Summary
Ce protocole énonce les procédures expérimentales afin de caractériser le génome des changements dans les concentrations des modifications post-traductionnelles des histones (PTM) survenant dans le cadre de la surexpression de protéines associées à la SLA et la maladie de Parkinson dans Modèles de Saccharomyces cerevisiae . Après la séparation de SDS-PAGE, niveaux PTM histones individuelles sont détectés avec une modification spécifique des anticorps par Western Blot.
Abstract
Les maladies neurodégénératives, comme la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de la maladie de Parkinson (MP), entraîner la perte de centaines de milliers de vies chaque année. Options de traitement efficaces capables de stopper la progression de la maladie ne manquent pas. Malgré les efforts de séquençage des grandes populations de patients, la plupart des cas de SLA et la MP demeure inexpliquée par des mutations génétiques. Mécanismes épigénétique, telles que la modification post-traductionnelle des protéines histones, pourraient être impliqués dans la progression et l’étiologie des maladies neurodégénératives et conduisent à de nouvelles cibles d’intervention pharmaceutique. Des modèles mammifères in vivo et in vitro de la SLA et la MP sont coûteuses et nécessitent souvent de longues et laborieuses des protocoles expérimentaux. Ici, nous présentons une méthode pratique, rapide et rentable pour déterminer pangénomique modifications dans les niveaux de modification d’histone utilisant Saccharomyces cerevisiae comme modèle. Ce protocole permet d’enquêtes approfondies dans les changements épigénétiques connectés à proteinopathies neurodégénérative que corroborent les conclusions antérieures dans des systèmes différents modèles tout en élargissant considérablement notre connaissance de la épigénome de maladies neurodégénératives.
Introduction
Les maladies neurodégénératives sont des maladies dévastatrices avec peu ou aucune option de traitement disponible. Parmi ceux-ci, la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie de Parkinson (MP) sont particulièrement horribles. Environ 90 % des cas de SLA et PD sont considérés comme sporadique, qui se produisent sans antécédents familiaux de la maladie, tandis que le reste des cas dans les familles et sont généralement liées à un gène spécifique mutation1,2. Fait intéressant, les deux de ces maladies sont associés à la protéine localisée et agrégation3,4,5,6. Par exemple, fondus dans le sarcome (FUS) et de protéines de liaison à l’ADN de goudron 43 (TDP-43) sont des protéines de liaison ARN qui mislocalize vers le cytoplasme et agrègent l’ALS7,8,9,10, 11,12, tandis que la synucléine α est le composant de principe des agrégats protéiques appelées corps de Lewy dans PD5,13,14,15.
Malgré les efforts d’une vaste association pangénomique dans grandes populations de patients, l’écrasante majorité des cas de SLA et la MP demeure inexpliquée génétiquement. Pouvez épigénétique jouent un rôle dans les maladies neurodégénératives ? Épigénétique compose de changements dans l’expression des gènes qui se produisent sans modifications sous-jacentes de séquence ADN16. Un mécanisme épigénétique principal implique des modifications post traductionnelle (PTMs) d’histone protéines16. Dans les cellules eucaryotes, le matériel génétique est emballer soigneusement dans la chromatine. L’unité de base de la chromatine est le nucléosome, composé de 146 paires de bases d’ADN enroulé autour d’un octamère d’histones, composé de quatre paires d’histones (deux copies chacun des histones H2A, H2B, H3 et H4)17. Chaque histone possède une queue de N-terminal qui fait saillie hors du nucléosome et peut être modifiée par l’addition des fractions chimiques diverses, généralement sur de résidus de lysine et arginine18. Ces Sptm est dynamiques, ce qui signifie qu’ils peuvent être facilement ajoutés et supprimés et comprennent des groupes tels que l’acétylation, méthylation et phosphorylation. Sptm contrôle l’accessibilité de l’ADN à la machinerie transcriptionnelle et aidera ainsi le contrôle gene expression18. Par exemple, l’acétylation des histones réduit la force de l’interaction électrostatique entre la protéine histone très basiques et l’échine d’ADN chargée négativement, ce qui permet des gènes emballés par les histones acétylées soit plus accessible et donc très a19. Plus récemment, la spécificité biologique remarquable de Sptm histone particulière et leurs combinaisons a conduit à l’histone code hypothèse20,21 dans lequel les protéines qui écrire, effacer et lire histone Sptm tous agir de concert pour moduler l’expression des gènes.
La levure est un modèle très utile pour étudier la neurodégénérescence. Important, nombreuses voies cellulaires neuronales sont conservés de la levure à l’homme22,23,24. Levure récapituler les phénotypes de la cytotoxicité et inclusions de protéine sur la surexpression de FUS, TDP-43 ou α-synucléine22,23,24,25,26. En fait, modèles Saccharomyces cerevisiae de la SLA ont été utilisés pour identifier les facteurs de risque génétiques humains27. En outre, levure surexprimant la synucléine α humain autorisé pour la caractérisation du réseau Rsp5 comme cible thérapeutiques pour atténuer la toxicité de la synucléine α en neurones28,29.
Nous décrivons ici un protocole exploitant Saccharomyces cerevisiae pour détecter les modifications PTM pangénomique histone associées neurodégénératives proteinopathies (Figure 1). L’utilisation de S. cerevisiae est très attrayante en raison de sa facilité d’utilisation, faible coût et de la vitesse par rapport aux autres modèles in vitro et animaux de la neurodégénérescence. Harnessing précédemment développé ALS et PD modèles22,23,25,26, nous avons surexprimé humaines FUS, TDP-43 et α-synucléine dans les levures et changements PTM histone distincts non couverts dans connexion avec chaque proteinopathy30. Le protocole que nous décrivons ici peut être complété en moins de deux semaines d’une transformation à l’analyse des données.
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Protocol
1. transformation de S. cerevisiae avec neurodégénératives protéine associée à la proteinopathy des constructions
- Croître de type sauvage (WT) 303 levure dans bouillon de dextrose (DPJ) peptonée levure extrait du jour au lendemain avec agitation (200 tr/min) à 30 ° C.
- Après 12−16 h de croissance, diluer la levure à une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,25 avec la DPJ. Que 10 mL de culture liquide de levures seront nécessaires pour chaque transformation, 50 mL de culture liquide levure préparer cinq transformations correspondant à FUS, TDP-43, a-synucléine et vecteur seul (BCDC) constructions, ainsi que d’une transformation de contrôle négatif sans ADN.
- Cultiver la levure avec agitation à 30 ° C jusqu'à atteindre une OD600 entre 0,60 et 0,80. Cela prend généralement 4−6 h.
- Trente minutes avant la croissance de la levure, linéariser des constructions de plasmide.
Remarque : Les constructions de plasmide utilisées ici doivent être intégrées directement dans le génome, et donc la linéarisation est requise avant transformation.- Calculer le volume du stock de plasmide qui se chiffre à 1 µg. soustraire ce volume de 44 µL pour calculer le montant de nucléase gratuit H2O nécessaire.
- Ajouter nucléase gratuit H2O, 5 µL de tampon de restriction enzyme x 10 (Table des matières), 1 µL d’enzyme de restriction NheI (Table des matières) et la quantité appropriée de plasmide (calculée en étape 1.4.1) dans un tube de microcentrifuge. Bien mélanger en pipettant également de haut en bas et incuber à 37 ° C pendant 15 min. Le plasmide est linéarisée et prête pour la transformation.
- Après la levure la culture atteint une OD600 de 0,6 à 0,8, récolte des cellules dans un tube conique de 50 mL et la centrifuger à 850 g à 4 ° C pendant 3 min. jetez surnageant.
- Laver le culot cellulaire dans 10 mL de stérile H2O et centrifuger à x 850 g à 4 ° C pendant 3 min. jetez surnageant. Répétez 3 fois pour un total de quatre lavages.
- Au début du troisième lavage, décongelez et faites bouillir 10 µL de sperme de saumon ADN par la réaction de transformation pendant 5 min sur un bloc de chauffage.
- Resuspendre le culot dans 100 µL de dH2O par transformation et divisé en nombre de tubes de microcentrifuge approprié. Pour les cinq transformations, resuspendre le culot dans 500 µL de dH2O et réparti en cinq tubes de microcentrifuge distinct.
- Centrifuger pendant 5 min à 850 g à la température ambiante (RT) et enlever toute l’eau restante.
- Dans l’ordre suivant, ajouter 50 µL de stérile H2O, 240 µL de 50 % de polyéthylène glycol (PEG), 36 µL de 1 M LiAc, 10 µL de sperme de saumon ADN, 20 µL de l’ADN de plasmide linéarisé (ou eau libre nucléase pour aucune transformation de contrôle de l’ADN). Bien mélanger après chaque addition et vortex brièvement après que tous les composants de transformation ont été ajoutés.
- Incuber les réactions de transformation à 42 ° C pendant 20 min.
NOTE : Effectuer cette incubation dans un bain d’eau pour le contrôle de la température plus uniforme. - Centrifuger à 470 g RT pendant 5 min. jetez surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 200 µL de stérile H2O.
- Plaque de suspension de levure sur plaques de milieux sélectifs et parsemé de billes de roulement ou épandeur. Incuber les boîtes pendant 2−3 jours à 30 ° C.
NOTE : Synthétique-défini (SD)-ses plaques sont utilisés pour les plasmides décrites ici.
2. suppression de croissance des colonies et le stockage dans les stocks de glycérol d’arpentage
- Ensemencer les colonies individuelles de plaques de transformation dans 5 mL de milieux sélectifs additionnés de 2 % raffinose. Se développer sur un agitateur à 30 ° C durant la nuit. Sélectionnez au moins 12 colonies par transformation.
NOTE : Aucuns colonies ne sont attendus dans la plaque de commande de transformation « aucun ADN ». - Stériliser à broche-frogger avec de l’éthanol, suivie de flammes.
- Pour chaque culture, aliquote 100 µL de suspension cellulaire saturé dans la première ligne d’une plaque de 96 puits. Ajouter 200 µL de stérile H2O dans tous les puits des colonnes adjacentes bien. Pour les dilutions en série 1:5, ajouter 50 µL de la première colonne dans la colonne adjacente derrière avec pipette multicanaux. Bien mélanger en pipettant également. Puis ajouter 50 µL de la deuxième colonne dans la troisième colonne et mélanger en pipettant également. Répétez cette opération pour le reste de la plaque.
- Levure de plaque en plaçant frogger dans une plaque à 96 puits et estampage puis en appuyant légèrement et uniformément sur les plaques de milieux sélectifs avec et sans galactose. Incuber à 30 ° C pendant les jours 2−3.
NOTE : SD-His et Christophe-His plaques sont utilisés pour les plasmides décrites ici. - Pour FUS, TDP-43 et les transformations de l’a-synucléine, identifient la colonie affichant la plupart suppression de la croissance en présence de galactose. Sélectionnez cette colonie dans la plaque de SD-His et ensemencer dans 10 mL de milieu sélectif, additionné de raffinose 2 % de croissance pendant la nuit. Pour la lutte antivectorielle, prélever une colonie n’affichant aucune suppression de la croissance en présence de galactose.
- Pour préparer les stocks de glycérol, combiner 0,5 mL de milieu de culture liquide saturé avec 0,5 mL de glycérol à 50 %. La composition de pipetage de haut en bas et congeler à-80 ° C.
Remarque : Les stocks de glycérol peuvent être conservés pendant un an à-80 ° C.
3. la surexpression de neurodégénératives proteinopathy protéines chez S. cerevisiae associées
- De stocks de glycérol congelée, levure ré-ensemencer sur histidine, milieux sélectifs de 2 % glucose agar plaques et incuber à 30 ° C pendant les jours 2−3.
- Ensemencer les colonies individuelles pour chacun des modèles de surexpression et contrôle dans 5 mL de milieu liquide sélectif de histidine additionné de 2 % raffinose. Grandir avec agitation (200 tr/min) à 30 ° C durant la nuit.
- Croître de 100 mL de milieu de culture liquide pour chacun des modèles de surexpression et des contrôles (FUS, TDP-43 et le vecteur contrôle ; a-synucléine et lutte antivectorielle).
- Préparation de 100 mL de la culture dans des milieux sélectifs additionnés de 2 % de galactose.
- Mesurer l' OD600 des cultures pendant la nuit et calculer le montant d’une nuit ou plus culture nécessaire pour rendre les cultures de surexpression à un départ de l’OD600 de 0,3. En règle générale, les cultures pendant la nuit atteindra une OD de600 0.9−10, nécessitant environ 5 mL d’une culture de commencer à 100 mL de culture fraîche.
- Induire la surexpression de la protéine par la croissance de levure sur les médias de galactose (voir étape 3.3.1) pendant 5 h (FUS et TDP-43) ou 8 h (a-synucléine) avec agitation à 30 ° C.
- Mesurer OD600 de chaque culture à la fin de la période d’induction. Standardiser tous les globules à la plus faible valeur de600 OD. La récolte de la culture en tubes de 50 mL par centrifugation à 850 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
Remarque : Si les valeurs de600 OD mesurées à l’extrémité de l’induction sont 0,654 et 0,984, respectivement, pour 100 mL de la culture a-synucléine et 100 mL de culture témoin, récolter 95 mL de la culture a-synucléine et 67,1 mL de la culture de contrôle. - Resuspendre le culot dans 1 mL de stérile dH2O pour chaque 10 mL de la culture cultivée. Réparti de granulés par aliquotage 1 mL de remise en suspension de cellules dans des tubes de microcentrifuge. Par exemple, si à partir de 100 mL de la culture, resuspendre le culot dans 10 mL de stérile dH2O et divisez-la en 10 tubes de microcentrifuge.
- Centrifuger à 850 x g pendant 5 min à 4 ° C, puis enlever le surnageant. Composant logiciel enfichable congeler boulettes de cellule dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C.
Remarque : Boulettes de cellule peuvent être stockés à-80 ° C pendant un an.
4. cellule lysis et western blot pour détecter les modifications post-traductionnelles des histones
- Lyse cellulaire
- Décongeler les pastilles de cellule de levure sur la glace et resuspendre les granules cellulaires dans 100 µL de dH2O.
- À la remise en suspension cellulaire, ajouter 300 µL de 0,2 M NaOH et 20 µL du 2-mercaptoéthanol. Remettre en suspension par pipetage de haut en bas.
- Incuber les cellules sur la glace pendant 10 min et puis centrifuger à 3 200 g sur une centrifugeuse de table pendant 30 s à RT. Discard surnageant.
- Resuspendre le culot dans 100 µL de 1 x chargement colorant et faites bouillir pendant 10 min sur un bloc de chauffage.
NOTE : La recette pour 6 x chargement colorant se trouvent dans la Table des matières.
- Électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl sulfate et membrane de transfert
- Préparer chambre de gel en plaçant deux gels dans un gel titulaire et remplissage chambre intérieure vers le haut avec le tampon et la chambre de l’extérieur jusqu’au repère de ligne de deux-gel de remplissage.
- Charger 15 µL de l’échantillon de l’étape 4.1.4 / puits dans un gel de polyacrylamide 10 puits 12 %. Pour la voie échelle des protéines, charger 5 µL.
- Exécutez le gel pendant environ 45 min à 150 V, ou jusqu'à ce que le chargement avant teinture atteint le fond du gel.
- Lorsque le gel est en marche, préparer pour le transfert de la membrane en trempant les garnitures de fibre (deux par gel) dans le tampon de transfert (Table des matières) et le trempage de membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) dans le méthanol. Rincer la membrane dans le tampon de transfert avant le transfert.
Remarque : La membrane PVDF doivent être coupés à la taille du gel et utiliser une des membranes PVDF pour chaque gel transféré. - Assembler, sur cellule appareil de transfert semi-sec, un transfert « sandwich » : de l’électrode inférieure, la place coussin fibre (1) pré-trempées, membrane PVDF (2) pré-trempées et rincée, gel (3) de l’étape 4.2.3 et (4) un second tapis de fibre faite tremper.
Remarque : Assurez-vous d’éviter les bulles d’air dans le transfert « sandwich ». Rouler doucement « sandwich » avec pipette sérologique pour forcer les bulles. Une fois que le gel a été placé sur le dessus de la membrane PDVF, veillez à ne pas le déplacer. - Effectuer un transfert de protéines en définissant le bloc d’alimentation à 150 mA pendant 1 h (pour un « sandwich »).
- Détection de l’histone Sptm avec des anticorps spécifiques de modification
- Enlever la membrane de l’appareil de transfert. Rincez brièvement avec dH2O.
- Vous pouvez également vérifier transfert des protéines avec la tache de Ponceau-S en versant assez tache Ponceau-S pour couvrir la membrane dans une petite boîte en plastique et en incubant à RT avec agitant doucement pour 30−60 s. Ponceau-S enlever tache et rincez avec dH2O jusqu'à ce que la tache de fond disparaît et bandes protéiques sont visibles à le œil nu. Continuer à rincer avec dH2O jusqu'à ce que toute tache est supprimé de la membrane.
- Bloquer la membrane en incubant tache pendant 1 h à RT avec bascule douce avec tris buffered saline (TBS) tampon de blocage (Table des matières) dans une petite boîte de coloration. Assez tampon de blocage permet de couvrir la tache.
Remarque : Veillez à placer la membrane verticale dans la boîte de coloration afin que le côté de la membrane sur laquelle se trouvent les protéines n’est pas vers le bas. - Incuber les tache dans la boîte de coloration du jour au lendemain avec un anticorps de modification spécifique des histones réactif vis-à-vis des levures à 4 ° C. Diluer l’anticorps dans un tampon bloquant du SCT conformément aux spécifications du fabricant. Également inclure un contrôle de chargement nucléaire, comme anti-total H3 soulevées dans une espèce d’hôte différent de l’anticorps de modification spécifique. Par exemple, si H3S10ph de détection avec un anticorps anti-H3S10ph chez le lapin, utilisez un anticorps anti-total H3 chez la souris comme un contrôle de chargement. Répétez cette opération pour chaque tache si nécessaire.
Remarque : Les dilutions anticorps peuvent être réutilisées pour un total de trois fois moins d’un mois. Stocker à 4 ° C. - Laver la membrane 4 x en fait maison SCT + 0,1 % polysorbate 20 (TBST) pendant 5 min avec bascule à température ambiante.
- Incuber la tache avec des anticorps fluorescents secondaires à des dilutions de fabricant spécifié (anti-lapin d’âne 680 et âne anti-souris) pendant 1 h à température ambiante.
NOTE : Fluorescent anticorps secondaires doivent être protégés de la lumière pendant le stockage et l’utilisation. Réaliser une incubation dans des boîtes en plastique noirs ou couvrir avec du papier aluminium. - Laver la membrane 4 x avec un mélange TBST pour 5 min et lavage avec le SCT pendant 5 min tout en berçant à température ambiante.
- Visualize tache sur une tache occidentale fluorescente d’imagerie pour 2 min. visualiser l’anti-lapin 680 et anticorps anti-souris 800 du 800 nm et 700 nm canaux, respectivement.
NOTE : Répétitions sont exercées de façon indépendante à partir de la section 1. Il est nécessaire de vérifier que la réponse en anticorps signal est dans la fourchette sur laquelle la réponse de signal est linéaire pour l’interprétation des données appropriées dans ces expériences.
- Enlever la membrane de l’appareil de transfert. Rincez brièvement avec dH2O.
5. statistiques et analyses de données
- Ouvrir une image de tache dans un logiciel d’imagerie (Table des matières). Acquérir la densité brute des échantillons des bandes de modification spécifiques dans le vecteur contrôle, TDP-43 et FUS (ou la lutte antivectorielle et a-synucléine), en dessinant un rectangle qui encadre la bande en mode analyse.
- Répétez l’étape 5.1 pour le chargement des bandes de contrôle.
Remarque : Il y aura un chargement contrôler les bandes et une modification spécifique dans chaque échantillon. - Calculer la densité relative des bandes modification spécifique en divisant chaque bande par la densité de bande correspondant à l’échantillon de contrôle vectoriel. Cela normalise les données pour le contrôle de vecteur.
- Calculer la densité relative du chargement bande témoin en divisant chaque bande par la densité de chargement correspondant bande témoin de l’échantillon de contrôle vectoriel.
- Calculer la densité relative ajustée de chaque bande en divisant la densité relative de la bande de modification spécifiques sur la densité relative du chargement bande de contrôle pour chaque échantillon. Maintenant, les données peuvent être visualisées sous forme d’histogramme.
Remarque : Pour faciliter la transformation, étapes 5,3 à 5,5 peuvent s’effectuer dans une feuille de calcul (Fichier supplémentaire). - Après que plusieurs répétitions indépendantes, tests d’exécution Welch T entre les échantillons de deux témoins et le proteinopathy approprié modèle (contrôle contre FUS, contrôle versus TDP-43 et contrôle par rapport à a-synucléine) avec p = 0,05 sous le seuil de signification .
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Representative Results
Pour illustrer cette méthode, nous profiterons des résultats récemment publiés,30. WT FUS humain et TDP-43 ont été surexprimé pendant 5 h, tandis que WT α-synucléine était surexprimée pendant 8 h. Une construction de base de données a été utilisée comme contrôle négatif vector. La figure 2 illustre la suppression de la croissance dans des cultures liquides et solides. Levure a été récolté comme décrit et éponger occidental avec des anticorps spécifiques modification a été effectuée. Anti-total H3 a été utilisé comme un contrôle de chargement. Une diminution significative des niveaux de H3S10ph et H3K14ac est apparente dans le modèle de la surexpression de FUS (Figure 3 ab). Il y a une augmentation significative des niveaux d’acétylation sur H4K12 et H4K16 dans le modèle de la surexpression de TDP-43 qui ne sont pas respectées dans les deux l’EDF ou le modèle de la surexpression de synucléine α (Figure 3 cd). Il y a également une diminution significative des niveaux de H3K36me2 et H2BT129ph dans le modèle de la surexpression de synucléine α (Figure 3ef).
Pour montrer que le changement à la Sptm histone est corrélée avec la quantité d’expression de la protéine de proteinopathy neurodégénérative, l’expression de FUS peut être affinée en induisant l’expression de la protéine dans des niveaux variables de galactose (Figure 4 a). Galactose est mélangé avec le saccharose en changeant les rapports tels que la concentration totale de sucre est stable à 2 %, mais la quantité de galactose est modifiée résultant dans une gamme de niveaux d’expression de protéine. Chez S. cerevisiae, le saccharose est métabolisé lentement au glucose, qui supprime le galactose induction31. Par conséquent, saccharose ni active ni supprime l’induction de galactose. Plus la quantité de galactose utilisé pour induire la surexpression de FUS, moins la toxicité a été observée dans la culture liquide et solide (Figure 4 bc). Ce qui est important, plus le niveau de la surexpression de FUS, plus l’ampleur de la réduction des niveaux de H3S10ph (Figure 4 d-f).
Figure 1 : Methodoverview pour la caractérisation des modifications aux modifications post-traductionnelles des histones connecté à proteinopathies maladie neurodégénérative dans les modèles de levure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : toxicité associé de surexpression de protéines de neurodégénératives liées à proteinopathy dans les modèles de levure. Détachage des essais démontrent la viabilité des cellules de levure surexprimant la lutte antivectorielle, TDP-43, FUS ou α-synucléine en présence de glucose (un) ou le galactose (b). (c), à la croissance courbe illustrant la viabilité des cellules en culture liquide sous induction de galactose. Barres d’erreur indiquent l’écart ±. n = 3 pour chaque souche. Réplicats résultent d’expériences complètement indépendantes. Données adaptées avec la permission de Chen, K. et al., neurodégénératives maladie Proteinopathies sont connectés aux paysages de Modification distincts Histone Post-translational. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : changements aux modifications post-traductionnelles des histones associées de surexpression de protéines de neurodégénératives liées à proteinopathy dans les modèles de levure. Un modèle de proteinopathy FUS montre une baisse des taux de (un) H3S10ph, n = 6 et (b), H3K14ac, n = 3. À l’inverse, un modèle de proteinopathy TDP-43 montre des niveaux accrus de (c) H4K12ac, n = 3 et (d), H4K16ac, n = 6, alors qu’un modèle de la synucléine α montre une baisse des taux de (e), H3K36me2, n = 3 et (f) H2BT129ph, n = 7. Barres d’erreur montrent + écart-type. *, p < 0,05, ***, p < 0,001. Réplicats résultent d’expériences complètement indépendantes. Données adaptées avec la permission de Chen, K. et al., neurodégénératives maladie Proteinopathies sont connectés aux paysages de Modification distincts Histone Post-translational. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : mesure de la diminution des niveaux de H3S10ph est liée au niveau de la surexpression de FUS. (un) Cartoon illustration de l’utilisation des ratios de sucrose et galactose pour régler le montant de la surexpression de FUS. tests de taches (b) montrant la viabilité cellulaire en présence de différents niveaux de galactose. courbe (c), à la croissance dans un milieu liquide montrant la viabilité cellulaire en présence de différents niveaux de galactose. Barres d’erreur indiquent ± écart-type. (d), représentant par immunoblot montrant que la protéine FUS niveaux montée comme les cellules sont exposées à l’augmentation des ratios de galactose. Phosphoglycérate kinase (PGK) a été utilisé comme un contrôle de chargement. (e), représentant par immunoblot montrant des diminutions correspondantes dans les niveaux de H3S10ph avec l’augmentation des ratios de galactose. histogramme (f), à la quantification de (e). n = 3 pour chaque condition. Barres d’erreur indiquent + écart-type de diagramme de quantification. Réplicats résultent d’expériences complètement indépendantes. Données adaptées avec la permission de Chen, K. et al., neurodégénératives maladie Proteinopathies sont connectés aux paysages de Modification distincts Histone Post-translational. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit ici offre un moyen simple, rapide et rentable de catégoriser les changements PTM pangénomique histone corrélées avec neurodégénératives proteinopathies. Bien qu’il existe d’autres modèles de la SLA et la MP, tel que in vitro murin et des lignées cellulaires humaines modèles32, S. cerevisiae reste attractif en raison de sa facilité d’utilisation. Par exemple, les modèles de levure ne nécessitent pas l’utilisation d’une hotte stérile, ni ont-ils besoin intensif de formation qui accompagne le travail de culture cellulaire. De plus, les réactifs pour la culture de levure sont beaucoup plus abordables que les fournitures de la culture de cellules de mammifères. Modèles de levure ont été exploités pour non seulement révéler les déterminants du domaine de protéine agrégation22,23,24,25,26, mais également ont conduit à découvrir risque génétique facteurs en ALS27, comme modificateurs de protéine agrégation toxicité22. En outre, la suppression de Set3, membre de l’histone désacétylase complexe, s’est avérée pour réduire la toxicité de TDP-43 à33de la levure. Fait intéressant, nos constatations chez les levures sont en accord avec les récents rapports sur les modifications de modification histone dans les deux un modèle de souris FUS et une humaine SH-SY5Y FUS surexpression modèle34,35. En outre, récemment découvert des altérations dans les profils de méthylation de l’ADN autour de gènes clés de PD, tels que SNCA et PARK2, un rôle de soutien pour épigénétique dans PD36,37.
Ici, nous montrons que ces modèles de levure peuvent également servir à découvrir comment neurodégénératives proteinopathies interagissent avec l' épigénome30. Nous constatons que les changements distincts dans modifications d’histone sont associés à chaque modèle de proteinopathy. Le protocole décrit ici permet de corroborer les conclusions antérieures dans d’autres systèmes de modèle. Plus remarquable, cette méthode a accru notre compréhension du panorama épigénomique de maladie neurodégénérative. L’ensemble élargi de modifications présentées ici puisse découvrir histone roman écrivain gomme cibles et d’intervention pharmacologique. Ces résultats mettent en valeur la contribution possible des histones Sptm et épigénétique dans la pathologie de l’ALS, PD et d’autres maladies neurodégénératives et peuvent offrir des nouvelles pour le traitement de ces maladies.
Un soin particulier doit être pris dans les étapes 1.9 et 1.10 lors de la transformation des levures pour surexprimer neurodégénératives proteinopathies. Plus précisément, ajoutant les réactifs dans le bon ordre au cours de l’étape 1.10 est nécessaire pour assurer l’efficacité de transformation élevé. En outre, il est très important de choisir la colonie affichant la suppression la plupart de la croissance en galactose. Il devrait également veiller lors de l’assemblage le sandwich de l’Ouest. Ajout accidentel des bulles entre le gel et la membrane sera bloquer le transfert de la protéine et offrent des spots de bloc sur la tache qui peut nuire à l’analyse des données.
Une des limites du présent protocole est que les anticorps sont limitent à seulement contraignante et détecter les modifications d’histone d’un ou deux à la fois. Il est également crucial normaliser correctement les échantillons après surexpression de protéines (pas 3.4−3.6). Enlever complètement la croissance tous les médias s’assurera que chaque culot cellulaire des vents resuspendues dans le même volume. De même, il est important de soigneusement aliquoter le même montant de suspension cellulaire dans les tubes de microcentrifuge (étape 3.4). Si les échantillons ne sont pas correctement normalisées, il est difficile de tirer des conclusions de toutes les modifications sur les niveaux de PTM histone. Un tel problème deviendrait apparent en écarts sur les niveaux de la commande de chargement de la tache occidentale (section 4.2). Pour remédier à cela, un gel SDS-PAGE, chargé avec des échantillons utiles peut être Coomassie tachée, permettant la quantification bande protéique des échantillons (article 5) et subséquent re-normalisation des échantillons basée sur la quantité de protéines présentes sur chaque échantillon.
En conclusion, ce protocole permet l’analyse des histones PTM changements associés à la surexpression de protéines liées à neurodégénératives proteinopathies en un peu moins de deux semaines, d’une transformation à l’analyse statistique. Mis à part ce qui permet l’étude des proteinopathies associées à des maladies neurodégénératives, ce protocole général permet d’étudier les modifications PTM histone dans n’importe quel modèle de surexpression de levure.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Royena Tanaz, Huda Yousuf et Sadiqa Taasen pour l’aide technique. Nous sommes très reconnaissants à Prof. James Shorter pour la prestation généreuse de réactifs et d’assistance intellectuelle dans la conception d’expériences tuning de saccharose. Plasmides de levure ont été un don généreux de Prof. Aaron Gitler (y compris 303Gal-FUS ; Addgene plasmidique 29614 #). Brooklyn College et de l’Advanced Science Research Center (CUNY), mais aussi un NIH NINDS Advanced Transition bourse postdoctorale (K22NS09131401) prise en charge M.P.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
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