viene raggiunto un OD600 tra 0,60 e 0,80. Questa operazione richiede generalmente 4−6 h.
- Trenta minuti prima del completamento, crescita del lievito linearizzare plasmide costrutti.
Nota: I costrutti di plasmide usati qui devono essere integrati direttamente nel genoma, e quindi la linearizzazione è necessaria prima della trasformazione.- Calcolare il volume di stock di plasmide che ammonta a 1 µ g. Sottrai questo volume da 44 µ l per calcolare la quantità di nucleasi gratuito H2O necessario.
- Aggiungere un tubo del microcentrifuge nucleasi gratuito H2O, 5 µ l di tampone di 10 x enzima di restrizione (Tabella materiali), 1 µ l di enzima di restrizione NheI (Tabella materiali) e la giusta quantità di plasmide (calcolato in punto 1.4.1). Mescolare accuratamente pipettando su e giù e incubare a 37 ° C per 15 min. Il plasmide è ora linearizzata e pronta per la trasformazione.
- Dopo lievito cultura raggiunge un OD600 0.6-0.8, raccolto le cellule in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 850 x g a 4 ° C per 3 min. Discard surnatante.
- Lavare il pellet cellulare in 10 mL di H2O sterile e centrifugare a 850 x g a 4 ° C per 3 min. Discard surnatante. Ripetere 3 volte per un totale di quattro lavaggi.
- All'inizio del terzo lavaggio, scongelare e bollire 10 µ l di DNA dello sperma salmone per reazione di trasformazione per 5 minuti su un blocco di riscaldamento.
- Risospendere il pellet cellulare in 100 µ l di dH2O a trasformazione e diviso in numero adeguato di microcentrifuga. Risospendere il pellet in 500 µ l di dH2O cinque trasformazioni e dividere in modo uniforme in cinque distinti per microcentrifuga.
- Centrifugare per 5 min a 850 x g a temperatura ambiente (TA) e togliere tutta l'acqua rimanente.
- Aggiungere, nel seguente ordine, 50 µ l di sterile di H2O, 240 µ l di 50% glicole polietilenico (PEG), 36 µ l di 1 M LiAc, 10 µ l di DNA dello sperma di salmone, 20 µ l di DNA del plasmide linearizzato (o nucleasi acqua gratuita per nessuna trasformazione di controllo del DNA). Miscelare accuratamente dopo ogni aggiunta e vortexare brevemente dopo avere aggiunto tutti i componenti di trasformazione.
- Incubare le reazioni di trasformazione a 42 ° C per 20 min.
Nota: Eseguire questa incubazione a bagnomaria per controllo di temperatura più costante. - Centrifugare a 470 x g a RT per 5 min. Discard surnatante e risospendere ogni cella in 200 µ l di sterile H2O.
- Piastra di sospensione di lievito su piastre di terreni selettivi e diffondere con perle di rotolamento o una spatola. Incubare le piastre per 2−3 giorni a 30 ° C.
Nota: Sintetico-definito (SD)-dei suoi piatti sono utilizzati per i plasmidi descritti qui.
2. rilievo di soppressione della crescita di Colonia e lo stoccaggio delle scorte di glicerolo
- Inoculare singole colonie da piastre di trasformazione in 5 mL di terreni selettivi, completati con il raffinosio 2%. Crescere su un agitatore a 30 ° C durante la notte. Selezionare almeno 12 colonie per trasformazione.
Nota: Nessun colonie sono attesi nella piastra di controllo di trasformazione "Nessun DNA". - Sterilizzare il perno-frogger con etanolo, seguita da fiammeggiante.
- Per ogni cultura, aliquota 100 µ l di sospensione cellulare saturi nella prima riga di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 200 µ l di sterile H2O in tutti i pozzetti delle colonne bene adiacenti. Per diluizioni seriali 1:5, aggiungere 50 µ l dalla prima colonna a colonna adiacente dietro con pipetta multicanale. Mescolare accuratamente pipettando. Quindi aggiungere 50 µ l dalla seconda colonna per la terza colonna e mescolare pipettando. Ripetere questa operazione per il resto della piastra.
- Lievito di piastra posizionando frogger in una piastra a 96 pozzetti e poi timbra premendo delicatamente e uniformemente verso il basso su piastre di terreni selettivi con o senza galattosio. Incubare a 30 ° C per 2−3 giorni.
Nota: SD-His e SGal-i suoi piatti sono utilizzati per i plasmidi descritti qui. - Per FUS, TDP-43 e trasformazioni a-sinucleina, identificano la Colonia visualizzati dalla maggior parte la soppressione della crescita in presenza di galattosio. Selezionare questa colonia dalla piastra di SD-His e inoculare in 10 mL di terreni selettivi, completati con il raffinosio 2% per la crescita durante la notte. Per il controllo di vettore, scegli una colonia visualizzati da nessuna soppressione di crescita in presenza di galattosio.
- Per preparare scorte di glicerolo, combinare 0,5 mL di coltura liquido saturo con 0,5 mL di glicerolo al 50%. Mescolare pipettando su e giù e congelare a-80 ° C.
Nota: Scorte di glicerolo possono essere conservate per un anno a-80 ° C.
3. la sovraespressione di proteinopathy neurodegenerative associate proteine in S. cerevisiae
- Dalle scorte di glicerolo congelati, ri-striscia di lievito su istidina, 2% glucosio agar selettivo media piastre e incubazione a 30 ° C per 2−3 giorni.
- Inoculare singole colonie per ognuno dei modelli di sovraespressione e controllo in 5 mL di liquidi selettiva di istidina completati con 2% raffinosio. Crescere con agitazione (200 giri/min) a 30 ° C durante la notte.
- 100 mL di coltura liquida di crescere per ognuno dei modelli di sovraespressione e controlli (FUS, TDP-43 e vettore di controllo; controllo a-sinucleina e vettoriale).
- Preparare 100 mL di coltura in terreni selettivi completato con 2% di galattosio.
- Misurare il OD600 di culture durante la notte e calcolare l'importo di una notte cultura necessaria per eseguire il rendering di culture di sovraespressione a una partenza OD600 di 0,3. In genere, durante la notte culture raggiungerà un OD600 di 0.9−10, che richiedono circa 5 mL di coltura durante la notte per iniziare 100 mL di coltura fresca.
- Indurre la sovraespressione della proteina da una crescente lievito sui media di galattosio (Vedi punto 3.3.1) per 5 h (FUS e TDP-43) o 8 h (a-sinucleina) con agitazione a 30 ° C.
- Misura OD600 di ogni cultura alla fine del periodo di induzione. Standardizzare tutti i conteggi delle cellule per il valore di600 OD più basso. Cultura in provette da 50 mL di raccolta mediante centrifugazione a 850 x g per 5 min a 4 ° C. Gettare il surnatante.
Nota: Se i valori di600 OD misurati alla conclusione di induzione sono 0.654 e 0.984, rispettivamente, per 100 mL di un-synuclein cultura e 100 mL di coltura di controllo, raccogliere 95 mL della cultura a-sinucleina e 67,1 mL di coltura di controllo. - Risospendere il pellet in 1 mL di sterile dH2O per ogni 10 mL di cultura cresciuta. Pellet di Spalato uniformemente di aliquotare 1 mL di risospensione delle cellule in microcentrifuga. Ad esempio, se a partire da 100 mL di cultura, risospendere il pellet in 10 mL di sterile dH2O e dividerlo in 10 per microcentrifuga.
- Centrifugare a 850 x g per 5 min a 4 ° C, quindi rimuovere il surnatante. Snap congelare palline delle cellule in azoto liquido e conservare a-80 ° C.
Nota: Palline delle cellule possono essere memorizzati a-80 ° C fino ad un anno.
4. cellula Lisi e western blotting per rilevare modifiche post-traduzionali degli istoni
- Lisi delle cellule
- Scongelare il pellet di cellule di lievito sul ghiaccio e risospendere il pellet cellulare in 100 µ l di dH2O.
- La risospensione delle cellule, aggiungere 300 µ l di NaOH M 0,2 e 20 µ l di 2-mercaptoetanolo. Risospendere pipettando su e giù.
- Incubare le cellule in ghiaccio per 10 min e poi Centrifugare a 3.200 x g su una centrifuga da tavolo per 30 s a RT. Discard surnatante.
- Risospendere le cellule in 100 µ l di 1 x caricamento tintura e far bollire per 10 minuti in un blocco di riscaldamento.
Nota: La ricetta per 6x loading dye è reperibile nella Tabella materiali.
- Trasferimento elettroforesi dodecilica del gel di poliacrilammide del solfato di sodio e membrana
- Preparare gel camera inserendo due gel in un gel di titolare e riempimento camera interna verso l'alto con tampone di corsa e la camera esterna al contrassegno due gel linea di riempimento.
- Caricare 15 µ l di campione dal punto 4.1.4 per pozzetto in un gel di poliacrilammide del 12% 10 pozzetti. Per la corsia di scaletta di proteina, caricare 5 µ l.
- Esegua il gel per circa 45 min a 150 V, o fino a quando la parte anteriore della tintura di caricamento raggiunge il fondo del gel.
- Mentre il gel è in esecuzione, preparare per il trasferimento di membrana da ammollo pastiglie di fibra (due per gel) in tampone di trasferimento (Tabella materiali) e ammollo membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF) in metanolo. Sciacquare membrana in tampone di trasferimento prima del trasferimento.
Nota: La membrana PVDF deve essere tagliato alle dimensioni del gel e utilizzare una membrana PVDF per ogni gel trasferiti. - Assemblare, il cellulare di apparato di trasferimento semi-asciutto, un 'sandwich' di trasferimento: da elettrodo inferiore, inserire pad (1) imbibite fibra, membrana PVDF (2) imbibita e sciacquata, (3) gel dal punto 4.2.3 e (4) un secondo pad imbibite di fibra.
Nota: Assicurarsi di evitare bolle d'aria nel trasferimento 'sandwich'. Ruotate leggermente 'sandwich' con pipetta sierologica per forzare fuori le bolle. Una volta che il gel è stato posizionato sopra la membrana PDVF, assicurarsi di non spostarla. - Svolgere la proteina di trasferimento impostando alimentatore a 150 mA per 1 h (per un ' sandwich').
- Rilevamento dell'istone PTMs con gli anticorpi specifici di modifica
- Rimuovere la membrana dall'apparato di trasferimento. Sciacquare brevemente con dH2O.
- Facoltativamente, selezionare il trasferimento delle proteine con la macchia di Ponceau S versando abbastanza macchia, Ponceau S per coprire la membrana in una piccola scatola di plastica e incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 30−60 s. rimuovere Ponceau-S macchia e risciacquare con dH2O fino a quando la macchia di sfondo scompare e fasce della proteina sono visibili ad occhio nudo. Continuare a sciacquare con dH2O fino a quando ogni macchia viene rimossa dalla membrana.
- Bloccare membrana incubando blot per 1h a RT con dolce dondolo con tris buffered saline (TBS) tampone bloccante (Tabella materiali) in una piccola scatola di colorazione. Usare abbastanza tampone bloccante per coprire la macchia.
Nota: Fare attenzione a posto membrana verticale nella finestra di colorazione, in modo che il lato di membrana su cui si trovano proteine non è rivolto verso il basso. - Incubare la macchia nella finestra colorazione durante la notte con un anticorpo di modifica specifico istone reattivo verso lievito a 4 ° C. Diluire l'anticorpo in tampone bloccante TBS secondo le specifiche del produttore. Includono anche un controllo caricamento nucleare corretto, ad esempio anti-totale H3 generato in una specie di host diverso dall'anticorpo modifiche specifiche. Per esempio, se sondando per H3S10ph con un anticorpo anti-H3S10ph generato nel coniglio, usare un anticorpo di H3 anti-totale generato in mouse come un controllo di carico. Ripetere questa operazione per ogni macchia come necessario.
Nota: Diluizioni di anticorpo possono essere riutilizzati per un totale di tre volte entro un mese. Conservare a 4 ° C. - Lavare la membrana 4 x in casa-fatta TBS + 0.1% polisorbato 20 (TBST) per 5 min con dondolo a TA.
- Incubare blot con anticorpi fluorescenti secondari alle diluizioni produttore specificato (asino anti-coniglio 680 e anti-topo di asino) per 1 h a TA.
Nota: Fluorescenti anticorpi secondari devono essere protetti dalla luce durante il deposito sia di utilizzo. Eseguire incubazione in scatole di plastica scuri o coprire con carta stagnola. - Lavare la membrana 4 x con TBST per 5 minuti e lavare con TBS per 5 min mentre a dondolo a TA.
- Visualize macchia su un Western blot fluorescenti imaging sistema per 2 min. visualizzare l'anti-coniglio 680 e anticorpi secondari anti-topo 800 a 800 nm e 700 nm canali, rispettivamente.
Nota: Replica è condotte in modo indipendente a partire dalla sezione 1. È necessario verificare che la risposta del segnale anticorpo sia all'interno della gamma sopra che la risposta del segnale è lineare per l'interpretazione di dati appropriato in questi esperimenti.
- Rimuovere la membrana dall'apparato di trasferimento. Sciacquare brevemente con dH2O.
5. analisi dei dati e statistiche
- Apri immagine della macchia in un software di imaging (Tabella materiali). Acquisire la densità grezza dei campioni di fasce di modifiche specifiche nel vector control, TDP-43 e FUS (o controllo vettoriale e un-synuclein), disegnando un rettangolo che delimita la banda in modalità di analisi.
- Ripetere il passaggio 5.1 per il caricamento di bande di controllo.
Nota: Ci sarà un caricamento banda e una modifica specifica in ciascun campione di controllo. - Calcolare la densità relativa delle bande specifiche modifiche dividendo ogni banda per la densità della banda corrispondente in esempio di controllo vettoriale. Questo normalizza i dati al controllo vettoriale.
- Calcolare la densità relativa del caricamento di banda di controllo, dividendo ogni banda per la densità di carico corrispondente banda di controllo del campione di controllo di vettore.
- Calcolare la densità relativa rettificata di ciascuna banda dividendo la densità relativa della band modifiche specifiche sopra la densità relativa del caricamento banda di controllo per ciascun campione. Ora, i dati possono essere visualizzati in forma di istogramma.
Nota: Per facilità di lavorazione, passaggi 5.3 – 5.5 possono essere fatto in un foglio di calcolo (File supplementare). - Dopo replicati più indipendente, T-test di esecuzione Welch tra i campioni di due controllo e l'appropriato proteinopathy modellano (controllo contro FUS, controllo contro TDP-43 e controllo rispetto a-sinucleina) con p = 0.05 come il taglio per il significato .
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Representative Results
Per illustrare questo metodo, ci si avvarrà dei risultati recentemente pubblicati30. WT umano FUS e TDP-43 overexpressed per 5 h, mentre WT α-synuclein overexpressed per 8 h. Un costrutto ccdB è stato usato come controllo negativo vettoriale. La figura 2 Mostra la soppressione della crescita nelle culture di solide e liquide. Lievito è stato raccolto come descritto e Western blotting con anticorpi specifici per modifica è stata effettuata. Anti-totale H3 è stato usato come un controllo di carico. Il modello di sovraespressione di FUS (Figura 3ab) emerge una diminuzione significativa nei livelli di H3S10ph e H3K14ac. Non ci sono aumenti significativi nei livelli di acetilazione su H4K12 e H4K16 nel modello di sovraespressione di TDP-43 che non sono osservate in entrambi le unità follicolari o modello di sovraespressione di α-synuclein (Figura 3 cd). Ci sono anche diminuzioni significative nei livelli di H3K36me2 e H2BT129ph nel modello di sovraespressione di α-synuclein (Figura 3ef).
Per mostrare che la variazione dell'istone PTMs correla con la quantità di espressione della proteina proteinopathy neurodegenerative, l'espressione di unità follicolari possa essere ottimizzata inducendo l'espressione della proteina in diversi livelli di galattosio (Figura 4a). Galattosio è mescolato con saccarosio in modificando i rapporti in modo che la concentrazione totale di zucchero è costante al 2%, ma la quantità di galattosio viene modificata risultante in una gamma di livelli di espressione della proteina. In S. cerevisiae, saccarosio è lentamente metabolizzato a glucosio, che sopprime il galattosio induzione31. Quindi, saccarosio attiva né sopprime l'induzione di galattosio. Minore la quantità di galattosio usato per indurre iperespressione di FUS, la meno tossicità è stata osservata nella cultura sia solida che liquida (Figura 4bc). Cosa importante, il più basso il livello di sovraespressione di FUS, minore la grandezza della riduzione nei livelli di H3S10ph (Figura 4 d-f).
Figura 1: Methodoverview per la caratterizzazione dei cambiamenti nelle modificazioni post-traduzionali degli istoni collegato al proteinopathies di malattia neurodegenerative in modelli di lievito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: tossicità associata con sovraespressione di proteine in relazione con proteinopathy neurodegenerative in modelli di lievito. Saggi di spotting Visualizza attuabilità delle cellule di lievito che overexpressing il controllo vettoriale, TDP-43, FUS o α-synuclein in presenza di glucosio (un) o galattosio (b). (c) crescita curva illustrando attuabilità delle cellule in coltura liquida sotto induzione di galattosio. Barre di errore indicano ± deviazione standard. n = 3 per ogni sforzo. Replica il risultato di esperimenti completamente indipendenti. Dati adattati con permesso da Chen, K. et al. Neurodegenerative malattia Proteinopathies sono collegati a distinte istone Post-translational modifica paesaggi. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cambiamenti nelle modificazioni post-traduzionali degli istoni associate con sovraespressione di proteine in relazione con proteinopathy neurodegenerative in modelli di lievito. Un modello di proteinopathy FUS Mostra i livelli in diminuzione di (un) H3S10ph, n = 6 e (b), H3K14ac, n = 3. Al contrario, un modello di proteinopathy di TDP-43 Mostra i livelli aumentati di (c), H4K12ac, n = 3 e (d), H4K16ac, n = 6, mentre un modello di α-synuclein Mostra la diminuzione dei livelli di (e), H3K36me2, n = 3 e (f), H2BT129ph, n = 7. Barre di errore Visualizza + deviazione standard. *, p < 0,05, * * *, p < 0,001. Replica il risultato di esperimenti completamente indipendenti. Dati adattati con permesso da Chen, K. et al. Neurodegenerative malattia Proteinopathies sono collegati a distinte istone Post-translational modifica paesaggi. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: misura di diminuzione nei livelli di H3S10ph è legata al livello di sovraespressione di FUS. (un) fumetto illustrazione dell'uso di saccarosio e galattosio rapporti per ottimizzare la quantità di sovraespressione di FUS. saggi di Spotting (b) risultati di attuabilità delle cellule in presenza di diversi livelli di galattosio. curva (c) crescita in coltura liquida, mostrando la vitalità cellulare in presenza di diversi livelli di galattosio. Barre di errore indicano ± deviazione standard. (d), rappresentante immunoblots mostrando che la proteina FUS livelli aumento, come le cellule sono esposte ad incrementare i rapporti di galattosio. Chinasi di Phosphoglycerate (PGK) è stata usata come un controllo di carico. (e), rappresentante immunoblots visualizzando corrispondenti diminuzioni nei livelli di H3S10ph con l'aumento di rapporti di galattosio. istogramma (f) quantificazione della (e). n = 3 per ogni condizione. Barre di errore indicano + deviazione standard per grafico di quantificazione. Replica il risultato di esperimenti completamente indipendenti. Dati adattati con permesso da Chen, K. et al. Neurodegenerative malattia Proteinopathies sono collegati a distinte istone Post-translational modifica paesaggi. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo descritto qui fornisce un modo semplice, conveniente e redditizio di categorizzare i cambiamenti PTM istone genoma correlati con proteinopathies neurodegenerative. Mentre ci sono altri modelli di ALS e PD, come in vitro murino e linee cellulari umane modelli32, S. cerevisiae rimane attraente per la sua facilità d'uso. Per esempio, modelli di lievito non richiedono l'uso di una cappa sterile, né richiedono l'allenamento che intensivo va con il lavoro della coltura delle cellule. Inoltre, i reagenti per la coltura di lievito sono anche molto più accessibili di forniture di cultura di cellule di mammifero. Modelli di lievito sono state sfruttate per non solo rivelano le determinanti di dominio della proteina aggregazione22,23,24,25,26, ma inoltre hanno portato a scoprire rischio genetico fattori in ALS27, così come modificatori di proteina aggregazione tossicità22. Inoltre, l'eliminazione di Set3, un membro del deacetylase dell'istone complesso, è stato trovato per ridurre la tossicità della TDP-43 in lievito33. Interessante, i nostri risultati in lievito sono d'accordo con i rapporti recenti sulle alterazioni di modifiche dell'istone in entrambi un modello di topo FUS e in un umano SH-SY5Y FUS sovraespressione modello34,35. Inoltre, recentemente scoperto le alterazioni nella metilazione del DNA nei dintorni di geni chiave del PD, come SNCA e PARK2, sostengono un ruolo per l'epigenetica in PD36,37.
Qui, indichiamo che questi modelli di lievito possono essere utilizzati anche per scoprire come proteinopathies neurodegenerative interagiscono con l' epigenoma30. Troviamo che i cambiamenti distinti in modificazioni istoniche sono associati con ogni modello di proteinopathy. Il protocollo qui delineato permette di confermare i risultati precedenti in altri sistemi-modello. Il più notevolmente, questo metodo ha aumentato la nostra comprensione del panorama epigenomic della malattia neurodegenerative. Il set esteso di modifiche presentate qui potrebbe scoprire gli obiettivi istone romanzo di scrittore e gomma per intervento farmacologico. Questi risultati evidenziano il possibile contributo degli istoni PTMs ed epigenetics in patologia di ALS, PD e altre malattie neurodegenerative e potrebbero fornire nuovi viali per il trattamento di queste malattie.
Particolare cura deve essere presa in passaggi 1.9 e 1.10 durante la trasformazione di lievito ai overexpress neurodegenerative proteinopathies. In particolare, aggiunta di reagenti nell'ordine corretto durante il passaggio 1.10 è necessario garantire efficienza di trasformazione alta. Inoltre, è molto importante scegliere la Colonia visualizzazione la maggior parte la soppressione della crescita in galattosio. Dovrebbe anche prestare attenzione durante il montaggio il panino di Western. Aggiunta accidentale di bolle tra il gel e la membrana sarà bloccare il trasferimento della proteina e fornire punti di blocco sulla macchia che può ostacolare l'analisi dei dati.
Una limitazione di questo protocollo è che gli anticorpi sono limitati a solo vincolanti e rilevare le modifiche dell'istone di uno o due alla volta. È anche cruciale standardizzare correttamente i campioni dopo sovraespressione della proteina (passi 3.4−3.6). Rimuovere completamente tutta la crescita media farà in modo che ogni pellet cellulare finisce risospese nello stesso volume. Allo stesso modo, è importante aliquota attentamente la stessa quantità di sospensione cellulare nelle provette microcentrifuga (punto 3.4). Se i campioni non sono correttamente standardizzati, è difficile trarre conclusioni da eventuali modifiche sui livelli di istone PTM. Un problema del genere sarebbe diventato apparente discrepanze sui livelli del controllo caricamento del Western blot (vedere paragrafo 4.2). Per risolvere questo problema, un gel di SDS-PAGE caricato con campioni pertinenti possono essere Coomassie macchiati, consentendo la quantificazione di banda di proteine dei campioni (sezione 5) e successiva ri-standardizzazione dei campioni in base alla quantità di proteine presenti su ciascun campione.
In conclusione, questo protocollo permette l'analisi dei cambiamenti PTM istone connessi con la sovraespressione di proteine legate alla proteinopathies neurodegenerative in poco meno di due settimane, dalla trasformazione ad analisi statistica. Oltre a consentire lo studio di proteinopathies associati con malattie neurodegenerative, questo protocollo generale utilizzabile per studiare le alterazioni di PTM istone in qualsiasi modello di sovraespressione di lievito.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Royena Tanaz, Huda Yousuf e Sadiqa Taasen per assistenza tecnica. Siamo molto grati al Prof James Shorter per la generosa fornitura di reagenti e intellettuale assistenza nella progettazione di esperimenti di ottimizzazione di saccarosio. Plasmidi di lievito sono stati un dono generoso da Prof. ssa Aaron Gitler (tra cui 303Gal-FUS; Plasmide Addgene # 29614). Brooklyn College e il centro di ricerca scienza avanzata (CUNY), nonché un NIH NINDS Postdoctoral transizione premio Advanced (K22NS09131401) supportato M.P.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
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