Summary
Detta protokoll beskriver experimentella procedurer för att karakterisera genome-wide förändringar i nivåerna av Histon post-translationella modifieringar (PTM) som förekommer i samband med överuttryck av proteiner associerade med ALS och Parkinsons sjukdom i Saccharomyces cerevisiae modeller. Efter SDS-PAGE separation upptäcks enskilda Histon PTM halter med modifiering-specifika antikroppar via Western blotting.
Abstract
Neurodegenerativa sjukdomar, såsom amyotrofisk lateralskleros (ALS) och Parkinsons sjukdom (PD), orsaka förlusten av hundratusentals liv varje år. Effektiva behandlingsalternativ kunna stoppa sjukdomsprogression saknas. Trots de omfattande sekvensering ansträngningarna i stora patientgrupper förblir merparten av ALS och PD fall oförklarad av genetiska mutationer ensam. Epigenetik mekanismer, såsom posttranslationella modifieringen av Histon proteiner, kan vara inblandade i neurodegenerativa sjukdomen etiologi och progression och leda till nya mål för farmaceutiska intervention. Från däggdjur in vivo och in vitro-modeller av ALS och PD är kostsamma och kräver ofta långvarig och mödosam experimentella protokoll. Här beskriver vi en praktisk, snabb och kostnadseffektiv metod att fastställa genome-wide förändringar i Histon modifiering nivåer med hjälp av Saccharomyces cerevisiae som modellsystem. Detta protokoll möjliggör omfattande utredningar av epigenetiska förändringar ansluten till neurodegenerativa proteinopathies som styrker tidigare fynd i olika modellsystem samtidigt avsevärt utvidga vår kunskap om den neurodegenerativa sjukdomen epigenomet.
Introduction
Neurodegenerativa sjukdomar är förödande sjukdomar med liten eller ingen behandlingsalternativ som är tillgängliga. Bland dessa är amyotrofisk lateralskleros (ALS) och Parkinsons sjukdom (PD) särskilt fruktansvärda. Cirka 90% av ALS och PD fall anses sporadisk, som inträffar utan hereditet för sjukdomen, medan de återstående fallen köras i familjer och allmänhet är kopplade till en specifik gen mutationen1,2. Intressant, är båda dessa sjukdomar associerade med protein mislocalization och aggregering3,4,5,6. Till exempel säkrade i sarkom (FUS) och tjära DNA-bindande protein 43 (TDP-43) är RNA-bindande proteiner som mislocalize till cytoplasman och aggregera i ALS7,8,9,10, 11,12, medan α-synuclein är komponenten principen av proteinhaltiga aggregat kallas Lewy organ i PD5,13,14,15.
Trots de omfattande genome-wide association ansträngningarna i stora patientgrupper förblir den överväldigande majoriteten av ALS och PD fall oförklarad genetiskt. Epigenetik kan spela en roll i neurodegenerativ sjukdom? Epigenetik består av förändringar i genuttryck som inträffar utan ändringar till underliggande DNA sekvens16. En huvudsakliga epigenetisk mekanism innebär de inlägget translationella modifieringar (PTMs) Histon proteiner16. I eukaryota celler, är genetiskt material tätt insvept i kromatin. Basenheten kromatin är den nukleosomens, som består av 146 baspar av DNA lindad runt en Histon octamer, består av fyra par histoner (två kopior varje av histoner H2A, H2B, H3 och H4)17. Varje Histon har en N-terminal svans som sticker ut ur nukleosomens och kan ändras genom tillägg av olika kemiska beståndsdelarna, oftast på lysin och arginin rester18. Dessa PTMs är dynamiska, vilket innebär att de kan enkelt läggas till och tas bort och inkluderar grupper såsom Acetylering, metylering och fosforylering. PTMs styr tillgängligheten av DNA på transkriptionell maskinen och därmed hjälpa kontroll gen uttryck18. Till exempel Histon Acetylering minskar styrkan av elektrostatiska samverkan mellan mycket grundläggande Histon proteinet och negativt laddade DNA ryggraden, så att de gener som packad av Acetylerade histoner vara mer tillgängliga och därmed mycket uttryckte19. Mer nyligen, anmärkningsvärda biologiska specificiteten av viss Histon PTMs och deras kombinationer har lett till Histon kod hypotes20,21 i vilka proteiner som skriva, radera och läsa Histon PTMs alla agera i samförstånd för att modulera genuttryck.
Jäst är en mycket användbar modell för att studera neurodegeneration. Ännu viktigare, bevaras många neuronala cellulära vägar från jäst till människor22,23,24. Jästen recapitulate cytotoxicitet fenotyper och protein inneslutningar vid överuttryck av FUS, TDP-43 eller α-synuclein22,23,24,25,26. I själva verket har Saccharomyces cerevisiae modeller av ALS använts för att identifiera genetiska riskfaktorer i människor27. Dessutom jäst överuttryck mänskliga α-synuclein tillåtet för karakterisering av Rsp5 nätverket som ett druggable mål att lindra α-synuclein toxicitet i nervceller28,29.
Här beskriver vi ett protokoll som utnyttjar Saccharomyces cerevisiae för att upptäcka genome-wide Histon PTM förändringar i samband med neurodegenerativa proteinopathies (figur 1). Användning av S. cerevisiae är mycket attraktiva på grund av dess användarvänlighet, låga kostnader, och hastighet jämfört med andra in vitro och djur modeller för neurodegeneration. Utnyttja tidigare utvecklat ALS och PD modeller22,23,25,26, vi har i ökad utsträckning mänskligt FUS, TDP-43 och α-synuclein i jäst och avtäckta distinkta Histon PTM förändringar som sker i i samband med varje proteinopathy30. Det protokoll som vi beskriver här kan utföras i mindre än två veckor från omvandling till dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. omvandla S. cerevisiae med neurodegenerativa proteinopathy-associerade protein konstruktioner
- Växa vildtyp (WT) 303 jäst i jäst extrakt pepton dextros (YPD) buljong över natten med skakningar (200 rpm) vid 30 ° C.
- Efter 12−16 h tillväxt, späd jäst till en optisk densitet på 600 nm (OD600) 0,25 med YPD. Som 10 mL flytande jästkultur kommer att behövas för varje omformning, förbereda 50 mL flytande jästkultur för fem transformationer motsvarar FUS, TDP-43, a-synuclein, och vector endast (ccdB) konstruktioner, samt en negativ kontroll omvandling utan DNA.
- Odla jäst med agitation vid 30 ° C tills en OD600 mellan 0,60 och 0,80 nås. Detta tar vanligtvis 4−6 h.
- Trettio minuter innan jäst tillväxt är klar, linjär plasmid konstruktioner.
Obs: Plasmid konstruktioner används här måste integreras direkt i genomet, och därmed Linearisering krävs före omvandling.- Beräkna volymen av Plasmiden lager som uppgår till 1 µg. subtrahera denna volym från 44 µL till beräkna mängden nuclease gratis H2O behövs.
- Tillsätt nuclease gratis H2O, 5 µL 10 x restriktionsenzym buffert (Tabell för material), 1 µL restriktionsenzym för NheI (Tabell av material) och lämplig mängd plasmid (beräknade i steg 1.4.1) i en mikrocentrifug rör. Blanda omsorgsfullt genom pipettering upp och ner och inkubera vid 37 ° C i 15 min. Plasmiden är nu linearized och redo för transformation.
- Efter jäst når kultur en OD600 av 0,6-0,8, skörd celler i en 50 mL konisk tub och varva ner på 850 x g vid 4 ° C för 3 min. Kassera supernatanten.
- Tvätta cellpelleten i 10 mL sterilt H2O och centrifugera vid 850 x g vid 4 ° C i 3 min. Kassera supernatanten. Upprepa 3 x för sammanlagt fyra tvättar.
- I början av den tredje tvätten, Tina och koka 10 µL av lax spermier DNA per omvandling reaktion för 5 min på en värmeblocket.
- Återsuspendera cellpelleten i 100 µL av dH2O per omvandling och delas upp i lämpligt antal mikrocentrifugrör. För fem transformationer, återsuspendera pelleten i 500 µL av dH2O och dela jämnt i fem separata mikrocentrifugrör.
- Centrifugera i 5 min på 850 x g i rumstemperatur (RT) och ta bort allt återstående vatten.
- Lägga till 50 µL sterilt H2O, 240 µL av 50% polyetylenglykol (PEG), 36 µL av 1 M LiAc, 10 µL av lax spermier DNA, 20 µL av linearized plasmid DNA (eller nuclease gratis vatten för ingen DNA kontroll omvandling), i följande ordning. Blanda noggrant efter varje tillsats och vortex kort efter alla omvandling komponenter har lagts.
- Inkubera omvandling reaktioner vid 42 ° C i 20 min.
Obs: Genomföra denna inkubation i vattenbad för jämnare temperaturkontroll. - Centrifugera vid 470 x g vid RT för 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera varje cellpelleten i 200 µL sterilt H2O.
- Tavla jästsuspension på selektiva medier plattor och sprida med rullande pärlor eller spridare. Inkubera plattorna i 2−3 dagar vid 30 ° C.
Obs: Syntetiska definierade (SD)-hans plattor används för de plasmider som beskrivs här.
2. lantmäteri kolonin tillväxt suppression och lagring i glycerol bestånd
- Inokulera enstaka kolonier från omvandling plåtar i 5 mL selektiva media kompletteras med 2% raffinos. Växer på en shaker vid 30 ° C över natten. Välj minst 12 kolonier per omvandling.
Obs: Inga kolonier förväntas i ”ingen DNA” transformation kontrollplattan. - Sterilisera pin-frogger med etanol, följt av flammande.
- För varje kultur, alikvotens 100 µL av mättade cellsuspension på den första raden i en plattan med 96 brunnar. Tillsätt 200 µL av sterila H2O i alla brunnar i de intilliggande väl kolumnerna. För 1:5 seriespädningar, tillsätt 50 µL från den första kolumnen till den angränsande kolumnen bakom med flerkanaliga Pipettera. Blanda omsorgsfullt genom pipettering. Sedan lägga till 50 µL från den andra kolumnen i tredje kolumnen och mix av pipettering. Upprepa detta för resten av plattan.
- Plattan jäst genom att placera frogger i en plattan med 96 brunnar och sedan stämpling av jämnt och försiktigt trycka ned på selektiva medier plattor med och utan galaktos. Inkubera vid 30 ° C för 2−3 dagar.
Obs: SD-hans och SGal, hans plattor används för de plasmider som beskrivs här. - För FUS, TDP-43 och a-synuclein transformationer, identifiera kolonin visar de flesta tillväxt dämpningen i närvaro av galaktos. Välj denna koloni från SD-hans plattan och Inokulera i 10 mL av selektiva media kompletteras med 2% raffinos för övernattning tillväxt. För vector kontroll, plocka en koloni som visar ingen tillväxt suppression i närvaro av galaktos.
- För att förbereda glycerol bestånd, kombinera 0,5 mL mättad vätska kultur med 0,5 mL 50% glycerol. Blanda genom pipettering upp och ner och frysa vid-80 ° C.
Obs: Glycerol bestånd kan förvaras i upp till ett år vid-80 ° C.
3. överuttryck av neurodegenerativa proteinopathy associerade proteiner i S. cerevisiae
- Från fryst glycerol bestånd, åter strimma jäst på histidin, 2% glukos agar selektiva medier plattor och inkubera vid 30 ° C för 2−3 dagar.
- Inokulera enstaka kolonier för varje överuttryck modeller och kontroll i 5 mL histidin selektiva flytande media kompletteras med 2% raffinos. Växa med skakningar (200 rpm) vid 30 ° C över natten.
- Växa 100 mL flytande kultur för varje överuttryck modeller och kontroller (FUS, TDP-43 och vector kontroll; a-synuclein och vector kontroll).
- Bereda 100 mL kultur i selektiva media kompletteras med 2% galaktos.
- Mät den OD600 övernattande kulturer och beräkna mängden övernattning kultur behövs för att återge överuttryck kulturer på en start OD600 på 0,3. Vanligtvis når över natten kulturer en OD600 av 0.9−10, som kräver ca 5 mL övernattning kultur att starta 100 mL färsk kultur.
- Inducera protein överuttryck av växande jäst på galaktos media (se steg 3.3.1) för 5 h (FUS och TDP-43) eller 8 h (a-synuclein) med skakningar vid 30 ° C.
- Mäta OD600 av varje kultur i slutet av perioden induktion. Standardisera alla blodkroppar till lägsta OD600 värde. Skörda kultur i 50 mL rör genom centrifugering vid 850 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
Obs: Om de OD600 mätvärdena i slutet av induktion är 0.654 och 0,984, respektive, för a-synuclein kultur 100 mL och 100 mL kontroll kultur, skörda 95 mL a-synuclein kulturen och 67,1 mL kontroll kultur. - Återsuspendera pelleten i 1 mL steril dH2O för varje 10 mL av kultur som odlas. Split pellets jämnt av alikvotering 1 mL cell resuspension i mikrocentrifugrör. Exempelvis om du börjar med 100 mL kultur, återsuspendera pelleten i 10 mL sterilt dH2O och dela den i 10 mikrocentrifugrör.
- Centrifugera vid 850 x g i 5 minuter vid 4 ° C och tar bort supernatanten. Snapin frysa cell pellets i flytande kväve och förvaras vid-80 ° C.
Obs: Cell pellets kan lagras vid-80 ° C i upp till ett år.
4. cell lysis och western blotting för att påvisa Histon post-translationella modifieringar
- Cellys
- Tina jäst cell pellets på is och återsuspendera cell pellets i 100 µL av dH2O.
- Tillsätt 300 µL 0.2 M NaOH och 20 μl av 2-merkaptoetanol till cell resuspension. Återsuspendera genom pipettering upp och ner.
- Inkubera cellerna på is i 10 min och sedan Centrifugera 3,200 x g på en bordsskiva centrifug för 30 s vid RT. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 100 µL av 1 x laddar färgämne och koka i 10 min på ett värmeblock.
Obs: Receptet för 6 x laddar färgämne kan hittas i Tabellen för material.
- Sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores och membran överför
- Förbereda gel kammaren genom att placera två geler i en gel innehavaren och fyllning inre kammaren till toppen med kör buffert och fylla varumärket två gel linje utanför kammaren.
- Ladda 15 µL prov från steg 4.1.4 per brunn till en 10-och 12% polyakrylamid gel. För protein stege körfältet, ladda 5 µL.
- Köra gel för ca 45 min på 150 V eller tills lastning dye front når botten av gelen.
- När gelen är igång, förbereda för membran överföring genom blötläggning fiber kuddar (två per gel) i överföring buffert (Tabell av material) och blötläggning polyvinylidene fluor (PVDF) membran i metanol. Skölj membran i överföring buffert före överföring.
Obs: PVDF membranet ska skäras till storleken på gelen och använda en PVDF membran för alla gel som överförs. - Montera, på halvtorr överföring apparater cell, en överföring 'sandwich': från botten elektrod, plats (1) presoaked fiber pad, (2) presoaked och sköljda PVDF membran, (3) gel från steg 4.2.3 och (4) en andra presoaked fiber-pad.
Obs: Se till att undvika luftbubblor i överföringen 'smörgås.' Rulla försiktigt 'sandwich' med serologiska Pipettera att tvinga ut bubblor. När gelen har placerats ovanpå PDVF membranet, se till att inte flytta den. - Utföra protein överföring genom att ställa in power pack till 150 mA för 1 h (för en ' sandwich').
- Påvisande av Histon PTMs med modifiering specifika antikroppar
- Ta bort membranet från överföring apparater. Skölj kort med dH2O.
- Du kan också kontrollera överföring av proteiner med nykockin-S fläcken genom att hälla tillräckligt nykockin-S fläcken för att täcka membran i en liten plastlåda och ruvar på RT med milda skakningar för 30−60 s. bort nykockin-S fläcken och skölj med dH2O tills bakgrunden fläcken försvinner och protein band är synliga för blotta ögat. Fortsätt att skölja med dH2O tills alla fläckar tas bort från membranet.
- Blockera membran genom ruvning blot för 1 h på RT med mild gunga med tris buffrad koksaltlösning (TBS) blockerande buffert (Tabell för material) i en liten färgning box. Använd tillräckligt blockerande buffert för att täcka blot.
Obs: Var noga med att placera membran upprätt i rutan färgning så att sidan membranet som ligga proteiner inte är vänd nedåt. - Inkubera blot i rutan färgning över natten med en Histon modifiering-specifika antikroppar reaktiva mot jäst vid 4 ° C. Späd antikroppen i TBS blockerande buffert enligt tillverkarens specifikationer. Även en ordentlig nukleära lastning kontroll, såsom anti totalt H3 växte upp i en annan värdart från modifiering-specifika antikroppen. Exempelvis om sondering för H3S10ph med en anti-H3S10ph antikropp upp i kanin, använda en anti totalt H3 antikropp upp i musen som lastning kontroll. Upprepa detta för varje blot som behövs.
Obs: Antikropp utspädningar kan återanvändas för sammanlagt tre gånger inom en månad. Lagra dem vid 4 ° C. - Tvätta membranet 4 x i hus-made TBS + 0,1% polysorbat 20 (TBST) för 5 min med gunga på RT.
- Inkubera blot med fluorescerande sekundära antikroppar på tillverkaren angivna utspädningar (åsna anti-kanin 680 och åsna antimus) för 1 h på RT.
Obs: Fluorescerande sekundära antikroppar måste skyddas från ljus under både lagring och användning. Utföra inkubation i mörka plastlådor eller täck med aluminiumfolie. - Tvätta membran 4 x med TBST för 5 min och tvätta med TBS för 5 min medan gunga på RT.
- Visualisera skamfläck på en fluorescerande Western blot imaging system för 2 min. visualisera anti-kanin 680 och antimus 800 sekundära antikroppar i 800 nm och 700 nm kanaler, respektive.
Obs: Replikat bedrivs självständigt från avsnitt 1. Det är nödvändigt att kontrollera att signalen antikroppssvaret är inom intervallet som signal svar är linjär för lämpliga data tolkning i dessa experiment.
- Ta bort membranet från överföring apparater. Skölj kort med dH2O.
5. dataanalys och statistik
- Öppna bild av blot i ett bildprogram (Tabell för material). Förvärva modifiering-specifika band i vector kontroll, TDP-43, och FUS (eller vektor kontroll och a-synuclein) prover, rå densitet genom att rita en rektangel som ramar in bandet i analysläge.
- Upprepa steg 5.1 för lastning kontroll band.
Obs: Det kommer att finnas en lastning styra band och en ändring-specifika band i varje prov. - Beräkna den relativa densiteten av ändring-specifika banden genom att dividera varje band med tätheten av motsvarande band i stickprovet som vektor. Detta normaliserar data till vector kontroll.
- Beräkna den relativa densiteten av lastning kontrollbandet genom att dividera varje band med tätheten av motsvarande lastning kontrollbandet i stickprovet som vektor.
- Beräkna den justera relativa densiteten av varje band genom att dividera den relativa densiteten av ändring-specifika bandet över den relativa densiteten av lastning kontrollbandet för varje prov. Nu kan data visualiseras i histogrammet form.
Obs: För att underlätta bearbetning, steg 5.3 – 5.5 kan göras i ett kalkylblad (Kompletterande fil). - Efter flera oberoende replikat, kör Welch's T-test mellan de två kontrollproverna och den lämpliga proteinopathy modellerar (kontroll kontra FUS, kontroll kontra TDP-43 och kontroll jämfört med a-synuclein) med p = 0,05 som cutoff för betydelse .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera den här metoden, kommer vi utnyttja nyligen publicerade resultat30. WT mänskliga FUS och TDP-43 var i ökad utsträckning för 5 h, medan WT α-synuclein var i ökad utsträckning för 8 h. En ccdB konstruktion användes som en vektor negativ kontroll. Figur 2 visar tillväxt suppression i fasta och flytande kulturer. Jäst var skördas som beskrivs och Western blotting med modifiering-specifika antikroppar utfördes. Anti totalt H3 användes som en lastning kontroll. En betydande minskning av halterna av H3S10ph och H3K14ac framgår i FUS överuttryck modellen (figur 3ab). Det finns betydande ökningar i nivåerna av Acetylering på H4K12 och H4K16 i TDP-43 överuttryck modell som inte observerats i antingen FUS eller α-synuclein överuttryck modell (figur 3 cd). Det finns också betydande minskningar i nivåerna av H3K36me2 och H2BT129ph i α-synuclein överuttryck modellen (figur 3ef).
För att visa att förändringen i Histon PTMs korrelerar med mängden uttryck av neurodegenerativa proteinopathy protein, kan uttrycket av FUS ställas in genom att inducera proteinuttryck i varierande nivåer av galaktos (figur 4a). Galaktos är blandad med sackaros i ändra nyckeltal så att den totala koncentrationen av socker är konstant på 2%, men mängden galaktos ändras vilket resulterar i en rad uttryck proteinnivåer. I S. cerevisiae, metaboliseras sackaros långsamt till glukos, som undertrycker galaktos induktion31. Därav, sackaros aktiveras varken undertrycker galaktos induktion. Den lägre mängden galaktos brukade framkalla FUS överuttryck, observerades mindre toxicitet i både fast och flytande kultur (figur 4bc). Ännu viktigare, lägre nivån på FUS överuttryck, ju mindre storleken på minskningen av H3S10ph nivåer (figur 4 d-f).
Figur 1: Methodoverview för karakterisering av förändringar i Histon post-translationella modifieringar ansluten till neurodegenerativa sjukdomen proteinopathies i jäst modeller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: toxicitet är associerad med överuttryck av neurodegenerativa proteinopathy-relaterade proteiner i jäst modeller. Tubkikare analyser visar cellernas viabilitet för jäst överuttryck vector kontroll, TDP-43, FUS eller α-synuclein i närvaro av glukos (en) eller galaktos (b). (c), tillväxt kurva som illustrerar cellviabilitet i flytande kultur under galaktos induktion. Felstaplarna visar ± standardavvikelsen. n = 3 för varje stam. Replikat följd helt oberoende experiment. Data anpassad med tillstånd från Chen, K. et al. neurodegenerativa sjukdomen Proteinopathies är anslutna till olika Histon Post-translational modifiering landskap. ACS kemiska neurovetenskap. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ändringar i Histon post-translationella modifieringar är associerad med överuttryck av neurodegenerativa proteinopathy-relaterade proteiner i jäst modeller. En FUS proteinopathy modell visar minskade nivåer av (en) H3S10ph, n = 6, och (b), H3K14ac, n = 3. Omvänt, en TDP-43 proteinopathy modell visar förhöjda nivåer av (c), H4K12ac, n = 3, och (d), H4K16ac, n = 6, medan en α-synuclein modell visar minskade nivåer av (e), H3K36me2, n = 3, och (f), H2BT129ph, n = 7. Felstaplarna Visa + standardavvikelse. *, p < 0,05, ***, p < 0,001. Replikat följd helt oberoende experiment. Data anpassad med tillstånd från Chen, K. et al. neurodegenerativa sjukdomen Proteinopathies är anslutna till olika Histon Post-translational modifiering landskap. ACS kemiska neurovetenskap. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: omfattningen av minskningen i H3S10ph nivåer är knuten till nivån för FUS överuttryck. (en) tecknad illustration av användningen av sackaros och galaktos nyckeltal att justera mängden FUS överuttryck. (b) Spotting analyser visar cellernas viabilitet i närvaro av olika nivåer av galaktos. (c), tillväxt kurva i flytande kultur visar cellernas viabilitet i närvaro av olika nivåer av galaktos. Felstaplarna visar ± standardavvikelse. (d) representant immunoblots visar att proteinet FUS nivåer stiga som celler utsätts för ökande andel galaktos. Phosphoglycerate kinase (PGK) användes som en lastning kontroll. (e) representant immunoblots visar motsvarande minskningar i H3S10ph nivåer med ökande andel galaktos. (f), kvantitering histogram över (e). n = 3 för varje villkor. Felstaplar visar + standardavvikelsen för kvantifiering diagram. Replikat följd helt oberoende experiment. Data anpassad med tillstånd från Chen, K. et al. neurodegenerativa sjukdomen Proteinopathies är anslutna till olika Histon Post-translational modifiering landskap. ACS kemiska neurovetenskap. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs här ger ett okomplicerat, ändamålsenligt och kostnadseffektivt sätt att kategorisera genome-wide Histon PTM förändringar korrelerade med neurodegenerativa proteinopathies. Medan det finns andra modeller av ALS och PD, exempelvis in vitro- modeller mänskliga cellinjer och murint32, S. cerevisiae förblir attraktiva på grund av dess användarvänlighet. Till exempel jäst modeller kräver inte användning av en steril huva, inte heller behöver de den intensiva utbildning som går tillsammans med cell kulturarbete. Reagenser för odla jäst är dessutom också mycket mer prisvärd än däggdjursceller kultur leveranser. Jäst-modeller har utnyttjats för att inte bara avslöja domän bestämningsfaktorerna protein aggregering22,23,24,25,26, men också lett till avtäckning genetisk risk faktorer i ALS27, liksom modifierare av protein aggregering toxicitet22. Strykningen av Set3, medlem av den Histon histondeacetylas komplex, har dessutom visat sig minska TDP-43 toxicitet i jäst33. Intressant, är våra fynd i jäst ense med senaste rapporter om Histon modifiering förändringar i både en FUS musmodell och i en mänsklig SH-SY5Y FUS överuttryck modell34,35. Dessutom upptäckte nyligen förändringar i DNA metylering mönster runt nyckel PD gener, såsom SNCA och PARK2, stödja en roll för epigenetik i PD36,37.
Här visar vi att dessa jäst modeller också kan användas att upptäcka hur neurodegenerativa proteinopathies interagerar med epigenomet30. Vi finner att olika förändringar i Histon ändringar är associerade med varje proteinopathy modell. Protokollet beskrivs här tillåter oss att bekräfta tidigare fynd i andra modellsystem. Mest anmärkningsvärt, denna metod har ökat vår förståelse av epigenetisk panorama av neurodegenerativa sjukdomar. Utökad uppsättning ändringar som presenteras här kan avslöja roman Histon författare och Radergummi mål för farmakologisk intervention. Dessa resultat belysa de eventuella bidrag histoner PTMs och epigenetik i patologi ALS, PD och andra neurodegenerativa sjukdomar och kan ge nya vägar för behandling av dessa sjukdomar.
Särskild försiktighet måste vidtas i steg 1.9 och 1.10 när du omvandlar jästen till överuttrycka neurodegenerativa proteinopathies. Specifikt, lägga reagenserna i rätt ordning under steg 1.10 är nödvändiga för att säkerställa hög förvandling effektivitet. Dessutom är det mycket viktigt att plocka kolonin visar de flesta tillväxt dämpningen i galaktos. Också bör vara försiktig vid montering av Western smörgås. Oavsiktlig tillägg av bubblor mellan gel och membran blockerar överföring av protein och tillhandahålla block ställen på blot som kan hindra dataanalys.
En begränsning i detta protokoll är att antikroppar är begränsade till endast bindande och upptäcka en eller två Histon ändringar i taget. Det är också viktigt att ordentligt standardisera prover efter protein överuttryck (steg 3.4−3.6). Helt ta bort alla tillväxt medier kommer att säkerställa att varje cellpelleten vindar upp resuspended i samma volym. Likaså är det viktigt att noggrant alikvotens samma mängd cellsuspension in i mikrocentrifug rören (steg 3,4). Om proverna inte är ordentligt standardiserat, är det svårt att dra några slutsatser från eventuella ändringar på Histon PTM nivåer. Sådana problem skulle bli uppenbart i avvikelser om nivåer för lastning kontroll av Western blot (avsnitt 4.2). För att råda bot på detta kan en SDS-PAGE gel laddad med relevanta prover vara Coomassie målat, möjliggör protein band kvantifiering av proverna (avsnitt 5) och efterföljande re standardisering av prover baserat på mängden protein som finns på varje prov.
Sammanfattningsvis kan detta protokoll för analys av Histon PTM förändringar i samband med överuttryck av proteiner relaterade till neurodegenerativa proteinopathies bara mindre än två veckor, från omvandling till statistiska analyser. Bortsett från att aktivera studiet av proteinopathies som är associerad med neurodegenerativa sjukdomar, kan detta allmänna protokoll användas för att studera Histon PTM förändringar i någon jäst överuttryck modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Royena Tanaz, Huda Yousuf och Sadiqa Taasen för teknisk hjälp. Vi är mycket tacksamma mot Prof. James Shorter för generösa tillhandahållande av reagenser och intellektuella hjälp i utformningen av sackaros trim experiment. Jästen plasmider var en generös gåva från Prof. Aaron Gitler (inklusive 303Gal-FUS; Addgene plasmid # 29614). Brooklyn College och den avancerade Science Research Center (CUNY) samt en NIH NINDS avancerad postdoktorala övergången Award (K22NS09131401) stöds M.P.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
- Beitz, J. M.
- Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
- Poewe, W., et al.
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
- Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
- King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
- Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
- Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
- Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
- Spillantini, M. G., et al.
- Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A.
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
- Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
- Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
- Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
- Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
- Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
- Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
- Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
- Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
- Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).
