Summary
Este protocolo describe procedimientos experimentales para caracterizar el genoma cambios en los niveles de modificaciones post-traduccionales de las histonas (PTM) que ocurre en relación con la sobreexpresión de proteínas relacionadas con la ELA y la enfermedad de Parkinson en Modelos de Saccharomyces cerevisiae . Después de la separación de SDS-PAGE, se detectan niveles PTM de las histonas individuales con anticuerpos específicos a la modificación mediante Western blot.
Abstract
Enfermedades neurodegenerativas, como esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedad de Parkinson (EP), causan la pérdida de cientos de miles de vidas cada año. Se carecen de opciones de tratamiento efectivo capaces de detener la progresión de la enfermedad. A pesar de los esfuerzos extensos de la secuencia en grandes poblaciones de pacientes, la mayoría de los casos de ELA y PD siguen siendo inexplicable por mutaciones genéticas solo. Mecanismos de epigenética, como la modificación poste-de translación de proteínas histonas, pueden estar involucrados en la progresión y la etiología de la enfermedad neurodegenerativa y conducen a nuevas dianas de intervención farmacéutica. Mamíferos modelos in vivo e in vitro de ALS y PD son costosos y a menudo requieren protocolos experimentales prolongados y laboriosos. Aquí describiremos un enfoque práctico, rápido y rentable para determinar alteraciones del genoma en los niveles de modificación de las histonas mediante Saccharomyces cerevisiae como sistema modelo. Este protocolo permite investigaciones integrales sobre cambios epigenéticos conectadas proteinopatías neurodegenerativas que corroboran los resultados anteriores en sistemas modelo diferentes al mismo tiempo ampliar significativamente nuestro conocimiento de la epigenoma de enfermedades neurodegenerativas.
Introduction
Las enfermedades neurodegenerativas son devastadoras enfermedades con poca o ninguna opción de tratamiento disponible. Entre estos, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y enfermedad de Parkinson (EP) son particularmente terrible. Aproximadamente el 90% de casos de ALS y PD se considera esporádico, que ocurre sin antecedentes familiares de la enfermedad, mientras que el resto de los casos se presentan en familias y generalmente está ligado a una mutación gen específico1,2. Curiosamente, dos de estas enfermedades se asocian con proteínas mislocalization y agregación3,4,5,6. Por ejemplo, fundido en el sarcoma (FUS) y proteína de unión a ADN TAR 43 (TDP-43) son proteínas de unión de la RNA que mislocalize al citoplasma y agregan en ALS7,8,9,10, 11,12, mientras que α-sinucleína es el componente del principio de agregados proteicos llamados cuerpos de Lewy en PD5,13,14,15.
A pesar de los esfuerzos de asociación amplia del genoma en grandes poblaciones de pacientes, la inmensa mayoría de casos de ALS y PD siendo inexplicable genéticamente. ¿Puede epigenética juega un papel en enfermedades neurodegenerativas? Epigenética comprende cambios en la expresión génica que ocurren sin cambios a subyacente DNA secuencia16. Un principal mecanismo epigenético implica las modificaciones post traslacionales (PTMs) de histona proteínas16. En células eucarióticas, el material genético es tapado en cromatina. La unidad básica de la cromatina es el nucleosoma, que consta de 146 pares de bases del ADN envuelto alrededor de un octámero de histonas, compuesto por cuatro pares de histonas (dos copias de cada de las histonas H2A, H2B, H3 y H4)17. Cada histona tiene una cola N-terminal que sobresale fuera del nucleosoma y puede ser modificada por la adición de grupos químicos diversos, generalmente en residuos de lisina y arginina18. Estos MPa es dinámicas, que significa que se pueden fácilmente agregar y quitaron e incluyen grupos como acetilación, metilación y fosforilación. PTMs controlan la accesibilidad de la DNA a la maquinaria transcripcional y así ayudar a control gene expresión18. Por ejemplo, la acetilación de histonas reduce la fuerza de la interacción electrostática entre la proteína histona muy básico y la columna vertebral carga negativa de ADN, permitiendo que los genes embalados por acetilado histonas sea más accesible y altamente expresó el19. Más recientemente, la notable especificidad biológica del PTMs histonas particulares y sus combinaciones ha conducido a la histona código hipótesis20,21 en que las proteínas que escribir, borrar y leer PTMs histonas actúan en concierto para modulan la expresión génica.
La levadura es un modelo muy útil para el estudio de neurodegeneración. Lo importante, se conservan muchos caminos celulares neuronales de la levadura a los seres humanos22,23,24. Levadura recapitular fenotipos citotoxicidad e inclusiones de proteína a sobreexpresión de FUS, TDP-43 o α-sinucleína22,23,24,25,26. De hecho, se han utilizado modelos de Saccharomyces cerevisiae de la ELA para identificar factores de riesgo genético en los seres humanos27. Además, la levadura overexpressing α-sinucleína humana permitida la caracterización de la red Rsp5 como objetivo druggable mejorar la toxicidad de la α-sinucleína en neuronas28,29.
Aquí, describimos un protocolo explotación de Saccharomyces cerevisiae para detectar genoma histona PTM cambios neurodegenerativos proteinopatías (figura 1). El uso de S. cerevisiae es muy atractivo debido a su facilidad de uso, bajo costo y la velocidad en comparación con otros modelos in vitro y animales de neurodegeneración. Aprovechamiento previamente desarrollado ELA y PD modelos22,23,25,26, hemos overexpressed humanos FUS, TDP-43 y α-sinucleína en levadura y descubierto distintos histona PTM cambios que ocurren en conexión con cada proteinopathy30. El protocolo que se describe aquí puede completarse en menos de dos semanas de la transformación para análisis de datos.
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Protocol
1. transformación de S. cerevisiae con neurodegenerativas proteína asociada a la proteinopathy construcciones
- Crecer la levadura 303 tipo salvaje (WT) en caldo de dextrosa (YPD) de peptona de extracto de levadura durante la noche con agitación (200 rpm) a 30 ° C.
- Después 12−16 h de crecimiento, diluir la levadura a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0.25 con YPD. Como 10 mL de cultivos líquidos de levadura se necesitarán para cada transformación, preparar 50 mL de cultivos líquidos de levadura para cinco transformaciones correspondientes a FUS, TDP-43, a-sinucleína y vector único (ccdB) construcciones, así como una transformación del control negativo sin ADN.
- Crecer levaduras con agitación a 30 ° C hasta que se alcance un OD600 entre 0,60 y 0,80. Esto generalmente toma h 4−6.
- Treinta minutos antes de que el crecimiento de la levadura es completa, alinear plásmido construcciones.
Nota: Las construcciones de plásmido utilizadas aquí deben integrarse directamente en el genoma, y por lo tanto, la linealización es requerida antes de transformación.- Calcular el volumen de stock de plásmido que asciende a 1 μg. restar este volumen de 44 μL para calcular la cantidad de nucleasa libre H2O es necesario.
- Añadir nucleasa libre H2O, 5 μl de buffer de enzima de la restricción de x 10 (Tabla de materiales), 1 μl de enzima de la restricción de NheI (Tabla de materiales) y la cantidad apropiada de plásmido (calculado en paso 1.4.1) a un tubo de microcentrífuga. Mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo e incubar a 37 ° C durante 15 minutos. El plásmido es transformación lineal y lista para.
- Después de levadura cultura alcanza una OD600 de 0.6-0.8, cosecha de células en un tubo cónico de 50 mL y un spin abajo a 850 x g a 4 ° C por 3 minutos descartar sobrenadante.
- Lavar el precipitado de células en 10 mL de H2O y centrifugue a 850 x g a 4 ° C durante 3 minutos descartar sobrenadante estéril. Repetir 3 veces para un total de cuatro lavados.
- Al comienzo del tercer lavado, descongelar y cocer 10 μl de esperma de salmón DNA por la reacción de transformación de 5 min en un bloque de la calefacción.
- Resuspender el precipitado de células en 100 μl de dH2O por transformación y dividido en un número apropiado de tubos de microcentrífuga. De las cinco transformaciones, Resuspender el precipitado en 500 μl de dH2O y dividir uniformemente en cinco tubos de microcentrífuga separado.
- Centrifugar durante 5 min a 850 x g a temperatura ambiente (RT) y retire toda el agua restante.
- En el siguiente orden, agregar 50 μl de estéril de H2O, 240 μl de 50% de polietilenglicol (PEG), 36 μl de 1 M LiAc, 10 μl de DNA de esperma de salmón, 20 μl de ADN de plásmido lineal (o agua libre de nucleasa para ninguna transformación de control de ADN). Mezclar bien después de cada adición y vortex brevemente después de que se han agregado todos los componentes de transformación.
- Incubar las reacciones de transformación a 42 ° C por 20 min.
Nota: Llevar a cabo la incubación en baño de agua para control de temperatura más constante. - Centrifugue a 470 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos descartar sobrenadante y resuspender cada precipitado de células en 200 μL de estéril de H2O.
- Placa de suspensión de levadura en las placas de medios selectivos y con granos de balanceo o esparcidor. Incubar las placas durante 2−3 días a 30 ° C.
Nota: Define sintético (SD)-sus placas se utilizan para la plásmidos descrita aquí.
2. examina la supresión del crecimiento de colonias y almacenamiento en las poblaciones de glicerol
- Inocular las colonias individuales de las placas de la transformación en 5 mL de medio selectivo suplementado con 2% rafinosa. Crecer en un agitador a 30 ° C durante la noche. Seleccione por lo menos 12 colonias por transformación.
Nota: Se espera que hay colonias en la placa de control de transformación "no ADN". - Esterilizar el pin-frogger con etanol, seguida de llamas.
- Para cada cultivo, alícuota 100 μl de suspensión celular saturado en la primera fila de una placa de 96 pocillos. Añadir 200 μL de estéril de H2O en todos los pocillos de las columnas adyacentes bien. Para diluciones seriadas de 1:5, añada 50 μl de la primera columna a la columna adyacente detrás con pipeta multicanal. Mezclar bien mediante pipeteo. Luego añada 50 μl de la segunda columna a la tercera columna y mezclar mediante pipeteo. Repetir este proceso para el resto de la placa.
- Levadura de la placa colocando el frogger en una placa de 96 pocillos y luego sellado presionando suavemente y uniformemente sobre placas de medios selectivos con y sin galactosa. Incubar a 30 ° C durante 2−3 días.
Nota: Las placas SD-su y su SGal se utilizan para la plásmidos descrita aquí. - Para FUS, TDP-43 y a-sinucleína transformaciones, identificar la Colonia mostrando la mayoría supresión de crecimiento en presencia de galactosa. Seleccione esta colonia de la placa de su SD e inocular en 10 mL de medio selectivo suplementado con 2% rafinosa para el crecimiento durante la noche. Para el control de vectores, escoge una colonia no mostrando ninguna supresión de crecimiento en presencia de galactosa.
- Para preparar las acciones de glicerol, combinan 0,5 mL del cultivo líquido saturado con 0,5 mL de glicerol al 50%. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo y congelar a-80 ° C.
Nota: Las existencias de glicerol pueden conservarse hasta un año a-80 ° C.
3. la sobreexpresión de proteinopathy neurodegenerativas asociadas proteínas en S. cerevisiae
- De las existencias de glicerol helados, levadura vuelve a raya en histidina, medios selectivos de agar de glucosa de 2% placas e incuban a 30 ° C 2−3 días.
- Inocular las colonias individuales de cada uno de los modelos de sobreexpresión y control en 5 mL de medio líquido selectivo histidina suplementado con 2% rafinosa. Crecer con agitación (200 rpm) a 30 ° C durante la noche.
- Crecen 100 mL del cultivo líquido para cada uno de los modelos de sobreexpresión y controles (FUS, TDP-43 y vector control; a-sinucleína y vector control).
- Preparar 100 mL de cultivo en medios selectivos suplementados con 2% de galactosa.
- Mida OD600 de culturas durante la noche y calcular la cantidad de la cultura necesaria para representar las culturas de la sobreexpresión de una partida de OD600 de 0,3. Por lo general, las culturas durante la noche alcanzará un OD600 de 0.9−10, que requieren unos 5 mL de cultivo durante la noche para empezar a 100 mL de cultivo fresco.
- Inducir la sobreexpresión de la proteína por cultivo de levadura en medios de galactosa (ver paso 3.3.1) 5 h (FUS y TDP-43) o 8 h (a-sinucleína) con agitación a 30 ° C.
- Mida OD600 de cada cultura en el final del período de inducción. Estandarizar todos los recuentos de células para el valor más bajo de600 OD. Cosechar el cultivo en tubos de 50 mL por centrifugación a 850 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
Nota: Si los valores de OD600 medidos al final de la inducción son 0.654 y 0.984, respectivamente, por 100 de la cultura de al-sinucleína y 100 mL de cultivo control, cosecha 95 mL de la cultura de a-sinucleína y mL 67,1 de la cultura de control. - Resuspender el precipitado en 1 mL de estéril dH2O para cada 10 mL de cultivo crecido. Pellets de Split uniformemente por tomar 1 mL de resuspensión de células en los tubos de microcentrífuga. Por ejemplo, si a partir de 100 mL de la cultura, Resuspender el precipitado en 10 mL de estéril dH2O y dividirlo en 10 tubos de microcentrífuga.
- Centrifugue a 850 x g durante 5 min a 4 ° C, luego retire el sobrenadante. Snap freeze pellets de células en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C.
Nota: Gránulos de la célula pueden almacenarse a-80 ° C hasta por un año.
4. la célula lysis y western blot para detectar modificaciones post-traduccionales de las histonas
- Lisis de la célula
- Descongele la pelotillas de células de levadura en el hielo y resuspender el pellet celular en 100 μl de dH2O.
- A la resuspensión de células, añadir 300 μL de NaOH M 0.2 y 20 μl de 2-Mercaptoetanol. Resuspender mediante pipeteo arriba y abajo.
- Incubar las células en hielo durante 10 minutos y luego centrifugar a 3.200 x g en una centrífuga de mesa para 30 s en RT. descartar sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en 100 μl de 1 x carga de tinte y hervir durante 10 minutos en un bloque de la calefacción.
Nota: La receta para 6 x carga colorante puede encontrarse en la Tabla de materiales.
- Sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis y membrana de transferencia
- Preparar el gel cámara colocando dos geles en un gel de soporte y relleno cámara interior a la cima con funcionamiento tampón y llenado de la cámara exterior a la marca de línea de dos geles.
- Carga 15 μl de la muestra del paso 4.1.4 por pocillo en un gel de poliacrilamida al de 12% 10-bien. Por el carril de la escalera de proteína, carga 5 μl.
- Ejecutar gel para aproximadamente 45 minutos a 150 V, o hasta que la carga frontal de tinte alcanza la parte inferior del gel.
- Mientras el gel está funcionando, preparar para la transferencia de membrana empapando almohadillas de fibra (dos por gel) en tampón de transferencia (Tabla de materiales) y remojo membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro en metanol. Enjuagar la membrana en tampón de transferencia antes de la transferencia.
Nota: La membrana PVDF debe cortarse al tamaño del gel y utilizar una membrana PVDF para cada gel se transfiere. - Montar en célula de aparatos de transferencia semiseco, una transferencia 'sandwich': del electrodo inferior, coloque fibras (1) presoaked, membrana PVDF (2) presoaked y enjuagada, (3) gel de paso 4.2.3 y (4) una segunda almohadilla de fibra presoaked.
Nota: Asegúrese de que evitar burbujas de aire en la transferencia 'sandwich'. Suavemente el rodillo 'sandwich' con pipeta serológica para eliminar burbujas. Una vez que el gel se ha colocado encima de la membrana PDVF, asegúrese de no moverlo. - Efectuar transferencia de proteínas mediante el establecimiento de alimentación a 150 mA durante 1 hora (para un ' sandwich').
- Detección de la histona PTMs con anticuerpos específicos de modificación
- Quitar la membrana de aparatos de transferencia. Enjuague brevemente con dH2O.
- Opcionalmente, verificar a transferencia de las proteínas con colorante Ponceau S vertiendo suficiente colorante Ponceau S para cubrir la membrana en una pequeña caja de plástico e incubando a temperatura ambiente con agitación suave para 30−60 s. Ponceau-S quitar la mancha y enjuague con dH2O hasta que la mancha de fondo desaparece y bandas de proteína son visibles a simple vista. Continúan enjuague con dH2O hasta que se quita toda mancha de la membrana.
- Bloquear la membrana incubando blot durante 1 h a temperatura ambiente con el suave balanceo con tampón salino (TBS) bloqueo tampón tris (Tabla de materiales) en una pequeña caja de tinción. Use suficiente solución amortiguadora de bloqueo para cubrir blot.
Nota: Tenga cuidado de colocar membrana vertical en la caja de tinción para que el lado de la membrana en que mentira de proteínas no es hacia abajo. - Incubar la mancha blanca /negra en la caja de tinción durante la noche con un anticuerpo de específico de modificación de histonas reactiva hacia levadura a 4 ° C. Diluir el anticuerpo en solución amortiguadora de bloqueo TBS según especificaciones del fabricante. También incluyen un control de la carga nuclear adecuada, como anti-total H3 en una especie de host diferente de los anticuerpos específicos de modificación. Por ejemplo, si sondeo para H3S10ph con un anticuerpo anti-H3S10ph en el conejo, utiliza un anticuerpo de anti-total H3 en ratón como control de carga. Repita esto para cada mancha según sea necesario.
Nota: Las diluciones del anticuerpo pueden ser reutilizadas para un total de tres veces dentro de un mes. Almacenar a 4 ° C. - Lavar la membrana 4 x en casa-hecha TBS + 0.1% polisorbato 20 (TBST) por 5 min con mecedora a TA.
- Incubar blot con anticuerpos fluorescentes secundarios en diluciones especificados por el fabricante (burro anti-conejo 680 y anti-ratón burro) por 1 h a TA.
Nota: Fluorescentes anticuerpos secundarios deben ser protegidos de la luz durante el almacenamiento y uso. Llevar a cabo la incubación en cajas de plástico oscuros o cubrir con papel de aluminio. - Lavar la membrana 4 x con TBST por 5 min y lavado con TBS durante 5 minutos mientras balanceo a TA.
- Visualize borrón en un Western blot fluorescente sistema para 2 minutos de imagen visualizar el anti-conejo 680 y secundaria anticuerpos anti-ratón 800 en el 800 nm y los 700 nm canales, respectivamente.
Nota: Se replica independientemente se realizan a partir de la sección 1. Es necesario verificar que la respuesta del anticuerpo de señal está dentro del rango sobre el cual la respuesta de la señal es lineal para la interpretación de los datos adecuados en estos experimentos.
- Quitar la membrana de aparatos de transferencia. Enjuague brevemente con dH2O.
5. estadísticas y análisis de datos
- Abre la imagen de la mancha blanca /negra en un software de proyección de imagen (Tabla de materiales). Adquirir la materia prima densidad de muestras de bandas específicas de modificación en el vector control, TDP-43 y FUS (o control de vectores y a-sinucleína), dibujando un rectángulo que enmarca la banda en el modo de análisis.
- Repita el paso 5.1 para bandas de control de carga.
Nota: Habrá una carga control de bandas y una modificación específica en cada muestra. - Calcular la densidad relativa de las bandas específicas de modificación dividiendo cada banda por la densidad de la banda correspondiente en la muestra de control de vectores. Esto normaliza los datos para el control de vectores.
- Calcular la densidad relativa de la carga banda control dividiendo cada banda por la densidad de la carga correspondiente banda control en la muestra de control de vectores.
- Calcular la densidad relativa ajustada de cada banda dividiendo la densidad relativa de la banda específica de modificación sobre la densidad relativa de la carga de la banda de control para cada muestra. Ahora, los datos pueden visualizarse en forma de histograma.
Nota: Para facilitar el proceso, pasos 5.3 – 5.5 pueden hacerse en una hoja de cálculo (Archivo suplementario). - Después de múltiples repeticiones independientes, T-pruebas de ejecución de Welch entre las muestras de control de dos y el proteinopathy apropiado del modelo (control versus FUS, control versus TDP-43 y control frente a-sinucleína) con p = 0.05 como el límite de significación .
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Representative Results
Para ilustrar este método, tomaremos ventaja de resultados recientemente publicados30. FUS humano WT y TDP-43 se sobreexpresa de 5 horas, mientras que WT α-sinucleína se sobreexpresa de 8 h. Una construcción ccdB fue utilizada como un control negativo de vector. La figura 2 muestra la supresión del crecimiento en cultivos sólidos y líquidos. La levadura fue cosechada como se describe y Western Blot con anticuerpos específicos de modificación fue realizado. Anti-total H3 fue utilizado como un control de carga. Una disminución significativa en los niveles de H3S10ph y H3K14ac es evidente en el modelo de la sobreexpresión de FUS (figura 3ab). Hay un aumento significativo en los niveles de acetilación en H4K12 y H4K16 en el modelo de la sobreexpresión de TDP-43 que no se observan tanto en el FUS o modelo de sobreexpresión de α-sinucleína (figura 3 cd). También hay una disminución significativa en los niveles de H3K36me2 y H2BT129ph en el modelo de la sobreexpresión de la α-sinucleína (figura 3ef).
Para mostrar que el cambio en el PTMs histonas se correlaciona con la cantidad de expresión de la proteína de proteinopathy neurodegenerativas, la expresión de FUS puede ajustarse mediante la inducción de expresión de proteínas en diferentes niveles de galactosa (figura 4a). Galactosa se mezcla con la sacarosa en el cambio de proporciones tales que la concentración total de azúcar es constante en el 2%, pero la cantidad de galactosa se modifica dando lugar a una gama de niveles de expresión de la proteína. En S. cerevisiae, sacarosa es lentamente metabolizada a glucosa, que suprime la galactosa inducción31. Por lo tanto, sacarosa ni activa ni suprime la inducción de la galactosa. Cuanto menor sea la cantidad de galactosa se utiliza para inducir la sobreexpresión de FUS, la menos toxicidad fue observada en cultivo sólido y líquido (Figura 4bc). Lo importante, el más bajo el nivel de sobre-expresión de FUS, cuanto menor sea la magnitud de la reducción en los niveles de H3S10ph (figura 4 d-f).
Figura 1: Methodoverview para la caracterización de los cambios en modificaciones post-traduccionales de las histonas conectadas a proteinopatías enfermedad de neurodegenerative en modelos levadura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: toxicidad asociada a la sobreexpresión de proteínas relacionadas con la proteinopathy de neurodegenerativas en modelos de levadura. Ensayos de manchado muestran viabilidad de las células de levadura overexpressing el control de vectores, TDP-43, FUS o α-sinucleína en presencia de glucosa (una) o la galactosa (b). (c) crecimiento curva que ilustra la viabilidad de las células en cultivo líquido bajo inducción de galactosa. Barras de error indican la desviación estándar de ±. n = 3 para cada cepa. Se replica el resultado de experimentos totalmente independientes. Adaptado con permiso de Chen, K. et al. neurodegenerativas enfermedad proteinopatías se conectan a distintas histonas Post-translational paisajes de modificación de datos. Neurociencia ACS Chemical. 9 (4) 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: cambios en modificaciones post-traduccionales de la histona asociadas a la sobreexpresión de proteínas relacionadas con la proteinopathy de neurodegenerativas en modelos de levadura. Un modelo de proteinopathy FUS muestra disminución en los niveles de (un) H3S10ph, n = 6 y (b) H3K14ac, n = 3. Por el contrario, un modelo de proteinopathy de TDP-43 muestra aumento de los niveles de (c) H4K12ac, n = 3 y (d) H4K16ac, n = 6, mientras que un modelo α-sinucleína muestra disminución en los niveles de (e) H3K36me2, n = 3 y (f) H2BT129ph, n = 7. Mostrar barras de error + desviación estándar. *, p < 0.05, ***, p < 0.001. Se replica el resultado de experimentos totalmente independientes. Adaptado con permiso de Chen, K. et al. neurodegenerativas enfermedad proteinopatías se conectan a distintas histonas Post-translational paisajes de modificación de datos. Neurociencia ACS Chemical. 9 (4) 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: grado de disminución en los niveles de H3S10ph está ligada al nivel de sobre-expresión de FUS. (un) historieta ilustración del uso de sacarosa y galactosa para ajustar la cantidad de sobreexpresión de FUS. (b) ensayos de manchas que muestran la viabilidad de las células en presencia de diferentes niveles de galactosa. curva (c) crecimiento en cultivo líquido mostrando la viabilidad de las células en presencia de diferentes niveles de galactosa. Barras de error indican ± desviación estándar. (d) representante immunoblots mostrando que la proteína FUS niveles de aumento, las células se exponen a aumentar ratios de galactosa. Fosfoglicerato quinasa (PGK) fue utilizado como un control de carga. (e) representante immunoblots mostrando disminuciones correspondientes en los niveles de H3S10ph con el aumento de ratios de la galactosa. Histograma (f) cuantificación de (e). n = 3 para cada condición. Barras de error indican + desviación estándar de la tabla de cuantificación. Se replica el resultado de experimentos totalmente independientes. Adaptado con permiso de Chen, K. et al. neurodegenerativas enfermedad proteinopatías se conectan a distintas histonas Post-translational paisajes de modificación de datos. Neurociencia ACS Chemical. 9 (4) 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito aquí proporciona una manera sencilla, conveniente y rentable de la categorización de cambios PTM genoma histona con neurodegenerativas proteinopatías. Mientras que hay otros modelos de ALS y PD, como en vitro líneas celulares humanas y murinas modelos32, restos de S. cerevisiae atractivos debido a su facilidad de uso. Por ejemplo, modelos de levadura no requieren el uso de una capucha estéril, ni necesitan el intensivo entrenamiento va junto con el trabajo de la cultura de célula. Además, los reactivos para el cultivo de levaduras también son mucho más asequibles que las fuentes de la cultura de células de mamífero. Modelos de levadura han explotado no sólo revelan los determinantes del dominio de la proteína agregación22,23,24,25,26, pero también han llevado a descubrir riesgo genético factores en ALS27, así como modificadores de la agregación de proteína toxicidad22. Además, la supresión de Set3, miembro de la deacetilasa de histonas complejo, se ha encontrado para reducir la toxicidad de la TDP-43 en levadura33. Curiosamente, nuestros resultados en levaduras están de acuerdo con informes recientes sobre alteraciones de la modificación de las histonas en tanto un modelo de ratón FUS y en un humano SH-SY5Y FUS sobreexpresión modelo34,35. Además, recientemente se descubrieron alteraciones en los patrones de metilación de ADN en genes clave de la PD, como SNCA y PARK2, apoyan un papel de la epigenética en el PD36,37.
A continuación, os mostramos estos modelos de levadura pueden utilizarse también para descubrir cómo neurodegenerativas proteinopatías interactúan con el epigenoma30. Encontramos que diferentes cambios en modificaciones de las histonas se asocian con cada modelo de proteinopathy. El protocolo aquí descrito nos permite corroborar los resultados anteriores en otros sistemas del modelo. Lo más notable posible, este método ha aumentado nuestro entendimiento del panorama epigenómicos de enfermedades neurodegenerativas. El conjunto ampliado de modificaciones presentadas aquí podría descubrir objetivos de escritor y borrador de histonas novela para intervención farmacológica. Estos resultados ponen de relieve la contribución posible de las histonas PTMs y epigenética en la patología de ALS, EP y otras enfermedades neurodegenerativas y pueden proporcionar nuevas vías para el tratamiento de estas enfermedades.
Especial cuidado debe tenerse en pasos 1.9 y 1.10 al transformar la levadura para sobreexpresar neurodegenerativas proteinopatías. Específicamente, añadiendo los reactivos en el orden correcto durante el paso 1.10 es necesario para asegurar la eficiencia de transformación alta. Además, es muy importante elegir la Colonia mostrando la mayoría supresión de crecimiento en galactosa. También se debe tener cuidado al montar el sándwich Western. Adición accidental de burbujas entre el gel y la membrana se bloquea la transferencia de la proteína y proporcionan puntos de bloqueo en la mancha que puede dificultar el análisis de datos.
Una limitación de este protocolo es que los anticuerpos están restringidos a sólo vinculante y detectar modificaciones de las histonas de uno o dos a la vez. También es fundamental estandarizar correctamente las muestras después de sobreexpresión de la proteína (medidas 3.4−3.6). Quitar completamente todo crecimiento medios asegurará que acaba cada pellet de células suspendidas en el mismo volumen. Asimismo, es importante que cuidadosamente alícuota la misma cantidad de la suspensión celular en los tubos de microcentrífuga (paso 3.4). Si las muestras no están adecuadamente estandarizadas, es difícil extraer conclusiones de los cambios en niveles PTM de las histonas. Un problema pasaría a ser aparente en las discrepancias en los niveles de control de carga de la Western blot (sección 4.2). Para remediar esto, un gel de SDS-PAGE con muestras relevantes puede ser Coomassie tiñe, lo que permite cuantificación de banda de proteína de las muestras (sección 5) y posterior re-normalización de las muestras basadas en la cantidad de proteína presente en cada muestra.
En conclusión, este protocolo permite el análisis de las histonas PTM cambios asociados a la sobreexpresión de proteínas relacionadas con neurodegenerativas proteinopatías en sólo menos de dos semanas, de la transformación a análisis estadístico. Además de permitir el estudio de proteinopatías asociada a enfermedades neurodegenerativas, este protocolo general puede utilizarse para estudiar alteraciones de PTM de las histonas en cualquier modelo de sobreexpresión de levadura.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Royena Tanaz, Huda Yousuf y Sadiqa Taasen ayuda técnica. Estamos muy agradecidos con el Prof. James Shorter por la generosa provisión de reactivos y ayuda intelectual en el diseño de los experimentos de afinación de sacarosa. Plásmidos de la levadura fueron una generosa donación de la Prof. Aaron Gitler (incluyendo 303Gal-FUS; Plásmido Addgene # 29614). Brooklyn College y la avanzada ciencia investigación centro (CUNY) así como un NIH NINDS avanzado Postdoctoral transición Premio (K22NS09131401) admite M.P.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
References
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